魏芳等

摘 要 硫醇是橡膠樹膠乳中重要的抗氧化劑，半胱氨酸是硫醇合成的前體，亞硫酸鹽還原酶在半胱氨酸合成過程中起重要作用。從橡膠樹中克隆編碼鐵氧還型亞硫酸鹽還原酶的cDNA。結(jié)果表明：該cDNA全長(zhǎng)2 417 bp，包含2 070 bp的開放閱讀框、183 bp的5′UTR和164 bp的3′UTR，命名為HbSiR（GenBank： KF765492）。組織表達(dá)分析結(jié)果顯示：HbSiR在橡膠樹的根、葉、木質(zhì)部、樹皮及膠乳均有表達(dá)；在‘熱研8-79的膠乳中HbSiR基因的表達(dá)量高于‘PR107膠乳中的表達(dá)量，但隨著排膠時(shí)間的延長(zhǎng)，‘熱研8-79和‘PR107膠乳中HbSiR的表達(dá)量均降低。初步推測(cè)HbSiR與膠乳硫醇的含量有關(guān)。

關(guān)鍵詞 亞硫酸鹽還原酶基因；橡膠樹；硫醇

中圖分類號(hào) S794.1 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A

Cloning and Expression Analysis of HbSiR from

Rubber Tree（Hevea brasiliensis Müll. Arg）

WEI Fang1，ZHENG Qiankun2，LUO Shiqiao1，QIU Jian1，YANG Wenfeng1，

WANG Qichao2， WU Ming1， XIAO Xianzhou1*

1 Rubber Research Institute， Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences/ Key Laboratory of Biology

and Genetic Resources of Rubber Tree， Ministry of Agriculture， Danzhou， Hainan 571737， China

2 College of Agrinomy， Hainan University， Haikou， Hainan 570228， China

Abstract Thiols is an important antioxidant to laticifer sub-membrane in rubber tree latex. Cysteine is the precursor of thiols for the synthesis of methionine， glutathione and so on. Sulfite reductase（SiR） is an important enzyme for cysteine biosynthesis. A full-length cDNA coding ferredoxin-sulfite reductase from rubber tree， named HbSiR（GenBank： KF765492）， was isolated for the first time. The cDNA was 2 417 bp long， containing a 183 bp 5′UTR， a 164 bp 3′UTR and a 2 070 bp open reading frame. Analysis of expression indicated it is a constitutive gene， and the levels of gene expression was higher in Reyan 8-79 than in PR107 latex， following latex flow， the expression reduced. That inferred HbSiR is related with thiol contents in rubber tree latex.

Key words Sulfite reductase；Hevea brasiliensis；Thiols

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2014.06.008

硫醇是橡膠樹乳管亞細(xì)胞膜非酶促防御系統(tǒng)的重要抗氧化劑，膠乳中的硫醇包括谷胱甘肽、半胱氨酸、甲硫氨酸等，可抵御由于逆境和衰老所產(chǎn)生的活性氧的毒害，是乳管的保護(hù)因子和膠乳的穩(wěn)定劑之一。在無機(jī)硫同化過程中，硫酸鹽從進(jìn)入細(xì)胞到固定為有機(jī)硫化物有一套完整協(xié)同的路徑，前期的研究結(jié)果證明，橡膠樹膠乳中存在完整的硫同化途徑，首先，在質(zhì)子濃度差作用下，以硫轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（Sulfate transporter）為載體使硫酸鹽進(jìn)入胞內(nèi)[1]，其次在ATP活化能推動(dòng)下依賴ATP硫酸化酶催化硫酸鹽生成腺苷-5，-磷酰硫酸（adenosine 5，-phosphosulfate， APS）， APS激酶（APS kinase， APK）與APS還原酶（APS reductase， APR）進(jìn)一步還原，生成半胱氨酸。植物以半胱氨酸為前體，合成眾多具有重要生物學(xué)功能的代謝產(chǎn)物，直接關(guān)系到植物的逆境脅迫[2]。通過擬南芥同位素標(biāo)記跟蹤發(fā)現(xiàn)，在整個(gè)硫酸鹽還原路徑中，APR有最強(qiáng)的控制力[3]，且對(duì)硫酸鹽含量的變化具有關(guān)鍵作用[4]。

與APR相比，硫酸鹽還原路徑中另外一個(gè)還原酶——亞硫酸鹽還原酶（Sulfite reductase， SiR，EC1.8.7.1）很少引起重視，而近期研究結(jié)果證明，SiR在半胱氨酸合成代謝中有控制作用[5]。植物SiR是一種定位質(zhì)體的可溶性蛋白，SiR負(fù)責(zé)將APR還原后產(chǎn)生的亞硫酸鹽進(jìn)一步還原。在擬南芥、水稻及其他多個(gè)物種中，硫還原途徑中多數(shù)基因以家族方式存在，而擬南芥中SiR是該途徑中唯一一個(gè)單一基因編碼的蛋白，近期通過插入突變和同位素標(biāo)記研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，SiR活力降低導(dǎo)致進(jìn)入半胱氨酸和谷胱甘肽的硫含量顯著減低，同時(shí)，SiR活性的變化引起了硫酸鹽同化的主要路徑和次要路徑適應(yīng)性的變化，該研究結(jié)果認(rèn)為以上證據(jù)預(yù)示了SiR是硫酸鹽同化途徑中很重要的瓶頸之一[5]。在擬南芥中以單基因存在，可以預(yù)測(cè)其下調(diào)表達(dá)，將會(huì)嚴(yán)重影響硫同化速率，而橡膠樹需要大量還原性的硫，尤其是膠乳中，還原硫用于應(yīng)對(duì)割膠和排膠產(chǎn)生的活性氧及補(bǔ)充隨膠乳排出的硫醇化合物， 是橡膠樹硫醇合成過程中的重要酶。作為橡膠樹膠乳硫醇合成代謝研究的一部分內(nèi)容，本研究報(bào)道了橡膠樹SiR的一個(gè)cDNA序列，并分析橡膠樹膠乳和其他組織中的表達(dá)特點(diǎn)，并對(duì)膠乳硫醇存在顯著差異的2個(gè)橡膠樹無性系的膠乳轉(zhuǎn)錄表達(dá)進(jìn)行了研究，以期更好的理解亞硫酸鹽還原酶在膠乳硫醇合成中的作用。

1 材料與方法

1.1 材料

橡膠樹（Hevea brasiliensis Müell. Arg.）無性系‘熱研8-33-97、‘熱研8-79和‘PR107選自中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院試驗(yàn)場(chǎng)三隊(duì)。RNA提取試劑盒購(gòu)自百泰克公司，凝膠回收試劑盒購(gòu)自Axygen公司，反轉(zhuǎn)錄酶購(gòu)自Takara Primescript Reverse Transcriptase，引物合成由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司完成。

1.2 方法

1.2.1 RNA提取及反轉(zhuǎn)錄 提取巴西橡膠樹無性系‘熱研8-33-97的根、莖、葉膠乳混合RNA，采用紫外分光光度計(jì)檢測(cè)RNA的純度并測(cè)定濃度，瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)其完整性，反轉(zhuǎn)錄后用內(nèi)參基因18s rRNA的引物18s-F和18s-R進(jìn)行PCR檢測(cè)純度。

1.2.2 基因克隆 以cDNA為模板，SiR-F和SiR-R為引物，利用PCR擴(kuò)增已知的EST序列。PCR反應(yīng)體系共為25 μL，其中包含1×PCR buffer，200 μmol/L dNTPs，200 ng引物，3 μg cDNA 和1.5 U Taq DNA聚合酶。反應(yīng)程序?yàn)椋?8 ℃預(yù)變性3 min；98 ℃變性10 s，60 ℃退火15 s，72 ℃延伸2.5 min，35個(gè)循環(huán)；最后72 ℃延伸10 min；1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。通過RACE技術(shù)擴(kuò)增基因的全長(zhǎng)，末端加尾酶為Takara公司，接頭引物序列分別為：AUAP和AAP，5′RACE引物有SiR-a-1、SiR-a-2、SiR-a-3，全長(zhǎng)引物有SiR-qF和SiR-qR（見表1）。擴(kuò)增得到的電泳序列經(jīng)過凝膠回收試劑盒（Axygen）純化回收后連接到pMD 18-T（Takara）載體上，并送上海英俊生物技術(shù)有限公司測(cè)序。

1.2.3 序列分析及功能預(yù)測(cè) 利用Clustal1.83軟件分析該序列編碼氨基酸和其他植物比較分析。用TargetP進(jìn)行亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)分析。

1.2.4 表達(dá)分析 提取橡膠樹根、莖、葉膠乳RNA，調(diào)整RNA濃度，反轉(zhuǎn)錄為cDNA；提取橡膠樹開割3 a無性系‘熱研8-79和‘PR107割膠后不同時(shí)間段膠乳RNA，調(diào)整RNA濃度，反轉(zhuǎn)錄為cDNA。以18s為引物，利用PCR擴(kuò)增檢測(cè)cDNA的完整性，并利用2%瓊脂糖凝膠電泳調(diào)整濃度，使各個(gè)cDNA模板量一致。用調(diào)整好的cDNA模板檢測(cè)SiR基因的表達(dá)，引物序列為SiR-QF和SiR-QR。

2 結(jié)果與分析

2.1 HbSiR基因的序列分析

根據(jù)已知的EST序列，5′RACE結(jié)果得到N端非翻譯區(qū)183 bp，電子克隆拼接后C端非翻譯區(qū)164 bp，經(jīng)SiR-qf、SiR-qR引物驗(yàn)證后，命名為HbSiR，該序列具有完整的開放閱讀框，GenBank登陸號(hào)：KF765492。HbSiR經(jīng)GenBank比對(duì)后，該序列與蓖麻亞硫酸鹽還原酶基因（XM_002513449.1）的相似度為89%。

2.2 氨基酸序列分析

根據(jù)核苷酸序列推導(dǎo)，HbSiR基因序列編碼689個(gè)氨基酸，預(yù)測(cè)其蛋白分子量為70 ku，與其他幾種植物比較具有高度保守性（圖1）。用TargetP軟件分析預(yù)測(cè)，推導(dǎo)該氨基酸序列極有可能定位于葉綠體，且沒有信號(hào)肽存在，不屬于分泌蛋白。同時(shí)該氨基酸序列也不存在單子葉N端特異的EVKRSKVEI序列，與擬南芥比較發(fā)現(xiàn)，推導(dǎo)的氨基酸序列也有4個(gè)保守半胱氨酸殘基（Cys499、Cys505、Cys545、Cy549）和組成氫鍵網(wǎng)的4個(gè)氨基酸殘基（Arg130、Arg199、Lys281、Lys283）。另外，HbSiR還存在鐵硫簇結(jié)合位點(diǎn)。

系統(tǒng)樹構(gòu)建分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)， 與水稻（Oryza sativa AAU90241.1）、蓖麻（Ricinus communis XP_002513495.1）、 玉米（Zea mays BAA23641.1）、煙草（Nicotiana tabacum BAA33531.1）、擬南芥（Arabidopsis thaliana CAA89154.1）、 魚腥藻（Anabaena variabilis ABA24640.1）、 蘆筍（Asparagus officinalis ABB55339.1）、 二穗短柄草（Brachypodium distachyon XP_003568157.1）、 大豆（Glycine max XP_003540209.1）、甘紫菜（Porphyra purpurea AAP97125.1）、豌豆（Pisum sativum BAD12837.2）、西紅柿（Solanum lycopersicum AFB83709.1）和葡萄（Vitis vinifera XP_002285398.1）進(jìn)行比較，結(jié)果顯示HbSiR與雙子葉植物的親緣關(guān)系較近，尤其是同屬大戟科的蓖麻，而與幾個(gè)禾本科的單子葉植物的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)（圖2）。亞硫酸鹽還原酶與同科植物之間關(guān)系較近，雙子葉植物與單子葉植物之間關(guān)系較遠(yuǎn)的結(jié)果，與McManus等[6]的研究結(jié)果相同。

2.3 組織表達(dá)分析

在橡膠樹根、葉、木質(zhì)部、樹皮及膠乳中均檢測(cè)到了HbSiR基因的表達(dá)，說明該基因?qū)儆诮M成型表達(dá)，但其表達(dá)量在不同組織中不一樣，膠乳中表達(dá)量最低，木質(zhì)部和樹皮中表達(dá)量較高（圖3）。

2.4 不同排膠時(shí)間表達(dá)分析

橡膠樹無性系‘熱研8-79膠乳硫醇含量高于‘PR107[7]，在膠乳硫醇含量存在顯著差異的這2個(gè)無性系的不同排膠時(shí)間均檢測(cè)到HbSiR基因的表達(dá)，說明HbSiR基因與硫醇的含量有關(guān)。半定量表達(dá)結(jié)果表明，在表達(dá)趨勢(shì)方面，排膠初始階段，HbSiR基因表達(dá)量較高，隨著排膠時(shí)間的延長(zhǎng)，膠乳中HbSiR基因的表達(dá)量降低，甚至‘PR107在排膠30 min后未檢測(cè)到表達(dá)；2個(gè)無性系之間進(jìn)行比較，結(jié)果顯示‘熱研8-79排膠過程的各個(gè)階段膠乳中HbSiR基因的表達(dá)均高于‘PR107。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析結(jié)果表明，在排膠的各個(gè)時(shí)期，2個(gè)無性系之間HbSiR基因的表達(dá)差異顯著（圖4）。

3 討論與結(jié)論

擬南芥中SiR由一個(gè)單拷貝基因編碼[1，8]，從整個(gè)硫醇合成途徑各個(gè)酶的統(tǒng)籌合作分析，亞硫酸鹽還原過程在硫同化中是一個(gè)受到高度調(diào)節(jié)的步驟，硫素供應(yīng)調(diào)節(jié)的不同引起SiR轉(zhuǎn)錄豐度的變化[9]，SiR活力降低導(dǎo)致進(jìn)入半胱氨酸和谷胱甘肽的硫含量顯著減低[5]。類似的研究也在玉米葉片抗凍脅迫上得到了驗(yàn)證[10]。經(jīng)比對(duì)認(rèn)為HbSiR存在鐵硫簇，4個(gè)保守的半胱氨酸殘基（Cys499、Cys505、Cys545、Cy549）連接著鐵硫簇和siroheme[11-12]。N端特異EVKRSKVEI序列只在單子葉植物中存在[13]，如圖1序列中水稻和玉米、橡膠樹和其他擬南芥等雙子葉植物未發(fā)現(xiàn)該序列。另外，在HbSiR中存在2個(gè)保守序列，第一個(gè)保守序列為C503PAFPLC509（擬南芥中氨基酸順序），比對(duì)發(fā)現(xiàn)，擬南芥和煙草中的該序列是相同的，玉米、水稻是用L（亮氨酸）代替了F506，而橡膠樹的此序列是M（甲硫氨酸）代替了F506；第二個(gè)保守序列為TGC549PNGC553ARP（擬南芥中氨基酸順序），HbSiR用S（絲氨酸）代替了A554（丙氨酸）。

組織特異性表達(dá)結(jié)果顯示，HbSiR基因在各個(gè)組織中均有表達(dá)。這種組成型表達(dá)在其他研究中已經(jīng)得到廣泛的認(rèn)同[6]。在對(duì)洋蔥的研究中亞硫酸鹽還原酶基因存在假基因，然而假基因的組織特異性表達(dá)差異很大[6]，本研究克隆得到的HbSiR基因存在完整的開放閱讀框及完整的SiR保守結(jié)構(gòu)域，且在不同組織中表達(dá)差異不顯著。經(jīng)過預(yù)測(cè)HbSiR基因定位于葉綠體，為了參與硫酸鹽還原途徑，在所有光合器官和非光合器官中，SiR都定位在質(zhì)體[14-15]。綜合以上2點(diǎn)，筆者認(rèn)為克隆得到的基因?qū)儆诒磉_(dá)型基因。

半胱氨酸是硫醇合成的前體，SiR基因在半胱氨酸合成過程中發(fā)揮著重要作用。半胱氨酸合成的過程也是硫醇合成過程的一部分，關(guān)于SiR與整個(gè)硫醇含量的關(guān)系尚未有研究公開發(fā)表。在橡膠樹中，半胱氨酸、甲硫氨酸、谷胱甘肽等組成了膠乳的硫醇系統(tǒng)，硫醇是膠乳中黃色體的穩(wěn)定劑，黃色體原位破損與乳管內(nèi)活性氧的產(chǎn)生有關(guān)，硫醇能阻斷各種形式活性氧的形成，或催化活性氧轉(zhuǎn)化為非毒物質(zhì)，阻止或延緩黃色體膜降解，保護(hù)黃色體及其他細(xì)胞器的完整性，防止膠乳原位凝固，利于橡膠樹排膠[16]。由于‘PR107與‘熱研8-79在初產(chǎn)期的膠乳中硫醇含量差異較大，本研究選擇這2種開割3 a的無性系膠乳進(jìn)行基因表達(dá)分析。不同排膠時(shí)間內(nèi)HbSiR在排膠順暢的‘熱研8-79中表達(dá)量均高于‘PR107，表達(dá)量與硫醇含量具有相關(guān)性，據(jù)此推測(cè)HbSiR對(duì)膠乳中高硫醇含量有貢獻(xiàn)。

從橡膠樹中克隆得到亞硫酸鹽還原酶基因，命名為HbSiR，編碼689個(gè)氨基酸，預(yù)測(cè)定位于葉綠體中，在木質(zhì)部、樹皮、葉片和根中均有表達(dá)，在硫醇含量高的‘熱研8-79膠乳中表達(dá)量高于硫醇含量低的‘PR107，HbSiR基因與膠乳硫醇含量有關(guān)。

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責(zé)任編輯：黃東杰