李崇奇等

摘 要 應(yīng)用miRtour在線分析工具對(duì)巨桉的EST序列和GSS序列進(jìn)行分析，預(yù)測(cè)巨桉的miRNA序列，應(yīng)用psrobot預(yù)測(cè) miRNA的靶基因。結(jié)果發(fā)現(xiàn)205條miRNA前體序列和屬于62個(gè)不同家族的170條成熟的miRNA序列，最大的miRNA家族為miR399家族，有17個(gè)成員；miRNA 5′ 段堿基存在明顯的堿基偏倚，尿嘧啶出現(xiàn)頻率高達(dá)40.6%；147個(gè)miRNA預(yù)測(cè)到了靶基因，共計(jì)預(yù)測(cè)到巨桉蛋白基因中有967個(gè)受到miRNA的調(diào)節(jié)，同時(shí)發(fā)現(xiàn)1個(gè)miRNA可以調(diào)控多個(gè)靶基因，同一蛋白質(zhì)受多個(gè)miRNA調(diào)控的現(xiàn)象。

關(guān)鍵詞 巨桉；miRNA；EST；GSS

中圖分類號(hào) Q74 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A

Identification of microRNA in Eucalyptus grandis

LI Chongqi1，2，3， SHEN Wentao2， YAN Pu2， LI Xiaoying2， ZHOU Peng1，2 *

1 College of Agronomy， Hainan University， Haikou， Hainan 570228， China

2 Analysis & Testing Center， Institute of Tropical Bioscience and Biotechnology， Chinese Academy of Tropical

Agricultural Sciences， Haikou， Hainan 571101， China

3 Department of Biochemistry and Molecular Biology， Hainan Medical College， Haikou， Hainan 571199， China

Abstract MicroRNA of Eucalyptus grandis was predicted using EST and GSS by miRtour， whereas miRNA-targeted mRNAs was predicted by Psrobot. 205 precursor sequences and 170 miRNAs belonging to 62 different miRNA familes were found. The largest miRNA family of 17 members is miR399. The uracil nucleotide is dominant in the first position of 5′ mature miRNAs， which is up to 40.6%. 147 miRNA has potential miRNA targets meanwhile 967 protein genes may be regulated by miRNA. In addition， it found that miRNA can regulate multiple target genes while one protein can be regulated by some miRNAs.

Key Words Eucalyptus grandis； miRNA； EST； GSS

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2014.06.012

巨桉（Eucalyptus grandis）為桃金娘科（Myrtaceae）桉屬（Eucalyptus）高大喬木，原產(chǎn)于澳大利亞。目前被廣泛用于熱帶和亞熱帶地區(qū)的人工造林，已成為桉屬樹種中栽培面積最廣的物種[1]。我國從20世紀(jì)60年代開始引種巨桉， 主要栽培于長江以南的四川、福建、湖南、云南、江西、貴州等地[2]，廣泛用于房屋建筑、人造板、造紙等領(lǐng)域。

巨桉是世界上生長最快的物種之一，每年一公頃人工林收獲的木材可高達(dá)100 m3。如何識(shí)別影響巨桉生長速率和其他品質(zhì)相關(guān)的基因，對(duì)未來巨桉甚至其他林木樹種的遺傳品質(zhì)改良具有重要的意義。而物種內(nèi)部很多基因尤其是一些轉(zhuǎn)錄因子都受到miRNA的調(diào)控，對(duì)人類的研究發(fā)現(xiàn)30%的基因都受到miRNA的調(diào)控[3]。成熟的microRNA是一類大約22堿基左右小RNA分子，與靶基因通過堿基互補(bǔ)配對(duì)的方式將mRNA分子剪切或抑制蛋白質(zhì)的翻譯[4]。植物的microRNA分子研究起步相對(duì)較晚[5-6]，到目前為止在mirbase數(shù)據(jù)庫（www.mirbase.org）中超過200條成熟microRNA序列的植物僅有13種。但由于植物microRNA分子與靶基因可以精確匹配等特點(diǎn)，可以應(yīng)用生物信息學(xué)方法預(yù)測(cè)，所以其發(fā)展非常迅速。表達(dá)序列標(biāo)簽（expressed sequence tag，EST）是從一個(gè)隨機(jī)選擇的cDNA克隆進(jìn)行5′端和3′端單一次測(cè)序獲得的短的cDNA部分序列。而基因組勘測(cè)序列（genome survey sequences，GSS）是基因組DNA克隆的一次性部分測(cè)序序列，包括隨機(jī)的基因組勘測(cè)序列、cosmid/BAC/YAC末端序列、通過Exon trapped 獲得基因組序列、通過Alu PCR獲得的序列以及轉(zhuǎn)座子標(biāo)記（transposon-tagged）序列等[7]。目前EST序列和GSS序列都被廣泛應(yīng)用于許多植物miRNA的預(yù)測(cè)分析[8-11]。本研究擬應(yīng)用miRtour在線分析工具（http：//bio2server.bioinfo.uni-plovdiv.bg/ miRTour/）[12]對(duì)巨桉的EST序列和GSS序列進(jìn)行分析，然后預(yù)測(cè)巨桉的miRNA序列和miRNA的靶基因，識(shí)別與巨桉品質(zhì)相關(guān)或疾病相關(guān)的miRNA和其調(diào)控的靶基因，為未來巨桉以及其他林木分子遺傳育種奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

從美國國家生物技術(shù)信息中心（National Center for Biotechnology Information，NCBI）的網(wǎng)站（www.ncbi.nlm.nih.gov）上分別在EST數(shù)據(jù)庫和GSS數(shù)據(jù)庫中搜索巨桉的序列，然后選擇fasta格式下載，共計(jì)獲得巨桉EST序列42 576條，GSS序列284 604條。

1.2 方法

將巨桉EST序列和GSS序列分批遞交到miRtour在線界面上傳后參數(shù)設(shè)置如下，最少能夠跟1個(gè)已知的miRNA序列比對(duì)上（Minimum number of known miRNAs to be aligned），miRNA序列與其互補(bǔ)序列的不配對(duì)數(shù)（Maximum unpaired nt in miR/miR*）不超過6對(duì)，其他參數(shù)默認(rèn)。然后下載分析結(jié)果可以得到miRNA序列、前體序列、最小自由能、最小自由能指數(shù)等相關(guān)參數(shù)，同時(shí)該在線工具在分析的過程中去除了蛋白質(zhì)序列。為了使分析結(jié)果更加可靠，本研究分別從rfam（http：//rfam.sanger.ac.uk/）網(wǎng)站和pfam（http：//pfam.sanger.ac.uk/）網(wǎng)站下載非編碼RNA數(shù)據(jù)庫[13]和蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫[14]，然后應(yīng)用blast-2.2.27+軟件中的blastn程序?qū)㈩A(yù)測(cè)到的miRNA前體序列與rfam數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對(duì)，去除除miRNA之外的非編碼RNA；用blastx程序與pfam數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對(duì)去除蛋白質(zhì)序列即可得到巨桉的miRNA前體序列和相應(yīng)的成熟miRNA序列，將evalue參數(shù)設(shè)置為1e-6，其他參數(shù)默認(rèn)。將預(yù)測(cè)到的成熟miRNA序列以fasta格式上傳到psrobot網(wǎng)站（http：//omicslab.genetics.ac.cn/psRobot/index.php）[15]，應(yīng)用靶基因預(yù)測(cè)在線工具進(jìn)行預(yù)測(cè)，參數(shù)選擇嚴(yán)格模式。

1.3 數(shù)據(jù)分析

應(yīng)用bioedit[16]統(tǒng)計(jì)miRNA及其前體的序列長度，然后統(tǒng)計(jì)miRNA序列每個(gè)位點(diǎn)的堿基組成，對(duì)其堿基偏倚進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 巨桉miRNA預(yù)測(cè)

42 576條巨桉EST序列經(jīng)過分析得到14條可能的miRNA前體序列，28 4604條GSS序列得到214條可能的miRNA前體序列，將二者比對(duì)去除重復(fù)序列后得到207條序列。然后將207條序列與rfam數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對(duì)沒有發(fā)現(xiàn)其他非編碼RNA序列，與pfam數(shù)據(jù)庫比對(duì)后發(fā)現(xiàn)2條蛋白質(zhì)序列，最后得到205條miRNA前體序列。所有前體序列的二級(jí)結(jié)構(gòu)都具有典型的莖環(huán)結(jié)構(gòu)，miRNA序列位于莖環(huán)結(jié)構(gòu)的一側(cè)，最小自由能指數(shù)為0.7～1.25，GC含量為16.37%～71.18%。所有前體序列的最小自由能都為負(fù)值，最高的為egr-miR5185d，其自由能為-14.67 kcal/mol。將205條前體序列對(duì)應(yīng)的miRNA序列進(jìn)行比對(duì)去除重復(fù)序列后得到屬于62個(gè)不同家族的170條成熟的miRNA序列（表1）。其中發(fā)現(xiàn)miRNA家族成員最多的是miR399家族，有17個(gè)成員；其次為miR169家族，有16個(gè)成員。

2.2 巨桉miRNA和前體的堿基組成特征

預(yù)測(cè)的巨桉的miRNA長度為18～24 bp（圖1），miRNA序列中嘌呤與嘧啶的比值為0.98，沒有明顯差異，但堿基組成A：G：C：U為1：1.0：1.2：0.85，胞嘧啶的含量明顯高于尿嘧啶。同時(shí)分析miRNA 5′端堿基組成發(fā)現(xiàn)：第一和第二個(gè)堿基為尿嘧啶的比列分別高達(dá)40.6%和39.4%；而A則在第11位堿基出現(xiàn)的頻率最高達(dá)36.5%，G則在第9位堿基出現(xiàn)頻率最高達(dá)39.4%，C則在第19位堿基出現(xiàn)頻率最高為34.7%。miRNA前體長度為90～224 bp，多為150～200 bp左右（圖2），平均長度為174 bp，嘌呤與嘧啶的比值為1.0，堿基組成A：G：C：U為1：1.2：1.4：0.9，與miRNA成熟序列類似胞嘧啶的比例明顯偏高。同時(shí)分析前體序列5′端堿基組成發(fā)現(xiàn)嘌呤與嘧啶的比值為1.85，而3′端僅為0.85。

2.3 巨桉miRNA靶基因預(yù)測(cè)

170個(gè)miRNA中有147個(gè)預(yù)測(cè)到了靶基因，去除同一miRNA重復(fù)預(yù)測(cè)的蛋白和不能夠被注釋的蛋白后預(yù)測(cè)到的靶基因總數(shù)達(dá)到1 505個(gè)，總計(jì)預(yù)測(cè)到巨桉表達(dá)蛋白中有967個(gè)受到miRNA的調(diào)節(jié)。29個(gè)miRNA僅預(yù)測(cè)到單個(gè)靶基因，24個(gè)發(fā)現(xiàn)兩個(gè)靶基因，其余均發(fā)現(xiàn)多個(gè)靶基因，超過100個(gè)靶基因的有egr-miR4993、egr-miR414和egr-miR477，分別為317、157和136個(gè)。同時(shí)發(fā)現(xiàn)128種蛋白受2個(gè)以上miRNA調(diào)控，而PHO2蛋白受調(diào)節(jié)的miRNA最多達(dá)到8個(gè)。同時(shí)發(fā)現(xiàn)miRNA477和miR414與巨桉纖維素形成密切相關(guān)，其靶基因分別為纖維素合成酶A4和A9。本研究中列出了預(yù)測(cè)到的分值≤1.5的靶基因（表2）。

3 討論與結(jié)論

本研究應(yīng)用EST和GSS序列預(yù)測(cè)了巨桉的205條miRNA前體序列和170條miRNA成熟序列，而另一種林業(yè)生產(chǎn)的主要物種目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)352條前體序列和401條成熟miRNA序列。而Bartel等[4]認(rèn)為每個(gè)物種的miRNA數(shù)量應(yīng)該達(dá)到其基因數(shù)量的1%，而巨桉蛋白編碼序列目前發(fā)現(xiàn)36 376個(gè)（http：//www.phytozome.net/eucalyptus.php）。因此預(yù)計(jì)巨桉的miRNA數(shù)量應(yīng)該達(dá)到364個(gè)，而且事實(shí)上這一數(shù)目可能更高，因?yàn)槟壳癿irbase數(shù)據(jù)庫中人類（Homo sapiens）和小鼠（Mus musculus）的miRNA序列目前已經(jīng)分別發(fā)現(xiàn)2 578條和1 908條。因而未來巨桉的miRNA序列還有待于進(jìn)一步的生物信息學(xué)挖掘，或通過小RNA測(cè)序等相關(guān)實(shí)驗(yàn)技術(shù)進(jìn)行識(shí)別。

miRtour是一種基于網(wǎng)頁從EST和GSS數(shù)據(jù)中識(shí)別植物miRNA的研究工具，其最大特點(diǎn)是可以自動(dòng)識(shí)別符合miRNA前體特征的莖環(huán)結(jié)構(gòu)序列[12]。該方法設(shè)置的最小自由能指數(shù)為0.7，但本研究中通過blastx去除了含有莖環(huán)結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)序列，因而結(jié)果是可靠的。而Zhang等[17]基于對(duì)tRNA、rRNA、mRNA和miRNA前體研究后發(fā)現(xiàn)90%的miRNA前體序列最小自由能指數(shù)都高于0.85，從而建議以0.85為臨界值區(qū)分miRNA前體序列與其他RNA序列。但這毫無疑問會(huì)低估m(xù)iRNA的數(shù)量，甚至丟失掉其他10%的miRNA序列。因而本研究認(rèn)為通過與rfam和pfam數(shù)據(jù)進(jìn)行blast分析是分別miRNA前體序列與其他RNA序列的可靠方法。

本研究發(fā)現(xiàn)巨桉miRNA序列的5′端第一個(gè)堿基尿嘧啶比例最高，C則在第19位堿基出現(xiàn)頻率最高，這與多項(xiàng)研究一致。擬南芥和水稻的研究發(fā)現(xiàn)其5′端首個(gè)堿基中尿嘧啶比例高達(dá)83.6%[11]，而在大豆中為70%[18]，亞麻中為75%[19]。同時(shí)在大豆中發(fā)現(xiàn)19位為胞嘧啶的高達(dá)60%，而在亞麻中達(dá)80%。目前認(rèn)為miRNA 5′端堿基對(duì)于其與選擇不同Argonaute蛋白結(jié)合形成RISC復(fù)合物是至關(guān)重要的[20]。

本研究中86.5%的巨桉miRNA都預(yù)測(cè)到了靶基因，同時(shí)發(fā)現(xiàn)miRNA477和miR414與巨桉纖維素形成密切相關(guān)，其靶基因分別為纖維素合成酶A4和A9。同時(shí)發(fā)現(xiàn)許多轉(zhuǎn)錄因子都受到miRNA的調(diào)控。其中發(fā)現(xiàn)SPL轉(zhuǎn)錄因子（squamosa promoter binding protein-like，SPL）家族的多個(gè)成員都受到巨桉miRNA156家族的調(diào)控，而SPL參與了植物葉、花、果實(shí)的發(fā)育過程及植物結(jié)構(gòu)、孢子形成、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和抗逆反應(yīng)等一系列重要的生物學(xué)過程。而GRAS轉(zhuǎn)錄因子（GRAS family transcription factor）則同時(shí)受到巨桉miRNA171和miRNA477家族的調(diào)控，GRAS被認(rèn)為參與植物側(cè)生分生組織發(fā)育、莖尖分生組織的形成、根輻射形態(tài)形成、赤霉素的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、光敏色素信號(hào)傳導(dǎo)、雄配子發(fā)育、解毒功能和抗逆反應(yīng)等過程。參與了細(xì)胞分化、細(xì)胞周期的調(diào)節(jié)，激素和環(huán)境因子應(yīng)答的Myb轉(zhuǎn)錄因子則受到巨桉egr-miR828b的調(diào)控。此外本研究還發(fā)現(xiàn)在林產(chǎn)工業(yè)上廣泛應(yīng)用的漆酶（laccase）在巨桉中受miRNA397家族所調(diào)控。

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責(zé)任編輯：沈德發(fā)