萬婕等

摘 要 為明確紅棕象甲[Rhynchophorous ferrugineus（Oliver）]高齡幼蟲冷馴化試驗的有效降溫速率范圍，初步了解其體內(nèi)抗寒物質(zhì)應(yīng)對不同降溫條件下生理指標(biāo)的變化。實驗設(shè)定3種不同降溫速率（1.00、0.10、0.05 ℃/min），①從（25±0.5）℃分別降至5 ℃進行冷馴化，后置于檢測溫度（-8 ℃）下處理2 h觀察并統(tǒng)計存活率；②測定不同降溫速率處理后試蟲體內(nèi)相關(guān)生理指標(biāo)的變化，兩組實驗均設(shè)置空白對照組。結(jié)果表明：紅棕象甲高齡幼蟲冷馴化有效降溫速率范圍在1.00～0.10 ℃/min之間，最佳降溫速率為0.10 ℃/min；試蟲應(yīng)對不同降溫速率時，體內(nèi)脂肪、甘油、總糖及血淋巴蛋白質(zhì)含量均較空白組顯著升高（p<0.05），而水含量較空白組顯著降低（p<0.05）。

關(guān)鍵詞 紅棕象甲；高齡幼蟲；降溫速率；冷馴化

中圖分類號 Q965 文獻標(biāo)識碼 A

Definitude of Effective Cooling Rates of Cold Acclimation

for Old larvae of Red Palm Weevil Rhynchophorous

ferrugineus（Oliver）

WAN Jie1，2， YAN Wei2 *， LIU Li2， LONG Xuefeng2， LI Chaoxu2， QIN Weiquan2 *

1 Environment and Plant Protection Department， Hainan University， Haikou， Hainan 570228， China

2 Coconut Research Institute， Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences， Wenchang， Hainan 571339， China

Abstract To clarify the effective cooling rates used in the cold acclimation process and preliminarily understand changes of physiological indictors of old larva of Red Palm Weevil Rhynchophorous ferrugineus（Oliver） RPW exposed to different cooling condition. We set three kinds of cooling rates（1.00， 0.10， 0.05 ℃/min）and ①cooled the subjects from 25 ℃ to 5 ℃， respectively， then transferred to -8 ℃ for 2 h and recorded the survival； ②Determined the correspondingly physiological changes related to the insect cold hardness after the subjects were experienced the cold hardening process with different cooling rates. Both experiments were compared with the relative control groups. The results showed that the optimal cooling rate was 0.10 ℃/min for the subjects； Besides， the content of lipid， glycerol， total sugar， and proteins from hemolymph were significantly higher than those of control groups， whereas the content of water was significantly lower than that of control groups.

Key words Rhynchophorous ferrugineus（Oliver）； Old larvae； Cooling rate； Cold acclimation

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2014.06.026

昆蟲在經(jīng)歷脅迫低溫之上一個較溫和的低溫后，能夠增強其抵抗低溫冷傷害能力，即耐寒性的現(xiàn)象稱為冷馴化[1-2]。根據(jù)冷馴化時間的長短，又可將其劃分為快速冷馴化與長期冷馴化。相對于長期研究的越冬冷馴化，快速冷馴化現(xiàn)象是近年才發(fā)現(xiàn)并受到了研究者們的普遍重視[3]。降溫速率作為影響昆蟲快速冷馴化重要因子之一最早發(fā)現(xiàn)于家蠅蛹的研究中[4]。大量研究表明較慢的降溫速率能顯著提高昆蟲耐寒性[5]，但得出此結(jié)論的試驗對象多屬雙翅目、鱗翅目或膜翅目等[4-6]。對于鞘翅目昆蟲，國外某些報道中指出：接近環(huán)境降溫的較慢的降溫速率并不能顯著提高昆蟲的耐寒性[7-9]。

紅棕象甲[Rhynchophorous ferrugineus（Oliver）]屬鞘翅目象甲科蛀干性害蟲，主要以幼蟲取食樹干或樹冠心葉危害棕櫚科植物，一旦鉆入樹內(nèi)，通常6～8個月就會造成樹體死亡，在大面積種植棕櫚植物的熱帶地區(qū)頻繁發(fā)生災(zāi)害，被列為我國進出口檢疫性害蟲之一[10]。世代重疊，冬季危害較小，主要以高齡幼蟲、蛹、成蟲越冬[11]。中國廣泛分布于廣東、臺灣、云南、西藏（墨脫）、廣西、浙江、海南等地，現(xiàn)今已擴散至上海（30～32°N）[12]，約同緯度地區(qū)國外的日本鹿兒島（>31°N）也見其報道[13]。紅棕象甲是否存在繼續(xù)向北擴散的趨勢，是目前研究者們希望探討的問題。因此，本實驗設(shè)定3種不同降溫速率，觀察不同降溫速率對紅棕象甲高齡幼蟲低溫冷馴化效果，明確其冷馴化有效降溫速率范圍以及不同降溫速率對試蟲體內(nèi)相應(yīng)理化指標(biāo)的影響等，旨在明確紅棕象甲高齡幼蟲應(yīng)對不同低溫脅迫時其生理上適應(yīng)性調(diào)整，為預(yù)測其向北擴散的潛在區(qū)域并采取相應(yīng)有效的防控措施提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

供試成蟲采于海南省文昌市椰子大觀園，使用信息素誘集方法抓獲后[14]，將成蟲帶回實驗室。雌雄配對后將其置于廣口瓶，瓶內(nèi)懸掛含8%～10% 蜂蜜水的棉球供成蟲取食產(chǎn)卵。然后將廣口瓶置于溫度為（28±0.5）℃，相對濕度75%±5%，光照周期L ∶ D=14 ∶ 10的人工氣候箱（型號：PYX-300Q-B，廣州深華生物技術(shù)有限公司）中培養(yǎng)。成蟲產(chǎn)下卵后將卵轉(zhuǎn)移至干凈的培養(yǎng)皿，將培養(yǎng)皿繼續(xù)放置人工氣候箱中直至孵化為1齡幼蟲，1齡幼蟲到高齡幼蟲之間以人工飼料飼養(yǎng)[11]。對于幼蟲的飼養(yǎng)條件，除光照周期調(diào)整為L ∶ D=0 ∶ 24，其他飼養(yǎng)條件與成蟲設(shè)置的飼養(yǎng)條件一致。根據(jù)發(fā)育天數(shù)和頭殼寬度及顏色判斷蟲齡，挑選發(fā)育天數(shù)為68 d的高齡幼蟲作為試驗對象，試蟲均為野外種群在室內(nèi)人工飼養(yǎng)的F1代。

1.2 方法

1.2.1 過冷卻點的測定 采用熱電偶方法進行測定[15]，儀器主要有高低溫濕熱箱（型號：GDJS-100，沈陽林頻實驗設(shè)備有限公司）和過冷卻點測定儀（SUN-V型智能昆蟲過冷卻點測定儀）組成。試驗重復(fù)3次，每次處理8頭幼蟲，記錄過冷卻點值。

1.2.2 檢測溫度的確定 對于大多數(shù)昆蟲的快速冷馴化試驗，檢測方法沿用Chen等[16]最初研究麻蠅時提出的試驗方案。由上一步確定的紅棕象甲高齡幼蟲過冷卻點為-8.37 ℃。設(shè)計從0 ℃到-8.37 ℃之間一系列溫度梯度，分別為：0、-2、-4、-6、-8 ℃，然后把高齡幼蟲從正常的飼養(yǎng)溫度直接轉(zhuǎn)移到系列溫度下處理2 h，然后再將其取出置于常溫下恢復(fù)1 d后，觀察并統(tǒng)計其存活率。以毛筆撥動蟲體表，若試蟲出現(xiàn)蠕動或緩慢爬行則視為存活；蟲體發(fā)黑變硬且無明顯肢體蠕動則視為死亡。選擇存活率在15%～30%對應(yīng)的溫度作為檢測溫度。本實驗設(shè)定紅棕象甲高齡幼蟲的檢測溫度為：-8 ℃下處理2 h。每次處理組選取8頭幼蟲，每個處理重復(fù)3次。

1.2.3 不同降溫速率對紅棕象甲高齡幼蟲存活率的影響 挑選健康且大小均勻的高齡幼蟲將其置于高低溫濕熱箱中（型號：LP/GDJS-100，沈陽林頻），分別設(shè)定3種降溫速率（1.00、0.10、0.05 ℃/min）從25 ℃降到5 ℃，然后將每組處理轉(zhuǎn)移置檢測溫度-8 ℃下2 h后，取出置于室溫下恢復(fù)1 d，觀察并統(tǒng)計存活率。實驗設(shè)置空白組，即將未經(jīng)冷馴化處理的試蟲直接轉(zhuǎn)移置檢測溫度下處理2 h后取出，恢復(fù)1 d并統(tǒng)計其存活率。每組處理8頭幼蟲，每個處理重復(fù)3次。

1.2.4 不同降溫速率對紅棕象甲高齡幼蟲體內(nèi)生理指標(biāo)的影響

（1）蟲體含水量測定。挑選健康且大小均勻的高齡幼蟲，用棉花將試蟲體表清理干凈并吸干水分后稱取各幼蟲樣品鮮重，記為FM（fresh mass），然后將試蟲置于60 ℃恒溫培養(yǎng)箱中干燥3 d后取出，分別稱量單頭蟲體干重記為DM（dry mass）。體內(nèi)含水率/%=（FM-DM）/FM×100。每組處理8頭幼蟲，每個處理重復(fù)3次。

（2）蟲體游離脂肪含量的測定。將試蟲置于60 ℃烘干箱中烘干3 d后，取出并充分研磨，然后取一定量研磨液（體內(nèi)油脂含量較高）M裝入濾紙筒內(nèi)，稱重濾紙與研磨液總質(zhì)量記為M1，將濾紙筒放入索氏提取器內(nèi)，加入純乙醚，在60 ℃加熱回流提取5 h，然后將蒸餾瓶加熱除去殘余乙醚并干燥，取出干燥后的濾紙筒并稱重記為M2。游離粗脂肪/%=（M2-M1）/M×100。每個處理8頭試蟲，每組處理重復(fù)3次。

（3）蟲體甘油含量的測定。繪制標(biāo)準曲線：分別在6支10 mL離心試管內(nèi)注入15%的CuSO4溶液0.3 mL和5%的NaOH溶液3.5mL，配制Cu（OH）2懸濁液，再加入50%的甘油溶液和蒸餾水，使甘油的含量依次為40.0、45.0、50.0、55.0、60.0、65.0、70.0 g/L，充分震蕩，離心分離后取上清液分別置于比色皿中，在630 nm處測定吸光度值，繪制標(biāo)準曲線。蟲體甘油含量測定：繪制標(biāo)準曲線后取脂類提取液0.1 mL注入10 mL離心試管內(nèi)，加濃H2SO4 2 mL，在沸水浴中消化，加入Cu（OH）2懸濁液，離心分離，取上清液用分光光度計測其吸光值，查標(biāo)準曲線得蟲體甘油含量[17]。每個處理8頭試蟲，每組處理重復(fù)3次

（4）蟲體總糖含量測定。采用蒽酮法測定糖原含量[18]，取充分研磨的幼蟲0.3 g，加1 mL 30% KOH，設(shè)置3次重復(fù)，沸水浴30 min左右，直到水解液清澈透明無顆粒為止。冷卻后移入離心管，加入3 mL 95%乙醇。將離心管放在冰箱內(nèi)過夜，次日離心（10 min，3 500 r/min）棄上清液，再將沉淀溶于1 mL蒸餾水中，并加入4 mL乙醇（95%），在冰箱內(nèi)放置3～4 h，離心棄上清液，沉淀用蒸餾水溶解過濾并定容于25 mL容量瓶中即得樣品待測液。每個處理8頭試蟲，每組處理重復(fù)3次

（5）血淋巴中蛋白質(zhì)含量的測定。在1.5 mL離心管內(nèi)加入苯基硫脲晶體數(shù)粒防止黑化，置冰浴上預(yù)冷，然后將試蟲用蒸餾水沖洗凈后用濾紙吸去體表水漬，然后用手揉捏試蟲幾下后捏緊蟲體，用針孔刺破蟲體表使血淋巴滴出，用40 μL移液槍直接收集血淋巴于預(yù)冷的離心管內(nèi)，收集完后將其保存于-70 ℃冰箱待用。參照 Bradford[19]方法，配制1 mg/mL的BSA（牛血清白蛋白）標(biāo)準蛋白液，并繪制標(biāo)準曲線。血淋巴蛋白質(zhì)測定時，先將血淋巴稀釋10倍，取4 μL稀釋液，加入蒸餾水補足至1 mL，加入3 mL考馬斯亮藍染色液，25 ℃保溫15 min，于595 nm處測光吸收值，從標(biāo)準曲線上求出血淋巴蛋白含量。每組處理8只試蟲，每個處理重復(fù)3次。

1.3 數(shù)據(jù)分析

采用SPSS 15.0軟件對試驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，獲取平均值及標(biāo)準差，不同處理間差異進行單因素方差分析（One-Way ANOVA）和Duncan多重比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 紅棕象甲高齡幼蟲過冷卻點測定

如表1所示，紅棕象甲高齡幼蟲過冷卻點（Supercooling point）（SCP）差異較顯著（p<0.05），平均值為（-8.58±2.6）℃；其中，最高值為-4.43 ℃，最低值為-13.78 ℃。

2.2 檢測溫度的確定

如圖1所示，將紅棕象甲高齡幼蟲置于不同低溫梯度下處理2 h后，其存活率隨低溫溫度的降低而減少，直至暴露于-8 ℃下2 h，平均存活率為16.67%，因此選此溫度作為檢測溫度。

2.3 不同降溫速率對紅棕象甲高齡幼蟲存活率的影響

如圖2所示，分別以1.00、0.10、0.05 ℃/min的降溫速率冷馴化試蟲后其存活率間差異顯著（p<0.05），且0.10 ℃/min降溫速率處理組的存活率與空白組間存活率差異極顯著（p<0.01），冷馴化后試蟲存活率平均值提高至45.83%，約為空白組存活率（16.67%）的2～3倍；另兩處理組與空白組間差異不顯著（p>0.05），依次為1.00 ℃/min（20.83%）和0.05 ℃/min（8.33%）；而以0.05 ℃/min降溫速率處理后紅棕象甲高齡幼蟲的存活率卻低于未經(jīng)冷馴化處理對照組的存活率，可看出0.05 ℃/min的降溫速率處理后并未增強其耐寒性，而是削弱了紅棕象甲高齡幼蟲的耐寒性。

2.4 紅棕象甲高齡幼蟲體內(nèi)水分含量與存活率之間的關(guān)系

如圖3所示，分別以3種降溫速率冷馴化紅棕象甲高齡幼蟲后，處理組試蟲體內(nèi)含水量均低于空白組試蟲的含水量，分別為68.02%（1.00 ℃/min）、62.67%（0.10 ℃/min）、67.42%（0.05 ℃/min）；其中以0.10 ℃/min處理組含水率與空白組含水率（71.12%）間差異極顯著（p<0.01），且與其他二組間差異顯著（p<0.05）；其他兩組含水率均與空白組間含水率差異不顯著（p>0.05）。

2.5 紅棕象甲高齡幼蟲體內(nèi)游離脂肪含量與耐寒性的關(guān)系

由圖4可知，紅棕象甲高齡幼蟲體內(nèi)脂肪含量在不同降溫速率1.00、0.10、0.05℃/min處理組間差異不顯著（p>0.05），處理后脂肪含量分別為57.25%、52.62%、58.29%；但1.00 ℃/min與0.05 ℃/min降溫速率處理后試蟲體內(nèi)脂肪含量均顯著高于未經(jīng)冷馴化的空白組試蟲體內(nèi)脂肪含量（42.76%）（p<0.05）；而0.10 ℃/min的降溫速率處理后試蟲體內(nèi)脂肪含量較空白組含量高，但差異不顯著（p>0.05）；1.00 ℃/min與0.05 ℃/min冷馴化后的蟲體內(nèi)脂肪含量較高，但二者之間差異不顯著。

2.6 紅棕象甲高齡幼蟲體內(nèi)甘油含量與耐寒性的關(guān)系

從圖5可以看出，紅棕象甲高齡幼蟲體內(nèi)甘油含量隨降溫速率的降低而逐漸升高，1.00 ℃/min和0.10 ℃/min降溫處理與0.05 ℃/min處理間甘油含量差異顯著（p<0.05）；當(dāng)降溫速率低至0.05 ℃/min時，冷馴化后誘導(dǎo)出蟲體內(nèi)甘油濃度最大，平均值為71.23 g/L，其后依次為50.14 g/L（0.10 ℃/min）、41.86 g/L（1.00 ℃/min）；不論降溫速率快慢，低溫冷馴化后試蟲體內(nèi)甘油含量均顯著高于未經(jīng)處理的空白組（32.54%）。

2.7 紅棕象甲高齡幼蟲總糖含量與耐寒性關(guān)系

如圖6所示，紅棕象甲高齡幼蟲體內(nèi)總糖含量隨著降溫速率的下降呈上升趨勢。其中以0.05 ℃/min降溫速率冷訓(xùn)后試蟲體內(nèi)總糖含量最高，平均值為59.56 μg/mg，總糖含量與其他兩處理組（0.10 ℃/min、1.00 ℃/min）間差異極顯著（p<0.01）；以1.00 ℃/min與0.10 ℃/min的降溫速率處理試蟲后體內(nèi)總糖含量分別為20.49 μg/mg、24.41 μg/mg。

2.8 紅棕象甲高齡幼蟲血淋巴蛋白質(zhì)含量與耐寒性關(guān)系

如圖7所示，紅棕象甲高齡幼蟲血淋巴內(nèi)蛋白質(zhì)含量隨降溫速率的減少而減少，且3個處理組間差異極顯著（p<0.01）。其中，以1.00 ℃/min降溫速率冷馴化后試蟲體內(nèi)血淋巴內(nèi)誘導(dǎo)蛋白質(zhì)含量最高，平均值為26.89 mg/mL，約為空白組（6.53 mg/mL）血淋巴蛋白質(zhì)含量的4～5倍；而以0.05 ℃/min 接近自然降溫的冷馴化降溫速率處理試蟲后，試蟲體內(nèi)血淋巴內(nèi)蛋白質(zhì)含量劇減少至9.08 mg/mL。除0.05 ℃/min處理組誘導(dǎo)的蛋白質(zhì)含量與未處理組測定的蛋白質(zhì)含量差異不顯著外（p>0.05），其余兩組處理與空白組間差異都極顯著（p>0.01）。由此可見，以0.05 ℃/min降溫速率處理紅棕象甲高齡幼蟲后誘導(dǎo)的血淋巴蛋白質(zhì)含量效果較差，而以1.00 ℃/min降溫速率處理試蟲后血淋巴內(nèi)蛋白質(zhì)含量急劇上升。

3 討論與結(jié)論

3.1 不同降溫速率與紅棕象甲高齡幼蟲存活率的關(guān)系

昆蟲耐寒性并非隨著降溫速率的減少而增加，而是在一定范圍內(nèi)，隨處理強度的增強而提高[20-22]。若當(dāng)冷馴化強度進一步增強時則可能造成昆蟲低溫耐受性的降低，一定程度上抵消冷馴化對昆蟲耐寒性的提高效果[23]，此結(jié)論適用于紅棕象甲高齡幼蟲，長時間的冷暴露并不能有效提高試蟲的耐寒性，相反表現(xiàn)為削弱其耐寒性；而以1.00 ℃/min的降溫速率處理試蟲后其存活率較空白組存活率雖有所升高，但增長幅度不明顯。筆者推測由于試蟲暴露于低溫下時間較短，所有個體并未充分進行冷馴化，僅少部分個體進入冷馴化階段存活下來，大部分個體未經(jīng)馴化直接暴露于低溫下而造成冷傷害死亡，因此短時間的冷暴露亦不能有效提高試蟲的耐寒性。此外，不同物種或同一物種不同發(fā)育階段耐寒性大小均不完全一致，冷馴化強度及處理時間的選取應(yīng)具較強針對性，海南省地處熱帶與亞熱帶交界，常年平均氣溫均在20 ℃以上[24]，定殖在此地區(qū)的昆蟲極少會面臨低溫脅迫，零度以上的低溫即可造成其大量死亡，因此本實驗選取實驗對象的冷馴化溫度相對較高（5 ℃）。試驗結(jié)果證明，以0.10 ℃/min的降溫速率處理實驗對象，冷馴化效果較理想；以1.00 ℃/min的降溫速率處理試驗對象，冷馴化效果增強，但不顯著；而以0.05 ℃/min的降溫速率進行冷馴化時，歷時較長，削弱了試蟲的耐寒性。因此，對于紅棕象甲高齡幼蟲而言，冷馴化有效的降溫速率大致應(yīng)位于1.00～0.10 ℃/min之間。

3.2 不同降溫速率與紅棕象甲高齡幼蟲體內(nèi)生理生化指標(biāo)的關(guān)系

昆蟲面臨低溫脅迫時體內(nèi)出現(xiàn)一系列復(fù)雜的生理指標(biāo)變化，如體內(nèi)水含量、脂肪含量、小分子冷凍保護劑甘油、糖分以及誘導(dǎo)的抗凍蛋白含量的變化等，從而增強了對未結(jié)冰傷害和結(jié)冰傷害的抵抗能力[2]。本實驗中，不同降溫速率冷馴化后紅棕象甲高齡幼蟲體內(nèi)各生理指標(biāo)存在差異，以1.00 ℃/min的降溫速率冷馴化處理紅棕象甲高齡幼蟲后，其體內(nèi)水分含量急劇下降，但隨著降溫速率的減慢，試蟲體內(nèi)含水量逐漸下降；當(dāng)以0.10 ℃/min的降溫速率處理后試蟲體內(nèi)含水量達到最低值62.67%，若再以較慢的降溫速率0.05 ℃/min處理試蟲后蟲體內(nèi)含水量則逐漸升高，但存活率卻降至最低，其含量變化與1.00 ℃/min降溫速率處理后的試蟲體內(nèi)水分含量差異不顯著（p>0.05），可視為蟲體面臨低溫脅迫時的失水平衡狀態(tài)，具體解釋但還需進一步研究，同樣的推測適用于脂肪含量的波動。而蟲體內(nèi)甘油含量和總糖含量與降溫速率之間呈明顯的負相關(guān)，即隨著降溫速率的減慢，體內(nèi)誘導(dǎo)出的甘油含量與總糖含量不斷上升，且均在0.05 ℃/min降溫速率處理后含量急劇升高。甘油是昆蟲面臨低溫脅迫過程中最普遍的抗凍保護劑[25-26]，但其含量的增加并未使試蟲存活率升高，總糖含量的波動亦是如此；而血淋巴誘導(dǎo)出蛋白質(zhì)含量隨著降溫速率的減少逐漸下降，可解釋為紅棕象甲高齡幼蟲在面臨低溫脅迫時，血淋巴在短時間內(nèi)會誘導(dǎo)出大量的抗凍蛋白，作為其短期抗寒物質(zhì)，但具體由血淋巴中哪一類或哪幾類蛋白質(zhì)起著抗寒作用，還需進一步鑒定。

此外，對于熱帶或亞熱帶昆蟲而言，雖極少會面臨零度以下低溫脅迫，但時常偶遇臺風(fēng)、暴雨或海嘯等惡劣天氣，氣溫會急劇下降，常年定殖在該類地區(qū)的昆蟲因此也進化出相對的耐寒對策：即短時間內(nèi)面臨低溫脅迫可誘導(dǎo)出大量抗寒物質(zhì)的特性，為其抵抗寒冷環(huán)境，成功進入下一繁殖期提供必要條件。

參考文獻

[1] Kelty J D， Lee Jr R E. Induction of rapid cold hardening by cooling at ecologically relevant rates in Drosophila melanogaster[J]. Journal of Insect Physiology， 1999， 45（8）： 719-726.

[2] 王憲輝， 齊憲磊， 康 樂. 昆蟲的快速冷馴化現(xiàn)象及其生態(tài)適應(yīng)意義[J]. 自然科學(xué)進展， 2003， 13（11）： 1 128-1 132.

[3] Lee R E， Chen C P， Denlinger D L. A rapid cold-hardening process in insects[J]. Science， 1987， 238： 1 415-1 417.

[4] Coulson S J， Bale J S. Characterisation and limitations of the rapid cold-hardening response in the housefly Musca domestica （Diptera： Muscidae）[J]. Journal of Insect Physiology， 1990， 36（3）： 207-211.

[5] Chen B. Kang L. Cold hardiness and supercooling capacity in the pea leafminer Liromyza huidobrensis[J]. CryoLetters， 2002， 23： 173-182.

[6] Broufas G D， Koveos D S. Rapid cold hardening in the predatory mite Euseius Amblyseius finlandicus（Acari： Phytoseiidae）[J]. Journal of Insect Physiology， 2001， 47（7）： 699-708.

[7] Worland R， Block W， Rothery P. Survival of sub-zero temperatures by two South Georgian beetles（Coleoptera， Perimylopidae）[J]. Polar Biology， 1992， 11（8）： 607-613.

[8] Shintani Y， Ishikawa Y. Relationship between rapid cold-hardening and cold acclimation in the eggs of the yellow-spotted longicorn beetle Psacothea hilaris[J]. Journal of Insect Physiology， 2007， 53（10）： 1 055-1 062.

[9] Larsen K J， Lee R E. Cold tolerance including rapid cold-hardening and inoculative freezing of fall migrant monarch butterflies in Ohio[J]. Journal of Insect Physiology， 1994， 40（10）： 859-864.

[10] 覃偉權(quán)， 李朝緒， 黃山春.紅棕象甲在中國的風(fēng)險性分析[J]. 江西農(nóng)業(yè)學(xué)報， 2009， 21（9）： 79-82.

[11] 李 磊.紅棕象甲基礎(chǔ)生物生態(tài)學(xué)研究[D]. ?？冢?海南大學(xué)， 2010.

[12] 鞠瑞亭， 王 鳳， 肖娛玉， 等. 上海地區(qū)紅棕象甲的耐寒性研究[J]. 昆蟲學(xué)報， 2010， 53（2）： 226-232.

[13] Abe F， Hata K， Sone K. Life History of the Red Palm Weevil， Rhynchophorous ferrugineus（Coleoptera： Dryophtoridae）， in Southern Japan[J]. Florida Entomologist， 2009， 92（3）： 421-425.

[14] 覃偉權(quán)， 馬子龍， 吳多楊， 等. 幾種引誘物對紅棕象甲的誘集和田間監(jiān)測[J]. 熱帶作物學(xué)報， 2004， 25（2）： 42-46.

[15] 耿濟國， 張建新， 張孝羲. 昆蟲生態(tài)及預(yù)測預(yù)報實驗指導(dǎo)[M]. 北京： 農(nóng)業(yè)出版社， 1991： 90-94.

[16] Chen C P， Denlinger D L， Lee R E. Cold-shock injury and rapid cold hardening in the flesh fly Sarcophaga crassipalpis[J]. Physiol Zool， 1987， 60（3）： 297-304.

[17] 郭 郛， 忻介六. 昆蟲實驗技術(shù)[M]. 北京： 科學(xué)出版社， 1988： 165-195.

[18] Che X B， Xia N B， Song C Y， et al. Study on the main Energy Substance Consumed by Dendrolimus tabulaeformis Tsai et Liu Adult During Migration[J]. Journal of Beijing Forestry University， 1996， 18（4）： 29-34.

[19] Bradford M M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding[J]. Analytical biochemistry， 1976， 72（1）： 248-254.

[20] Lee Jr R E. Insect cold-hardiness： To freeze or not to freeze[J]. Bioscience， 1989， 39（5）： 308-313.

[21] Ju R T， Xiao Y Y， Li B. Rapid cold hardening increases cold and chilling tolerances more than acclimation in the adults of the sycamore lace bug Corythucha ciliata（Hemiptera： Tingidae）[J]. Journal of Insect Physiology， 2011， 57（11）： 1 577-1 582.

[22] McDonald J R， Bale J S， Walters K F A. Rapid cold hardening in the western flower thrips Frankliniella occidentalis[J]. Journal of Insect Physiology， 1997， 43（8）： 759-766.

[23] 岳 雷， 郭建英， 周忠實， 等. 冷馴化對昆蟲耐寒性及其適合度的影響[J]. 中國生物防治學(xué)報， 2013， 29（2）： 286-293.

[24] 唐少霞， 趙志忠， 畢 華， 等. 海南島氣候資源特征及其開發(fā)利用[J]. 海南師范大學(xué)學(xué)報（自然科學(xué)版）， 2008， 21（3）： 343-346.

[25] Jing X H， Kang L. Geographical variation in egg cold hardiness： a study on the adaptation strategies of the migratory locust Locusta migratoria L[J]. Ecological Entomology， 2003， 28（2）： 151-158.

[26] Terblanche J S， Marais E， Chown S L. Stage-related variation in rapid cold hardening as a test of the environmental predictability hypothesis[J]. Journal of Insect Physiology， 2007， 53（5）： 455-462.