歐高政 陳清西

摘 要 利用TCA丙酮法、丙酮法、TCA酚抽提法和改良酚抽法等4種方法，提取‘四季蜜龍眼花芽的總蛋白質(zhì)，在蛋白產(chǎn)量、單向SDS-PAGE和2-DE圖譜等方面進(jìn)行比較，并對(duì)IPG膠條種類、蛋白質(zhì)上樣量及等電聚焦條件等進(jìn)行優(yōu)化。結(jié)果表明：采用改良酚抽法，選用24 cm、pH3～10的膠條，按120 μg上樣，在適宜的等電聚焦條件下，可獲得背景清晰、重復(fù)性好、分辨率高的2-DE圖譜，本研究為‘四季蜜龍眼花芽蛋白質(zhì)組學(xué)后續(xù)研究奠定了基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞 ‘四季蜜龍眼；花芽；總蛋白；提取方法；雙向電泳

中圖分類號(hào) S667.201 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A

Method of Total Protein Isolation from Floral Buds of Longan

（Dimocarpus longan Lour. Cv Sijimi）and Optimization

of Two-dimensional Electrophoresis System

OU Gaozheng1，2，CHEN Qingxi1 *

1 College of Horticulture， Fujian Agriculture and Forestry University， Fuzhou， Fujian 350002， China

2 Fujian Vocational College of Agriculture， Fuzhou， Fujian 350119， China

Abstract The total protein in the floral buds of Dimocarpus longan Lour. Cv Sijimi was extracted with four methods，namely trichloroacetic acid（TCA）-acetone，acetone，TCA/phenol and improved phenol，and compared by protein production，one-way SDS-PAGE and 2-DE. The sample loading quantity，the gel concentration and the key process of IEF were also optimized. The result showed that the improved phenol extraction protocol was the best method for floral buds. And a high quality 2-DE map with low background was obtained using the following optimized procedure：loading 120 μg protein sample on 24 cm IPG strip with pH3-10. The study built up a good basis for the future proteomics research in D. longan（Lour. Cv Sijimi）.

Key words Dimocarpus longan Lour. Cv Sijimi； Floral buds； Total protein； Extraction method； Two-dimensional electrophoresis

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2014.06.010

‘四季蜜龍眼一年四季均能自然開花結(jié)果，該品種在自然條件下，成花不需低溫和干旱條件，花芽分化、開花和座果在高溫下仍能正常進(jìn)行，其特殊的開花習(xí)性為研究龍眼周年生產(chǎn)提供了便利。通過雙向電泳技術(shù)分析‘四季蜜龍眼成花過程蛋白質(zhì)圖譜的差異，尋找與成花相關(guān)的蛋白質(zhì)并進(jìn)一步分離相關(guān)基因，對(duì)調(diào)控龍眼成花有重要理論意義。但龍眼屬于頑拗性植物，芽中含有大量的酚類、多糖及色素等干擾物質(zhì)，不利于總蛋白質(zhì)的提取。雖然前人研究龍眼成花逆轉(zhuǎn)時(shí)曾對(duì)普通龍眼花葉芽進(jìn)行過提取，但是所用方法不同，效果也不一樣[1-2]，因此有必要對(duì)‘四季蜜龍眼芽的總蛋白質(zhì)提取方法和雙向電泳體系進(jìn)行優(yōu)化，以期為進(jìn)一步研究龍眼花芽分化相關(guān)的蛋白質(zhì)組學(xué)研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 植物材料 供試材料于2012年8月采于福建省云霄縣源發(fā)農(nóng)場(chǎng)，選擇正常掛果的‘四季蜜龍眼成年樹，選取新梢基部直徑>0.5 cm的頂芽，用經(jīng)凈化處理的鑷子將花芽的鱗片去除后置于冰盒中帶回實(shí)驗(yàn)室，用液氮處理后放入-40 ℃冰箱備用。

1.1.2 主要儀器與試劑 IPG phor III等電聚焦儀、Ettan DALT six中高通量二向垂直電泳系統(tǒng)、Imagescanner II掃描系統(tǒng)均為GE公司產(chǎn)品；DYCZ-24EN垂直電泳儀，為北京六一儀器廠產(chǎn)品；HX-1050恒溫循環(huán)器，為德天佑公司產(chǎn)品。

固相pH梯度干膠條（IPG干膠條，pH4～7，13 cm、18 cm）、IPG buffer（pH3～10；pH4～7）、Pharmylte、二硫蘇糖醇（DTT）和碘乙酰胺（Iodacetamide）均購(gòu)自GE公司；丙烯酰胺（Acrylamide）、N，N'-甲叉雙丙烯酰胺（Bis-acrylamide）、尿素（Urea）、硫脲（Thiourea）、CHAPS均購(gòu)自Amresco公司；Tris-base、溴酚藍(lán)、蛋白Marker、EDTA-2Na、三氯乙酸（TCA）、pH7.8 Tris飽和酚、十二烷基磺酸鈉（SDS）、聚乙烯吡咯烷酮（PVPP）、過硫酸銨（AP）、TEMED、硫代硫酸鈉（Na2S2O3）、無(wú)水碳酸鈉（Na2CO3）、甘氨酸（Glycine）、牛血清白蛋白（BSA）、考馬斯亮藍(lán)R-250/G-250、β-疏基乙醇（β-ME）、瓊脂糖等購(gòu)于上海生工。冰醋酸、丙酮、無(wú)水乙醇、無(wú)水甲醇、醋酸氨、硝酸銀、甲醛等均為國(guó)產(chǎn)分析純?cè)噭?/p>

1.2 方法

1.2.1 總蛋白質(zhì)提取方法

（1）TCA/丙酮法。參照賴呈純等的方法[3]稍加改進(jìn)。稱取1.0 g供試材料，加入液氮研成粉末，移入10 mL離心管中，加入4倍體積預(yù)冷的丙酮（含100 g/L TCA，體積分?jǐn)?shù)0.07% β-巰基乙醇），充分渦旋后-20 ℃下靜置6 h或過夜，以使蛋白充分沉降，后按方法步驟進(jìn)行，將沉淀置于-20 ℃冰柜中，使殘留的丙酮揮發(fā)干凈，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

（2）丙酮法。參照范海延等的方法[4]稍加改進(jìn)。供試材料研磨采用含0.07% β-巰基乙醇預(yù)冷的丙酮制成勻漿，充分渦旋后置于-20 ℃沉降1 h，后按方法進(jìn)行，最后將沉淀置于-20 ℃冷凍干燥，保存?zhèn)溆谩?/p>

（3）TCA/酚提法。參照Wang W等[5]的方法稍加改進(jìn)。供試材料首次所得沉淀用冷丙酮再洗1次，把沉淀轉(zhuǎn)入研缽，室溫?fù)]發(fā)干丙酮，轉(zhuǎn)入新的離心管，加入1 mL丙酮（含100 g/L TCA，體積分?jǐn)?shù)0.07% β-巰基乙醇）洗滌3次，直至沉淀無(wú)色。后按方法步驟進(jìn)行，最后沉淀-40 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

（4）改良酚提法。參考Saravanan等[6]方法加以改進(jìn)。稱取1.0 g材料，加入液氮研磨成粉（加入20% PVPP研磨），加入5倍體積的0.07% 2-ME/冷丙酮，振蕩渦旋，4 ℃，15 000 g/min離心10 min，重復(fù)2次。抽干丙酮，轉(zhuǎn)入新的研磨，再用液氮研磨成更細(xì)粉末，加入4 mL SDS緩沖液，渦旋，充分混勻，4 ℃放置30 min（每隔10 min 振蕩1次），加入等體積的pH7.8 Tris飽和酚，渦旋振蕩，放置-20 ℃ 30 min（每隔10 min振蕩一次），4 ℃，15 000 g/min離心10 min，轉(zhuǎn)移上層酚相，加入等體積SDS緩沖液重復(fù)抽2次，渦旋充分混勻，4 ℃，15 000 g/min離心10 min，轉(zhuǎn)移上層酚相（分成2份），加入5倍體積0.1 mol/L醋酸氨甲醇溶液，置-20 ℃至少4 h或過夜，4 ℃，15 000 g/min離心15 min，沉淀用5 mL 0.1 mol/L醋酸氨甲醇溶液洗3次，80%冷丙酮洗2次，晾干保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 蛋白質(zhì)定量 參照Bradford法[7]測(cè)定樣品中總蛋白質(zhì)含量。

1.2.3 電泳方法 SDS-PAGE電泳采用Laemm Li的方法[8]，用4%濃縮膠和12.5%分離膠，考馬斯亮藍(lán)染色。雙向電泳用裂解液[7 mol/L尿素，2 mol/L硫脲，4%（W/V）CHAPS，2%（V/V）pharmalyte，60 mmol/L DTT（現(xiàn)加）]溶解蛋白，4 ℃，15 000 g/min離心15 min，取上清加入水化液[8 mol/L尿素，2%（W/V）Chaps，1%（V/V）IPG緩沖液，40 mmol/L DTT，2%溴酚藍(lán)]上樣。IPG干膠條pH分別為3～10、4～7，長(zhǎng)度分別為18 cm、24 cm，水化液與樣品終體積分別為340 μL、450 μL，進(jìn)行等電聚焦，18 cm等電聚焦參數(shù)見表1。將聚焦好的IPG膠條用平衡液Ⅰ（100 mg/10 mL DTT）和平衡液Ⅱ（250 mg/10 mL碘乙酰胺）依次平衡15 min。第二向電泳采用12.5% SDS聚丙烯酰胺凝膠。

1.2.4 凝膠染色及圖像分析 電泳后的凝膠染色參照郭堯君[9]的銀染法。染色后使用Imagescanner II系統(tǒng)進(jìn)行掃描，并用Image MasterTM 2D Platinum software7.0分析軟件進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同提取方法蛋白產(chǎn)量及單向SDS-PAGE電泳比較

‘四季蜜龍眼花芽4種蛋白質(zhì)提取方法的比較見表2，由表2可知，在4種提取方法中，雖然TCA/丙酮法和丙酮法獲得的蛋白質(zhì)干粉遠(yuǎn)多于TCA/酚抽提法和改良酚抽法，但在提取所得的蛋白產(chǎn)量上存在顯著的差異。改良酚抽法得率最高，為（3.18±0.12）mg/g FW，TCA/酚提法可獲得蛋白量為（2.706±0.06）mg/g FW，兩者差異不明顯，但與TCA/丙酮、丙酮法達(dá)極顯著差異。因此從蛋白質(zhì)產(chǎn)量看，樣品經(jīng)過酚抽提效果明顯增強(qiáng)。

將提取的蛋白按上樣量50 μg進(jìn)行單向SDS-PAGE電泳（圖1），4種方法提取的蛋白經(jīng)SDS-PAGE分離后條帶數(shù)目以及染色深淺均有一定的差異，改良酚提法與小量酚提法均得到明顯的條帶數(shù)，其分離效果明顯，說明酚提所得的蛋白質(zhì)質(zhì)量好；TCA-丙酮法僅得到微弱的條帶，可能含有較多的雜質(zhì)；丙酮法提取的蛋白電泳檢測(cè)后幾乎沒有條帶。因此，從單項(xiàng)SDS-PAGE電泳來(lái)看，酚抽提的效果要優(yōu)于丙酮沉降。

2.2 不同上樣量對(duì)雙向電泳圖譜的影響

上樣量的大小影響著2-DE圖譜效果（圖2）。由于植物中蛋白質(zhì)表達(dá)豐度不同，上樣量低就會(huì)造成某些低豐度蛋白無(wú)法顯示，影響蛋白的檢測(cè)；但是如果上樣量過高，又有可能造成斑點(diǎn)的交叉，影響低豐度蛋白的分離，且過高的上樣量也會(huì)使鹽和雜質(zhì)的含量提高，影響等電聚焦效果。本研究選取蛋白獲得量最多、單向SDS-PAGE效果好的改良酚提法進(jìn)行上樣量比對(duì)，綜合考慮染色方法的靈敏度、前期重復(fù)試驗(yàn)的結(jié)果，并參考前人的相關(guān)研究[10-11]，選取了18 cm pH4～7的IPG膠條，設(shè)定了90、100、120、150 μg 4個(gè)梯度進(jìn)行比較，從圖2-C中可見，蛋白質(zhì)點(diǎn)分布均勻，背景清晰，聚焦效果良好，圖2-A中蛋白點(diǎn)過少，圖2-B中蛋白點(diǎn)有所增加，但相較2-C而言，仍有許多蛋白點(diǎn)未能有效表達(dá)，圖2-D中背景受到一定的影響，且有些點(diǎn)過表達(dá)，干擾了低豐度蛋白的檢測(cè)。因此認(rèn)為在‘四季蜜龍眼芽蛋白雙向電泳中，選擇120 μg上樣量可取到良好的效果。

2.3 不同提取方法對(duì)2-DE圖譜的影響

在確定上樣量后，對(duì)不同提取方法進(jìn)行了2-DE圖譜比較，結(jié)果見圖3。在4種提取方法中，TCA/丙酮法能獲得少量的蛋白點(diǎn)，丙酮法則僅有極少的點(diǎn)，其結(jié)果與單向SDS-PAGE相同，說明單向SDS-PAGE有指示作用，但導(dǎo)致單向SDS-PAGE中丙酮法沒有檢測(cè)到條帶的原因可能與蛋白濃度偏低有關(guān)。從圖3-D可見，改良酚提法的提取效果最好，經(jīng)過分析軟件檢測(cè)可得到約637個(gè)蛋白點(diǎn)，要優(yōu)于其他3種方法，因此改良酚提法比較有利于‘四季蜜龍眼芽總蛋白的提取。

2.4 不同電泳體系對(duì)2-DE圖譜的影響

分別采用pH3～10和pH4～7的24 cm IPG膠條對(duì)‘四季蜜龍眼花芽蛋白質(zhì)進(jìn)行分離，結(jié)果表明，采用pH3～10的IPG膠條得到了全范圍的蛋白質(zhì)點(diǎn)，經(jīng)過Image MasterTM 2D軟件分析共得到1 427個(gè)蛋白點(diǎn)；而pH4～7的IPG膠條只獲得了約819個(gè)蛋白點(diǎn)，明顯少，且堿性端蛋白質(zhì)點(diǎn)完全缺失，故要深入進(jìn)行差異蛋白的分析，宜選用pH3～10的IPG膠條進(jìn)行下一步研究。

第一向IEF中，聚焦電壓是電泳圖譜優(yōu)劣的關(guān)鍵因素之一。如果在設(shè)定時(shí)間內(nèi)達(dá)不到聚焦電壓，則有部分蛋白點(diǎn)無(wú)法進(jìn)入膠條中，也就影響了蛋白點(diǎn)的顯示；如果聚焦過度，則背景過深，蛋白點(diǎn)模糊。本研究設(shè)定了24 000、32 000、40 000 Vh 3個(gè)梯度進(jìn)行比較，通過Image MasterTM 2D軟件分析不同等電聚焦強(qiáng)度下的凝膠圖譜，結(jié)果表明等電聚焦時(shí)間達(dá)到32 000 Vh，背景干凈，蛋白點(diǎn)清晰，無(wú)論對(duì)于高豐度和低豐度蛋白都有較好的分離效果，而24 000 Vh時(shí)高豐度蛋白無(wú)法有效分離，低豐度蛋白則有些未能顯現(xiàn)，40 000 Vh時(shí)背景偏深，且有些蛋白點(diǎn)出現(xiàn)拖尾或粘連，不利于后面的蛋白質(zhì)分析，因此等電聚焦選擇32 000 Vh有利于24 cm的雙向電泳分析（圖5）。

通過對(duì)聚焦電壓的比對(duì)、優(yōu)化，以及研究過程中對(duì)整個(gè)等電聚焦運(yùn)行程序的反復(fù)試驗(yàn)，得出了較為優(yōu)化的IEF參數(shù)，優(yōu)化后的電泳參數(shù)見表3。

3 討論與結(jié)論

蛋白質(zhì)樣品的制備是雙向電泳的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，提取所得蛋白質(zhì)質(zhì)量的優(yōu)劣直接影響到雙向電泳的分辨率、重復(fù)性，進(jìn)而影響后續(xù)研究的開展，如質(zhì)譜分析、差異蛋白比對(duì)等。TCA/丙酮法作為目前植物組織蛋白質(zhì)提取最常用的方法，在許多植物組織上都獲得了很好的效果，但主要集中在葉片、果皮上[12-16]，而對(duì)于種子、胚性愈傷組織、花器官等的效果則相對(duì)較弱。本研究中，筆者經(jīng)過多次重復(fù)試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，TCA/丙酮法在堿端會(huì)產(chǎn)生一個(gè)暗色區(qū)域，這說明其中含有一些較高濃度的鹽離子，這些離子的存在影響了堿性端蛋白質(zhì)的分辨，不利于后期的研究。丙酮法由于步驟簡(jiǎn)單，所得干粉中可能含有雜質(zhì)，影響了蛋白的有效表達(dá)，使得IEF中聚焦不完全，從而無(wú)法得到相應(yīng)的點(diǎn)。而TCA/酚提法，從單向SDS-PAGE的效果來(lái)看，其提取的完整性較好，而且也能得到較為清晰的圖譜，但是可能由于其量較少，導(dǎo)致蛋白數(shù)目偏少，許多微量表達(dá)的蛋白沒法顯示出來(lái)。改良酚提法在研磨時(shí)加入20% PVPP可有效去除花芽中的酚、醌類、色素等物質(zhì)；并在丙酮抽提后進(jìn)行二次研磨，可使得所得粉末更細(xì)，利于后面非蛋白物質(zhì)的去除，筆者重復(fù)研究發(fā)現(xiàn)酚抽提后用SDS緩沖液重復(fù)抽提，能提高蛋白純度，使蛋白質(zhì)產(chǎn)量相應(yīng)增加，利于后期的2-DE研究。對(duì)比4種提取方法后，結(jié)果表明，改良酚抽提法更適合于‘四季蜜龍眼花芽蛋白的提取，蛋白質(zhì)含量高，質(zhì)量好，蛋白點(diǎn)能均勻地分布在凝膠上。

等電聚焦運(yùn)行程序的參數(shù)設(shè)定對(duì)2-D效果影響很大，聚焦不足或過度聚焦都會(huì)對(duì)2-D圖譜造成影響。在過往研究中，人們多數(shù)關(guān)注上升到8 000 V或10 000 V后的等電聚焦時(shí)間[17-18]。而本研究發(fā)現(xiàn)，將水化時(shí)間從10～12 h延長(zhǎng)至15 h，可提高凝膠上的蛋白點(diǎn)數(shù)，這可能是由于干膠條在低壓下充分泡漲，水化液中的蛋白盡數(shù)進(jìn)入膠條的原因。此外，在進(jìn)行聚焦程序時(shí)，將伏小時(shí)數(shù)設(shè)置到32 000 Vh，可使每個(gè)蛋白點(diǎn)清晰，所得2-D圖譜分離效果較為理想。

通過反復(fù)的試驗(yàn)比較，優(yōu)化了‘四季蜜龍眼芽總蛋白提取及雙向電泳技術(shù)：取1.0 g芽體材料，運(yùn)用改良酚提法提取，以120 μg為上樣量，選擇pH3～10長(zhǎng)度24 cm的膠條，運(yùn)用如表3的參數(shù)進(jìn)行雙向電泳，可獲得清晰的蛋白圖譜，對(duì)于‘四季蜜龍眼花芽分化機(jī)理的研究具有重要意義。

參考文獻(xiàn)

[1] Sisi Chen， Hao Liu， Wei Chen， et al. Proteomic analysis of differentially expressed proteins in longan flowering reversion buds[J]. Scientia Horticulturae， 2009（122）： 275-280.

[2] Xiangrong You， Lingxia Wang， Wenyu Liang， et al. Floral reversion mechanism in longan（Dimocarpus longan Lour.）revealed by proteomic and anatomic analyses[J]. Journal of Proteomics， 2012（75）： 1 099-1 118.

[3] 賴呈純， 賴鐘雄， 何 園， 等. 龍眼胚性培養(yǎng)物高分辨率蛋白質(zhì)雙向電泳技術(shù)[J]. 福建農(nóng)林大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版）， 2008， 37（1）： 37-41.

[4] 范海延， 陳 捷， 張春宇， 等. 適于黃瓜葉片蛋白質(zhì)組分析的雙向電泳方法最佳條件的研究[J]. 沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)， 2008， 39（3）： 365-367.

[5] Wang W， Vignani R， Scali M， et al. A universal and rapid protocol for protein extraction from recalcitrant plant tissues for proteomic analysis[J]. Electrophoresis， 2006， 27（13）： 2 782-2 786.

[6] Saravanan R S， Rose J K C. A critical evaluation of sample extraction techniques for enhanced proteomic analysis of recalcitrant plant tissues[J]. Proteom Clin App， 2004， 4（9）： 2 522-2 532.

[7] Bradford M M. A rapid and sensitivemethod for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding[J]. Anal Biochem， 1976， 72（1/2）： 248-254.

[8] Laemm Li U K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4[J]. Nature， 1970， 227： 680-685.

[9] 郭堯君. 蛋白質(zhì)電泳試驗(yàn)技術(shù)[M]. 北京， 科學(xué)出版社， 2005.

[10] 陳 偉， 游向榮， 梁文裕， 等. 龍眼成花逆轉(zhuǎn)不同時(shí)期花芽差異蛋白的研究[J]. 農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學(xué)報(bào)， 2009， 17（4）： 722-727.

[11] 龐國(guó)彩， 謝東麗， 陳清西， 等. 龍眼花芽與葉芽差異蛋白分析[J]. 熱帶亞熱帶植物學(xué)報(bào)， 2009， 17（3）： 242-248.

[12] Audrius A， Zukas Andrew P， Breksa III. Extraction methods for analysis of Citrus leaf proteins by two-dimensional gel electrophoresis[J]. Journal of Chromatography A， 2005（1078）： 201-205.

[13] Ana M. Maldonado， Sira Echevarria-Zomeno， Sylvia Jean-Baptiste， et al. Evaluation of three different protocols of protein extraction for Arabidopsis thaliana leaf proteome analysis by two-dimensional electrophoresis[J]. Journal of Proteomics， 2008（71）： 461-472.

[14] 廖英明， 徐建堂， 祈建民， 等. 紅麻細(xì)胞質(zhì)雄性不育系與保持系總蛋白提取及雙向電泳體系優(yōu)化[J]. 熱帶作物學(xué)報(bào)， 2013， 34（7）： 1 294-1 299.

[15] 裴玉賀， 白建芬， 郭新梅， 等. 玉米葉片蛋白質(zhì)雙向電泳方法的優(yōu)化[J]. 農(nóng)學(xué)學(xué)報(bào)， 2013， 3（01）： 1-5.

[16] 鄧貴明， 曾繼吾， 姜 波， 等. 柑橘葉片和果皮總蛋白質(zhì)提取及雙向電泳體系的建立[J]. 熱帶亞熱帶植物學(xué)報(bào)， 2012， 20（1）： 19-25.

[17] Jellouli N， Salem A B， Ghorbel A， et al. Evaluation of protein extraction methods for Vitis uinifera leaf and root proteome analysis by two-dimensional electrophoresis[J]. Journal of Integrative Plant Biology， 2010， 52（10）： 933-940.

[18] Lopez J. Two-dimensional electrophoresis in proteome expression analysis[J]. Journal of Chromatography B， 2007（849）： 190-202.

責(zé)任編輯：葉慶亮