鐘云芳等

摘 要 運(yùn)用ISSR分子標(biāo)記技術(shù)，分析海南島石灰?guī)r地區(qū)海南鳳仙花自然種群的遺傳結(jié)構(gòu)，比較3個(gè)海拔梯度對(duì)種群遺傳結(jié)構(gòu)的影響。結(jié)果顯示，13個(gè)ISSR引物的擴(kuò)增結(jié)果顯示其多態(tài)性位點(diǎn)百分率為97.7%。AMOVA分析表明：海南鳳仙花自然種群的變異主要來(lái)自種群內(nèi)（92%），而種群間變異較少（8%）；中海拔種群的遺傳多樣性最為豐富；而高海拔種群的遺傳多樣性則較低；種群的遺傳距離和地理距離表現(xiàn)出顯著的高度相關(guān)性。說(shuō)明海拔是影響種群基因流的重要因素，高海拔種群可以向中低海拔種群進(jìn)行傳播花粉和種子等基因流動(dòng)，而中低海拔種群向高海拔種群進(jìn)行類似的基因流動(dòng)則較為困難，海南鳳仙花數(shù)量較少的主要原因可能來(lái)自于其生境的限制。因此在以后的保護(hù)工作中要特別注重其生境的保護(hù)，避免人為因素的破壞。

關(guān)鍵詞 海南鳳仙花；遺傳標(biāo)記；海拔梯度；瀕危機(jī)制

中圖分類號(hào) Q948.12.2 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A

ISSR Analysis on Population Genetic Diversity of Impatiens hainanensis Balsaminaceae， an Endemic

Species to Hainan Island

ZHONG Yunfang1，3， HU Xiangyu1，2， SONG Xiqiang1，2， ZHOU Zhaode1，3 *

1 Key Laboratory of Protection and Developmental Utilization of Tropical Crop Germplasm Resources（Hainan University），

Ministry of Education， Haikou， Hainan 570228， China

2 College of Horticulture and Landscape Architecture， Hainan University， Haikou， Hainan 570228， China

3 College of Agronomy， Hainan University， Haikou， Hainan 570228， China

Abstract Impatiens hainanensis is endemic to Hainan Island. Its number of plants is very low and habitat is easily damaged. This research used the ISSR molecular marker technology to analysis the genetic diversity of Impatiens hainanensis population and compared the effects of three elevation gradients on population genetic structure. The results indicated that： 13 ISSR primers amplification results showed that the polymorphism loci percentage is 97.7%； AMOVA analysis indicated that the variation of Impatiens hainanensis population occurred mainly within populations（92%）and limitedly between populations（8%）； Altitude populations in the most abundant genetic diversity； The high altitude population genetic diversity is low； genetic distance and geographic distance of population showed a significantly high specificity. Analysis shows that altitude is the important factors that affect the population gene flow， high altitude populations can be spread pollen and seeds to the low altitude populations， the similar activity from low altitude populations to high altitude populations is more difficult， the main reason for the small number of Impatiens hainanensis plants came from its habitat. So in the future for protection work， we should put special emphasis on the habitat protection and avoid the destruction of the human factors.

Key words Impatiens hainanensis； Genetic markers； Altitude gradient； Endangered mechanism

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2014.06.001

遺傳多樣性是生物多樣性的核心，保護(hù)生物多樣性最終是要保護(hù)遺傳多樣性[1]。通常，遺傳多樣性最直接的表現(xiàn)形式就是遺傳變異水平的高低。對(duì)任何一個(gè)物種來(lái)說(shuō)，個(gè)體的生命很短暫，由個(gè)體構(gòu)成的且在時(shí)間上連續(xù)不斷的種群或種群系統(tǒng)（宗、亞種、種），才是進(jìn)化的基本單位[2-3]。對(duì)于種群內(nèi)或者種群間以及種內(nèi)或者種間遺傳多樣性的鑒定和評(píng)估，分子標(biāo)記已經(jīng)被證明是一種較好的方法[4]，不同變異的級(jí)別需要不同的分子標(biāo)記方法[5-6]。ISSR （Inter-Simple Sequence Repeat）分子標(biāo)記，又稱簡(jiǎn)單重復(fù)序列區(qū)間，其原理是利用真核生物基因組內(nèi)廣泛存在的簡(jiǎn)單重復(fù)序列，設(shè)計(jì)單一通用引物對(duì)基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)較高濃度的瓊脂糖凝膠電泳或者聚丙烯酰胺凝膠電泳分離獲得擴(kuò)增指紋圖，從而可以揭示樣本間的遺傳多樣性[7-8]。ISSR技術(shù)克服了RAPD（random amplified polymorphic DNA）的低再現(xiàn)性、AFLP（amplified fragment length polymorphism）的高耗費(fèi)以及SSR（Simple Sequence Repeat）必須知道兩側(cè)基因序列等因素的限制[9]。此外其高度多態(tài)性以及快速性等特點(diǎn)[10-12]無(wú)疑為其在高等植物研究中提供了廣闊的應(yīng)用前景[10]。近年來(lái)，ISSR分子標(biāo)記技術(shù)廣泛應(yīng)用于包括遺傳多樣性、系統(tǒng)發(fā)生學(xué)以及進(jìn)化生物學(xué)等研究[13]。何俊等[14]通過(guò)ISSR技術(shù)對(duì)多葉重樓3個(gè)變種共8個(gè)居群進(jìn)行了遺傳多樣性分析，結(jié)果表明，各個(gè)居群的遺傳多樣性較高，滇重樓與狹葉重樓有較近的親緣關(guān)系；曹國(guó)艷[15]使用ISSR分子標(biāo)記進(jìn)行木蘭科含笑屬及其相關(guān)屬的系統(tǒng)發(fā)育分析，結(jié)果顯示，木蓮屬和木蘭屬的皺種組與天女木蘭組親緣關(guān)系較近，建議重新界定木蘭屬范圍，并成立玉蘭屬，建議將合果木屬歸入含笑屬，建議取消含笑屬下亞屬和組的劃分，設(shè)為含笑屬；龔漢雨等[16]使用31個(gè)ISSR引物對(duì)山羊草屬Aegilops多倍體植物及其祖先二倍體的基因組進(jìn)行了分析，結(jié)果表明，與其二倍體祖先種相比，異源多倍體物種的基因組發(fā)生了很大變化。

海南鳳仙花（Impatiens hainanensis Y. L. Chen）是海南特有植物，主要分布在海南昌江縣、東方市等地區(qū)的石灰?guī)r山頂，多見(jiàn)于裸露石灰?guī)r縫隙[17]。近年來(lái)由于人類活動(dòng)的影響，海南鳳仙花的種群數(shù)量和分布面積呈減少趨勢(shì)，再加上島嶼特有種本身分布范圍的局限、生境脆弱且種群數(shù)量較少，更易于瀕?；驕缃^[18-19]，海南鳳仙花已被列為海南省級(jí)重點(diǎn)保護(hù)植物[20]。本研究采用ISSR分子標(biāo)記技術(shù)，研究海南鳳仙花的種群遺傳多樣性水平以及數(shù)量稀缺的主要原因，海拔高度以及地理距離對(duì)于海南鳳仙花種群遺傳多樣性的影響。

1 材料與方法

1.1 材料采集與處理

研究區(qū)域?yàn)楹Ｄ鲜〔枳遄灾慰h王下鄉(xiāng)和東方市江邊鄉(xiāng)峨賢嶺地區(qū)（圖1所示為海南鳳仙花種群區(qū)位），記錄海南鳳仙花自然種群分布的經(jīng)緯度、海拔和生境（表1）。實(shí)驗(yàn)材料為海南鳳仙花（I. hainanensis）葉片，每個(gè)種群采集14～30個(gè)植株，平均采樣，以每個(gè)植株的2～3個(gè)葉片為一個(gè)樣本，采集后立即放入盛有干燥硅膠的封口袋內(nèi)，每隔3～5 h翻動(dòng)硅膠，確保24 h內(nèi)干燥完全。

1.2 方法

1.2.1 基因組DNA提取及純度檢測(cè) 采集后的葉片用液氮研磨，并用CTAB法進(jìn)行提取，瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)提取DNA的質(zhì)量，電壓120 V電泳30 min。紫外分光光度計(jì)法計(jì)算所得DNA的濃度和純度。

1.2.2 ISSR-PCR擴(kuò)增體系 采用20 μL擴(kuò)增體系：DNA 25 ng，Taq酶1 U，Mg2+ 1.5 mmol/L，dNTP 0.2 mmol/L，Primer 1.0 μmol/L。擴(kuò)增程序：94 ℃變性5 min；94 ℃變性30 s，退火30 s，72 ℃延伸1.5 min，35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸7 min，4 ℃保存。PCR產(chǎn)物使用1.6%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

1.2.3 ISSR-PCR引物篩選 以加拿大哥倫比亞大學(xué)（UBC）公布的100套引物進(jìn)行篩選（Http：//www.biotech.ubc.ca/services/naps/primers/Primers.pdf）。每個(gè)種群選擇3個(gè)模板，篩選出13條擴(kuò)增條帶較多、信號(hào)強(qiáng)、背景清晰的引物（表2）。

1.3 數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)與分析

13條引物對(duì)各個(gè)居群進(jìn)行擴(kuò)增之后，采用人工讀帶，根據(jù)條帶的遷移率和有無(wú)記錄二元數(shù)據(jù)，有帶記為1，無(wú)帶記為0。排除模糊不清的帶和無(wú)法準(zhǔn)確標(biāo)識(shí)的帶。用POPGENE 1.32軟件計(jì)算種群遺傳多樣性和遺傳分化等指數(shù)，并用UPGMA進(jìn)行聚類分析。應(yīng)用GenAlEx 6.41（Genetic Analysis in Excel）軟件對(duì)種群內(nèi)和種群間的遺傳變異進(jìn)行分子變異分析（AMOVA）。

2 結(jié)果與分析

2.1 種群遺傳多樣性分析

13條引物對(duì)來(lái)自不同地點(diǎn)的種群共計(jì)182個(gè)樣本DNA進(jìn)行擴(kuò)增，共擴(kuò)增出87個(gè)位點(diǎn)，其中多態(tài)性位點(diǎn)85個(gè)（表2），多態(tài)性位點(diǎn)百分率（P）為97.7%。

高海拔種群的Neis基因多樣性（He）數(shù)值在0.291 0～0.378 1之間，平均值為0.323 5，而中低海拔的種群的Neis基因多樣性（He）數(shù)值在0.388 5～0.395 8之間，平均值為0.391 3，最大值與最小值分別出現(xiàn)在Pop4（0.395 8）和Pop2（0.291 0）（表3），高海拔種群和低海拔種群的Neis基因多樣性（He）差異顯著。

與Neis基因多樣性（He）相似，高海拔種群的Shannon信息指數(shù)（Ho）數(shù)值在0.439 0～0.558 4之間，平均值為0.489 4，而中低海拔種群的Shannon信息指數(shù)（Ho）數(shù)值在0.571 4～0.578 4之間，平均值為0.573 1，最大值和最小值同樣出現(xiàn)在Pop4（0.578 4）和Pop1（0.439 0）（表3），高海拔種群和低海拔種群的Shannon信息指數(shù)（Ho）差異顯著。

2.2 種群遺傳結(jié)構(gòu)

2.2.1 種群遺傳分化 遺傳變異主要發(fā)生在種群內(nèi)部。種群總基因多樣度（Ht）為0.422 2，其中種群內(nèi)的基因多樣度（Hs）為0.366 8；種群間的遺傳分化系數(shù)（Gst）為0.131 1，即86.9%遺傳分化發(fā)生在種群內(nèi)部；而13.1%的遺傳分化發(fā)生在種群間，表明種群間具有一定水平的遺傳分化，大部分的遺傳變異主要發(fā)生在種群內(nèi)部（表4）。AMOVA分析表明，種群內(nèi)部和種群間均存在顯著的遺傳分化（P=0.010），種群間遺傳變異占總遺傳變異的8%，種群內(nèi)占92%（表5）。上述結(jié)果與POPGENE分析基本一致。

2.2.2 基于遺傳一致度的聚類分析 根據(jù)Nei的方法，計(jì)算Nei遺傳距離及遺傳一致度。采樣區(qū)域的海南鳳仙花自然種群之間的遺傳距離變化范圍為0.004 6～0.221 7之間（表6），平均遺傳距離為0.122 1。從UPGMA聚類法得到的遺傳關(guān)系圖（圖2）可看出，pop1種群和pop2種群聚類在一起，pop6種群和pop7種群聚類在一起；pop3種群遺傳關(guān)系與其他6個(gè)種群遺傳距離最遠(yuǎn)。

2.2.3 遺傳距離與地理距離的相關(guān)性分析 根據(jù)種群經(jīng)緯度在谷歌地球中測(cè)量2個(gè)種群之間的位置（表7），海南鳳仙花自然種群之間的遺傳距離和地理距離呈現(xiàn)顯著的高度相關(guān)性，相關(guān)系數(shù)r=0.952（p<0.01），暗示著地理距離可能是限制海南鳳仙花自然種群間基因流動(dòng)的重要因素。

3 討論與結(jié)論

3.1 海南鳳仙花的遺傳多樣性

海南鳳仙花種群的多態(tài)性位點(diǎn)百分率高達(dá)97.7%，遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過(guò)雙子葉植物平均值44.8%，由此可知，海南鳳仙花種群具有較高的遺傳多樣性水平[21]。海南鳳仙花自然種群中低海拔的遺傳多樣性遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于高海拔梯度的種群（表3），這一結(jié)果與北京東靈山柴胡在中低海拔種群的遺傳變異高于高海拔種群一致，可能是由于隨著海拔升高，光照、溫度和水分等環(huán)境因素變化所致[22]。這種有限地理范圍內(nèi)的種群變異主要來(lái)自于生境選擇壓力[23-24]。海南鳳仙花高海拔種群生境較為單一，環(huán)境趨于極端，相應(yīng)的其群落組成也較為單一；而中低海拔種群的生境異質(zhì)性高，其植物群落組成較復(fù)雜，選擇壓力大，因此也就表現(xiàn)出較高的變異。不同海拔種群變異不同的原因一方面可能是環(huán)境因子的變化導(dǎo)致，另一方面可能是因?yàn)榈秃０蔚貐^(qū)向高海拔地區(qū)的基因流動(dòng)較為困難，其基因流限制在相似海拔高度的種群，而高海拔地區(qū)向低海拔地區(qū)的基因流則較為容易[25]。

3.2 海南鳳仙花的遺傳結(jié)構(gòu)

種群間分化與環(huán)境因子的選擇和基因流的阻隔有關(guān)，生態(tài)小環(huán)境的變異可導(dǎo)致不同種群間在遺傳結(jié)構(gòu)上的顯著差異[26]。種群間變異越大，該物種適應(yīng)環(huán)境的能力越強(qiáng)[27]。海南鳳仙花種群的變異主要來(lái)自種群內(nèi)（92%），而種群間變異較小（8%），說(shuō)明海南鳳仙花種群的環(huán)境適應(yīng)性較低。種群遺傳距離和地理距離之間的關(guān)系現(xiàn)在還沒(méi)有比較確切的定論。種群遺傳距離和地理距離在一些研究中表現(xiàn)為顯著的正相關(guān)關(guān)系[28-31]，但也有研究得到了相反的結(jié)論[32-34]。本研究結(jié)果表明，海南鳳仙花自然種群的遺傳距離和地理距離具有高度的相關(guān)性，這可能是因?yàn)榛ǚ酆头N子的傳播受到了昆蟲(chóng)飛行距離和種群生境片段化影響所致。海南鳳仙花種群海拔較高，種群之間由于地形的限制，從而出現(xiàn)了生境的片段化，而生境片段化的另一結(jié)果則是對(duì)昆蟲(chóng)傳粉距離的限制，因此海南鳳仙花種群的地理距離可以在某一程度上反應(yīng)其種群的遺傳距離。

3.3 海南鳳仙花瀕危機(jī)制及其資源保護(hù)

海南鳳仙花種群生境較為單一，種群間的變異較小，說(shuō)明海南鳳仙花自然種群之間的基因流動(dòng)較少。因此限制海南鳳仙花種群發(fā)展的重要原因來(lái)自于地形因素和其自身生境，具體表現(xiàn)為種群生境的片段化以及生境結(jié)構(gòu)的單一性。針對(duì)海南鳳仙花種群植株較少這一現(xiàn)象，一方面要著重保護(hù)其棲息地和生境免受人為因素的破壞，進(jìn)行就地保護(hù)，更好地保護(hù)其群體的遺傳特性。另一方面還可結(jié)合遷地保護(hù)和再引入，通過(guò)種群間人工授粉的方法提高其基因流，以促進(jìn)其種群的發(fā)展。

致 謝 海南省霸王嶺國(guó)家自然保護(hù)區(qū)王進(jìn)強(qiáng)助理工程師、海南大學(xué)園藝園林學(xué)院張哲和武華周同學(xué)參與了部分野外調(diào)查工作，特致謝忱！

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責(zé)任編輯：趙軍明