張濤等

摘 要 番木瓜畸形花葉病毒（Papaya leaf distortion mosaic virus，PLDMV）是一種已對(duì)番木瓜種植業(yè)構(gòu)成潛在威脅的新型病害，在轉(zhuǎn)基因植物備受爭(zhēng)議的背景下，利用原核表達(dá)的dsRNA來防控病毒的策略不失為一種新的選擇。本文選取PLDMV CP基因全長(zhǎng)（879 bp），運(yùn)用OZ-LIC法構(gòu)建了含有pdk內(nèi)含子的ihpRNA結(jié)構(gòu)，將其嵌入原核表達(dá)載體pSP73中，并轉(zhuǎn)化RNaseⅢ缺陷型大腸桿菌M-Jm109LacY，構(gòu)建了1種能高表達(dá)dsRNA的原核表達(dá)菌株M-Jm109LacY-CP879，以終濃度為0.4 mmol/L IPTG誘導(dǎo)后能夠穩(wěn)定高效的表達(dá)CP879-dsRNA。研究共設(shè)2個(gè)處理：保護(hù)性處理與治療性處理。分別用含有CP879-dsRNA的粗提液對(duì)這2個(gè)處理的番木瓜植株進(jìn)行噴施處理，通過統(tǒng)計(jì)發(fā)病率、觀察病癥變化以及ELISA分析結(jié)果表明，保護(hù)性處理能有效抑制番木瓜畸形花葉病毒的侵染，主要表現(xiàn)為發(fā)病時(shí)間推遲和相對(duì)較低的發(fā)病率；治療性處理植株的病毒積累量會(huì)在噴施后第3～12天內(nèi)出現(xiàn)暫時(shí)性的降低。結(jié)果表明，保護(hù)效果優(yōu)于治療效果，若每月噴施2～3次dsRNA粗提液，有望能夠有效地預(yù)防PLDMV的侵染。

關(guān)鍵詞 番木瓜畸形花葉病毒；原核表達(dá)；dsRNA；RNA沉默

中文分類號(hào) S667.97 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A

Abstract Papaya leaf distortion mosaic virus（PLDMV）is a potential threat to papaya cultivation. Nowadays， transgenic plants is highly controversial， and using the prokaryotic expressed dsRNA to control the virus could be a new choice. The full length of PLDMV CP gene（879 bp）was chosen to construct a hairpin RNA structure which contains pdk intron by OZ-LIC method. After the coding structure of hairpin RNA inserted into the prokaryotic expression plasmid of pSP73， the recombinant vector was transformed into the RNaseⅢ-deficient Escherichia coli strain of M-Jm109LacY. Then a prokaryotic expression strain with high expression level of CP879-dsRNA was successfully constructed， named M-Jm109LacY-CP879. The recombinant E. coli strain could express CP879-dsRNA stably when induced with IPTG at 0.4 mmol/L. There are two assays in this study：a protective resistance assay and a therapeutic resistance assay. In the protective assay， CP879-dsRNA was used to spray onto the plant leaves before inoculation of PLDMV. The disease incidence， symptom change and ELISA analysis results revealed that the CP879-dsRNA could inhibit the virus' accumulation. In the therapeutic assay， CP879-dsRNA was used to spray onto the plants that had been inoculated with PLDMV after 25 days. ELISA analysis results showed that the virus accumulation declined temporarily during the 3th to 12th day after spraying with CP879-dsRNA.The results showed that the effect of protective treatment was better than that of therapeutic treatment. If sprayed with CP879-dsRNA two or three times a month， the plants may be able to prevent PLDMV infection.

Key words Papaya leaf distortion mosaic virus（PLDMV）； Prokaryotic expression system； dsRNA； RNA silencing

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2014.07.028

番木瓜畸形花葉病毒（Papaya leaf distortion mosaic virus，PLDMV）為馬鈴薯Y病毒屬（Portyvirus）病毒，于1954年在日本沖繩島北部地區(qū)首次發(fā)現(xiàn)，起初因其所引發(fā)的病癥與番木瓜環(huán)斑病毒（Papaya ringspot virus，PRSV）相似，沖繩島上的木瓜病一度被認(rèn)為是由PRSV引起的，不過進(jìn)一步的電子顯微鏡和血清學(xué)研究揭示出其是馬鈴薯Y病毒屬中的一種新病毒，隨后被命名為番木瓜畸形花葉病毒[1]。之后在美國塞班島[2]、中國臺(tái)灣[2]和海南[3]等地也相繼被發(fā)現(xiàn)。該病毒是繼PRSV之后發(fā)現(xiàn)的又一種極具毀滅性的番木瓜病害之一，另外因其能夠侵染抗PRSV的轉(zhuǎn)基因番木瓜，故其對(duì)木瓜種植業(yè)發(fā)展已構(gòu)成了潛在的威脅[4]。利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)培育同時(shí)能抗PRSV和PLDMV的番木瓜植株為最有效的方法[5]，但由于公眾對(duì)轉(zhuǎn)基因農(nóng)作物的安全性一直心存疑慮，其市場(chǎng)推廣依然存在著極大阻礙。因此，研發(fā)一種安全有效的PLDMV防控新策略具有重大意義。

RNA沉默（RNA scilencing）是生物體外源或內(nèi)源的dsRNA進(jìn)入到細(xì)胞中，特異性的降解與其同源的mRNA，從而抑制相關(guān)基因表達(dá)的現(xiàn)象[6]。這為植物能有效的對(duì)抗病毒帶來了新的曙光[7]。雙鏈RNA（dsRNA）在RNA沉默中扮演著極為關(guān)鍵的角色，只有較大劑量的dsRNA才能誘導(dǎo)RNA沉默的發(fā)生[8]。國內(nèi)外大量研究表明，利用原核表達(dá)的dsRNA能夠有效保護(hù)植物不被病毒侵染，且相對(duì)于能表達(dá)dsRNA的轉(zhuǎn)基因抗病毒植物更加安全、便捷。最初的研究是由Tenllado等[9]發(fā)起的，該研究團(tuán)隊(duì)用辣椒輕斑駁病毒（Peppermild mottle virus，PMMoV）復(fù)制酶基因的部分序列（IR54），構(gòu)建了能表達(dá)ihpRNA結(jié)構(gòu)的原核表達(dá)載體pGEM/IR54，并將其轉(zhuǎn)化HT115（DE3）菌株來構(gòu)建其原核表達(dá)體系，然后用經(jīng)IPTG誘導(dǎo)過的重組菌株制備成高壓細(xì)胞破碎液，直接噴施到煙草上，可使煙草在一定時(shí)期內(nèi)對(duì)PMMoV產(chǎn)生抗性。張德詠等[10]用黃瓜花葉病毒（Cucumber mosaic virus，CMV）AN株系的CP基因作為中間間隔序列，構(gòu)建了含有CMV P3613株系MP基因的ihpRNA原核表達(dá)載體，并轉(zhuǎn)化HT115（DE3）菌株，用其超聲波破碎液噴灑煙草，分別進(jìn)行保護(hù)性處理和治療性處理，能起到較好的保護(hù)效果，抗病效率分別為為55%和25%。Yin等[11]利用煙草花葉病毒（Tobacco mosaic virus，TMV）CP基因構(gòu)建了原核表達(dá)載體pGEM-CP480并轉(zhuǎn)化M-JM109lacY菌株，將表達(dá)得到的dsRNA與TMV混合接種到煙草葉片上，結(jié)果僅有40%的植株發(fā)病。Gan等[12]利用pUCCRNAi載體構(gòu)建了含有甘蔗花葉病毒（Sugarcane mosaic virus，ScMV）CP基因部分序列的發(fā)卡RNA結(jié)構(gòu)，并轉(zhuǎn)化HT115（DE3）菌株，將相應(yīng)的dsRNA粗提液噴施到玉米植株上，能有效誘導(dǎo)玉米抵御ScMV的侵染。鄭海剛等[13]將原核表達(dá)的dsRNA通過摩擦接種法，誘導(dǎo)了黃瓜綠斑駁花葉病毒（Cucumber green mottle mosaic virus，CGMMV）的抗性，抗病效率為40%。楊國峰等[14]構(gòu)建了番木瓜環(huán)斑病毒PRSV HC-Pro基因的dsRNA原核表達(dá)體系，并用其高壓細(xì)胞破碎液直接噴施番木瓜植株，能高效誘導(dǎo)番木瓜植株對(duì)PRSV產(chǎn)生抗性，抗病效率達(dá)到50%。本研究利用OZ-LIC[15]（One-step，zero-background ligation-independent cloning）法構(gòu)建了PLDMV外殼蛋白（coat protein，CP）基因全長(zhǎng)dsRNA的原核表達(dá)體系，并用dsRNA高壓細(xì)胞破碎液對(duì)番木瓜植株分別進(jìn)行保護(hù)性處理和治療性處理，以探究在體外利用原核表達(dá)的dsRNA生物制劑防治番木瓜畸形花葉病毒的可行性。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 植物材料 株高25 cm左右的‘穗中紅48（Suizhonghong-48）非轉(zhuǎn)基因番木瓜健康組培苗，由本實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)保存。

1.1.2 質(zhì)粒與菌株 RNaseⅢ缺陷型大腸桿菌M-Jm109LacY為朱常香教授（山東農(nóng)業(yè)大學(xué)）惠贈(zèng)。pRNAi-LIC載體由劉玉樂教授（清華大學(xué)）惠贈(zèng)。番木瓜畸形花葉病毒海南株（PLDMV-HN-DF）由本實(shí)驗(yàn)室分離保存。含有PLDMV全長(zhǎng)的cDNA克?。℅enBank登錄號(hào)：JX974555.1）由本實(shí)驗(yàn)室保存。pSP73原核表達(dá)載體購自Promega公司。

1.1.3 主要試劑和酶 Pyrobest DNA Polymerase高保真酶，DNA回收試劑盒、質(zhì)粒小量提取試劑盒購自寶生物工程（大連）有限公司，T4 DNA聚合酶以及各種限制性內(nèi)切酶購自Fermentas公司，2×Eco Taq Super PCR Mix，Trance10感受態(tài)細(xì)胞購自北京全式金生物技術(shù)有限公司，Trizol試劑購自Ambion公司，ELISA檢測(cè)所用的PLDMV CP兔抗血清由本實(shí)驗(yàn)室制備，酶標(biāo)抗體堿性磷酸酯酶羊抗兔IgG購自北京博奧森生物技術(shù)有限公司。其它試劑為國產(chǎn)分析純。

1.2 方法

1.2.1 引物設(shè)計(jì) 引物設(shè)計(jì)參照OZ-LIC法進(jìn)行，引物序列中用虛線標(biāo)記部分為與pRNAi載體上相對(duì)應(yīng)的接頭序列（LIC1～4），引物序列中用實(shí)線標(biāo)記部分為引入的酶切位點(diǎn)，這是為了便于將發(fā)卡結(jié)構(gòu)從pRNAi-LIC載體上切下，并轉(zhuǎn)接到pSP73原核表達(dá)載體上而設(shè)計(jì)的，筆者分別在2個(gè)將要擴(kuò)增的目的片段的5′端設(shè)計(jì)了2個(gè)限制性酶切位點(diǎn)：XhoⅠ和KpnⅠ。擴(kuò)增dsRNA正向序列的引物L(fēng)IC1-879上的酶切位點(diǎn)為XhoⅠ，擴(kuò)增dsRNA反向序列的引物L(fēng)IC4-879上的酶切位點(diǎn)為KpnⅠ，最后交由Invitrogen公司合成（表1）。

1.2.2 原核表達(dá)載體的構(gòu)建 PLDMV CP基因全長(zhǎng)的克隆：使用Pyrobest DNA Polymerase高保真酶，以含有PLDMV全長(zhǎng)cDNA克隆的質(zhì)粒為模板擴(kuò)增目的片段，引物L(fēng)IC1-879，LIC2-879擴(kuò)增所得的PCR產(chǎn)物1作為構(gòu)建dsRNA發(fā)卡結(jié)構(gòu)的正向序列；引物L(fēng)IC3-879，LIC4-879的擴(kuò)增所得的PCR產(chǎn)物2作為構(gòu)建dsRNA發(fā)卡結(jié)構(gòu)的反向序列。擴(kuò)增所得的2個(gè)產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)正確后，將目的條帶回收并純化。

含有pdk內(nèi)含子的發(fā)卡RNA結(jié)構(gòu)的構(gòu)建：①在PCR管中依次加入1 μL 5×reaction buffer，2 μL純化過后PCR產(chǎn)物1/PCR產(chǎn)物2（約50 ng），0.25 μL dATPs（100 mmol/L）和0.1 μL T4 DNA聚合酶（約0.5 Units），1.65 μL ddH2O 后于22 ℃反應(yīng)30 min后，再經(jīng)75 ℃ 處理20 min使T4 DNA聚合酶失活；②用限制性內(nèi)切酶SmaⅠ對(duì)載體 pRNAi-LIC進(jìn)行酶切處理，37 ℃酶切30 min后經(jīng)65 ℃處理20 min使SmaⅠ失活；③在PCR管中加入10 μL 5×reaction buffer，36.5 μL經(jīng)SmaⅠ消化過的pRNAi-LIC載體，2.5 μL dTTPs（100 mmol/L）和1 μL T4 DNA polymerase，反應(yīng)條件同步驟1；④取3 μL經(jīng)過步驟3處理過的pRNAi-LIC載體，同經(jīng)過步驟1處理過的2種PCR產(chǎn)物混合，先經(jīng)65 ℃ 處理 5 min，然后于22 ℃ 連接15～30 min；⑤將連接好產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌 Trans10感受態(tài)細(xì)胞，均勻涂布于含有25 mg/L卡那霉素以及5 mg/L氯霉素固體LB平板上，37 ℃倒置培養(yǎng)16～20 h后篩選重組子。構(gòu)建好的發(fā)卡RNA結(jié)構(gòu)應(yīng)如圖1所示。

發(fā)卡RNA結(jié)構(gòu)的酶切鑒定：從轉(zhuǎn)化的平板上挑取單個(gè)菌落接種于含有25 mg/L卡那霉素以及5 mg/L氯霉素的液體LB中，震蕩培養(yǎng)過夜后提取質(zhì)粒做酶切鑒定。共做了2種酶切鑒定：若質(zhì)粒構(gòu)建成功，則用SacⅠ和BamHⅠ酶切后，經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳可見到3條帶。經(jīng)XhoⅠ和KpnⅠ酶切可產(chǎn)生4條帶，其中一條為編碼發(fā)卡RNA結(jié)構(gòu)的目的條帶。

dsRNA原核表達(dá)載體的構(gòu)建與鑒定：回收并純化從pRNAi-LIC載體上酶切下的發(fā)卡結(jié)構(gòu)DNA片段，與同樣經(jīng)XhoⅠ和KpnⅠ酶切處理過的載體pSP73按3 ∶ 1比例混合，添加T4 DNA連接酶后4 ℃連接過夜；取連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化由M-Jm109LacY菌株制備的感受態(tài)細(xì)胞，均勻涂布于含有50 μg/L kan和50 μg/L Amp的固體LB平板上，37 ℃倒置培養(yǎng)16～20 h；挑取單菌落搖菌后用引物L(fēng)IC3-879和LIC4-879做菌液PCR鑒定。同時(shí)用pSP73空載體構(gòu)建的菌株M-Jm109LacY/pSP73作為陰性對(duì)照。

1.2.3 dsRNA的誘導(dǎo)表達(dá) 將構(gòu)建成功的重組菌株接種至10 mL含50 μg/L Kan與50 μg/L Amp LB液體培養(yǎng)基中37 ℃，250 r/min振蕩培養(yǎng)過夜，然后將菌液全部加入到200 mL LB液體培養(yǎng)基（抗性同前）中于37 ℃，250 r/min振蕩培養(yǎng)約2 h，直至A600 nm=0.5左右，加入終濃度為0.4 mmol/L IPTG于37 ℃，250 r/min誘導(dǎo)培養(yǎng)約3 h后，離心收集菌體后用Trizol試劑提取總RNA。對(duì)提取得到的RNA樣品分別先后用DNaseⅠ與RNaseA進(jìn)行消化處理。具體步驟為：向PCR管中依次加入2.0 μL RNA樣品（約1 μg），1.0 μL 10×DNaseⅠBuffer，1.0 μL DNaseⅠ（1 U/μL），6.0 μL ddH2O，于37 ℃恒溫水浴30 min；取5.0 μL 經(jīng)DNaseⅠ消化過后的RNA樣品，加入6 μL NaCl（1 mol/L），0.5 μL RNase A（1 ng/μL），于37 ℃恒溫水浴1 h；用1%瓊脂糖凝膠電泳對(duì)提取的RNA以及2種消化產(chǎn)物進(jìn)行分析。

1.2.4 dsRNA粗提液的制備 將誘導(dǎo)后的菌液離心收集菌體，用含有10 mmol/L Tris（pH=7.5），1 mmol/L EDTA緩沖液對(duì)菌體進(jìn)行重懸，然后使用高壓細(xì)胞破碎儀（Constant Systems公司，英國）對(duì)收集到的菌體以0.98 kPa的壓強(qiáng)進(jìn)行破碎處理。

1.2.5 使用dsRNA粗制品處理番木瓜植株 研究共設(shè)2個(gè)處理，一為保護(hù)性處理，另一為治療性處理，每處理均設(shè)3個(gè)重復(fù)。將保護(hù)性處理分為2個(gè)組，每組30株苗，一組噴施CP879-dsRNA粗提液，另一組噴施經(jīng)IPTG誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)入pSP73空載體的細(xì)胞破碎液作為對(duì)照。葉片的正反兩面均須噴施均勻。于噴施后的第2天，摘取取新鮮的PLDMV病葉配以適量石英砂以及PBS緩沖液進(jìn)行研磨，之后取其汁液人工摩擦接種到2組番木瓜植株的葉片上，每天觀察并記錄植株的發(fā)病情況。每組中隨機(jī)選取3株苗進(jìn)行取樣，依次于接種后的第3、6、9、12、15、18、21、24、27、30天剪取位于被接種過的葉片以上的葉片進(jìn)行ELISA分析。治療性處理同樣分為2個(gè)組，每組選取30株苗，均為接種PLDMV 25 d后已表現(xiàn)出病癥的番木瓜組培苗。一組噴施CP879-dsRNA粗提液，另一組噴施經(jīng)IPTG誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)入pSP73空載體的細(xì)胞破碎液作為對(duì)照。每天觀察發(fā)病情況。每組中隨機(jī)選取3株番木瓜苗進(jìn)行取樣，依次于噴施前（0 d）和噴施后的第3、6、9、12、15、18天剪取取樣株頂部病葉進(jìn)行ELISA分析。

1.2.6 噴施CP879-dsRNA后番木瓜植株中的病毒積累量的測(cè)定 本研究中ELISA檢測(cè)采用的是雙抗體夾心法（DAS ELISA）。用包被緩沖液將PLDMV CP兔抗血清稀釋至1～10 μg/mL，然后吸取100 μL加入到到每個(gè)聚苯乙烯板的反應(yīng)孔中，4 ℃包被過夜；次日，棄去孔內(nèi)溶液，用洗滌緩沖液洗3次，每次3 min；取新鮮的病葉研磨后離心取上清，吸取100 μL加入到上述已包被的反應(yīng)孔中，于濕盒中37 ℃溫育1 h后進(jìn)行洗滌（同步驟2），同時(shí)做空白孔，陰性對(duì)照孔及陽性對(duì)照孔；于各反應(yīng)孔中，加入100 μL現(xiàn)配的按1 ∶ 3 000的比例稀釋的堿性磷酸酯酶羊抗兔IgG。37 ℃溫育1 h后洗滌（同步驟2）；于各反應(yīng)孔中加入100 μL臨時(shí)配制的PNP（1 mg/mL）底物溶液，于室溫（25 ℃）避光溫育30 min；于各反應(yīng)孔中加入50 μL 2 mol/L硫酸以終止反應(yīng)；用酶標(biāo)儀在405 nm波長(zhǎng)下，以空白對(duì)照孔調(diào)零后測(cè)各孔OD值，分析各處理的保護(hù)效果。試驗(yàn)組的OD值/陰性對(duì)照的OD值若大于2.1則可判斷為陽性，若小于2.1則可判斷為陰性。

2 結(jié)果與分析

2.1 目的基因的克隆

以含PLDMV全長(zhǎng)的cDNA的質(zhì)粒為模板，引物L(fēng)IC1-879，LIC2-879擴(kuò)增得到了構(gòu)建dsRNA發(fā)卡結(jié)構(gòu)的正向序列，引物L(fēng)IC4-879，LIC3-879擴(kuò)增得到了構(gòu)建dsRNA發(fā)卡結(jié)構(gòu)的反向序列，片段大小均約為879 bp。擴(kuò)增結(jié)果如圖2所示。

2.2 dsRNA發(fā)卡結(jié)構(gòu)的酶切鑒定

2種酶切鑒定結(jié)果如圖3所示：經(jīng)SacⅠ和BamHⅠ酶切后產(chǎn)生了3條片段，第1條片段的大小為9.7 kb，第2條片段的大小為1 932 bp，最后1條片段的大小為1 501 bp。經(jīng)XhoⅠ和KpnⅠ酶切共產(chǎn)生了4條片段，其中第2條片段即為需要回收的發(fā)卡結(jié)構(gòu)，片段大小約為3 369 bp，所有片段大小均與預(yù)期結(jié)果一致。說明dsRNA發(fā)卡結(jié)構(gòu)已經(jīng)構(gòu)建成功，將構(gòu)建成功的質(zhì)粒命名為pRNAi-CP879。

2.3 dsRNA的表達(dá)分析

用Trizol試劑提取的細(xì)菌總RNA及其酶解結(jié)果如圖4所示，將轉(zhuǎn)入重組質(zhì)粒的菌株所提取的RNA樣品經(jīng)DNaseⅠ和RNaseA先后處理后，目的條帶（圖4中約879 bp處）不會(huì)被消化掉（因RNaseA在高鹽下消化，故條帶遷移速率比其它樣品慢），而由M-Jm109LacY/pSP73對(duì)照菌株所提取的RNA樣品會(huì)被消化掉，證明經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)出的RNA樣品主要是dsRNA，將該dsRNA命名為CP879-dsRNA。

2.4 CP879-dsRNA處理后番木瓜植株的發(fā)病情況

對(duì)于保護(hù)性處理，在接種PLDMV后第18天時(shí)，部分對(duì)照組植株的頂部嫩葉開始顯現(xiàn)出病癥，而噴施dsRNA粗提液的實(shí)驗(yàn)組植株均沒有植株發(fā)?。坏?4天時(shí)，對(duì)照組植株已全部發(fā)病，而實(shí)驗(yàn)組植株總共只有5株發(fā)??；截至第30天時(shí)，實(shí)驗(yàn)組植株仍有有14株苗未發(fā)?。ū?）。與對(duì)照組100%發(fā)病率相比，實(shí)驗(yàn)組植株的發(fā)病率僅為47%。保護(hù)性處理中不同植株的病癥見圖5A。

對(duì)于治療性處理，在噴施CP879-dsRNA后的18 d內(nèi)，對(duì)照組植株葉片病癥狀逐漸加重，由最初的泡狀突起、葉脈發(fā)白、花葉發(fā)展到新生嫩葉卷曲、皺縮和嚴(yán)重畸形；而實(shí)驗(yàn)組植株在噴施CP879-dsRNA粗提液后第10天左右，部分植株葉片出現(xiàn)癥狀減輕的現(xiàn)象，甚至有部分植株頂部長(zhǎng)出了沒有病癥的新葉，但在隨后的一周時(shí)間里，葉片病癥又逐漸加重（圖5B）。

2.5 CP879-dsRNA 處理后番木瓜植株中PLDMV積累量

在保護(hù)性處理中，陰性對(duì)照組植株的A405 nm=0.107±0.009。陽性對(duì)照組植株在接種PLDMV后第12天以前的ELISA檢測(cè)結(jié)果均呈陰性，第12天及12天之后的ELISA檢測(cè)結(jié)果均呈陽性，且隨后病毒積累量不斷升高；而噴施過CP879-dsRNA粗提液的處理組植株在第18天時(shí)，ELISA檢測(cè)結(jié)果才呈現(xiàn)出陽性，比陽性對(duì)照晚了近一周，且各植株中的病毒積累量均顯著低于同一時(shí)間內(nèi)的對(duì)照組植株（圖6）。

在治療性處理中，陰性對(duì)照組植株的A405 nm=0.104±0.012，噴施M-Jm109LacY/pSP73細(xì)胞破碎液的陽性對(duì)照組植株中的病毒積累量隨著時(shí)間的推移不斷升高，而噴施CP879-dsRNA粗提液的處理組植株在第3～12天內(nèi)的病毒積累顯著低于陽性對(duì)照組植株，但隨后病毒積累量又逐日升高，直至第15天時(shí)與陽性對(duì)照組植株已無顯著差別（圖7）。

3 討論與結(jié)論

根據(jù)病毒基因能夠被與其自身基因同源的特異dsRNA沉默的機(jī)制，常規(guī)的方法為利用基因工程技術(shù)構(gòu)建相關(guān)病毒基因的dsRNA植物表達(dá)載體轉(zhuǎn)入到植物中，從而獲得相應(yīng)的抗病毒轉(zhuǎn)基因植株。該方法已應(yīng)用到煙草[16-17]，大麥[18]，大豆[19]，葡萄柚[20]，馬鈴薯[21]等眾多農(nóng)作物上。但是近年來關(guān)于轉(zhuǎn)基因農(nóng)作物潛在的生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)和食品安全性問題一直備受爭(zhēng)議，轉(zhuǎn)基因植物的推廣也因此變得異常艱難，而通過原核大量表達(dá)的dsRNA對(duì)植物進(jìn)行體外噴施處理則相對(duì)來說更安全和高效。傳統(tǒng)的構(gòu)建dsRNA發(fā)卡結(jié)構(gòu)的方法通常需要多步酶切與連接反應(yīng)，操作復(fù)雜。而本研究所用的OZ-LIC法不需要使用T4 DNA連接酶，幾乎零背景，只需用T4 DNA聚合酶的外切酶活性分別將載體、正向序列與反向序列切出能夠互補(bǔ)的粘性末端后，進(jìn)行一步連接反應(yīng)即可完成發(fā)卡RNA結(jié)構(gòu)的構(gòu)建。與傳統(tǒng)法相比非常簡(jiǎn)單、迅速。

RNA沉默具有高度的特異性，若要dsRNA的沉默效率高，則所選用的dsRNA序列與被沉默的基因需要具有高度的同源性[22]。另外Wesley等[23]的研究結(jié)果表明，發(fā)卡RNA在RNA沉默中起到?jīng)Q定性作用的結(jié)構(gòu)是其莖環(huán)結(jié)構(gòu)中“莖”的那一部分。且“莖”越長(zhǎng)，沉默效果就越好，但是太長(zhǎng)又會(huì)不利于發(fā)卡結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性[24]。本研究為了保障dsRNA能同時(shí)具備較高的沉默效率與穩(wěn)定性，特別挑選了PLDMV CP基因全長(zhǎng)（879 bp）來構(gòu)建dsRNA，最終表達(dá)得的dsRNA在DNaseⅠ和RNase A同時(shí)存在的情況下不易被降解。由此表明CP879-dsRNA能在體外穩(wěn)定存在，具有較高的穩(wěn)定性。

RNA沉默具有高效性和擴(kuò)散性的特點(diǎn)，RISC復(fù)合物切割靶標(biāo)RNA這一過程會(huì)被一種依賴于RNA的RNA聚合酶（RNA dependent RNA polymerase，RdRp）所識(shí)別，RdRp能夠以dsRNA為模板擴(kuò)增dsRNA，經(jīng)過多次循環(huán)使得dsRNA大量積累，從而進(jìn)一步放大RNA沉默的信號(hào)，與此同時(shí)基因沉默抑制子（Suppressor of Gene silencing，SGS）能夠穩(wěn)固dsRNA底物以幫助DCL蛋白生成更多的次級(jí)siRNA，從而增強(qiáng)RNA沉默效應(yīng)[25]。另外Fire等[6]發(fā)現(xiàn)，將dsRNA注射到線蟲體內(nèi)，這些dsRNA可以從注射處的細(xì)胞擴(kuò)散到體內(nèi)其他細(xì)胞，引起其他細(xì)胞的基因沉默。對(duì)于保護(hù)性處理，在向植株接種病毒之前，通過外源dsRNA誘導(dǎo)，植物不同組織細(xì)胞內(nèi)已積累了一定量siRNA，而通過蚜蟲或機(jī)械摩擦引入的病毒是局部的、微量的，在病毒還沒來得及大量增殖的時(shí)候，這些siRNA便能夠從源頭上抑制病毒的復(fù)制，從而阻止病毒向植株其他組織細(xì)胞擴(kuò)散。而在治療性處理中，病毒已對(duì)植株造成了系統(tǒng)性侵染，病毒粒子遍布不同組織細(xì)胞，此時(shí)噴施dsRNA雖也能誘導(dǎo)siRNA生成，但由于病毒積累量較大，且通過這一方式所產(chǎn)生的siRNA并不是永久性的，因此只能在短期內(nèi)發(fā)揮作用，并不能徹底清除植株內(nèi)病毒，這或許是保護(hù)性處理的效果要優(yōu)于治療性處理的原因。

本研究構(gòu)建的番木瓜畸形花葉病毒CP基因全長(zhǎng)dsRNA原核表達(dá)體系，在保護(hù)性處理中，噴施CP879-dsRNA粗提液能夠有效誘導(dǎo)木瓜苗對(duì)PLDMV的抗性。對(duì)于治療性處理，它能夠在短期內(nèi)抑制PLDMV積累，部分植株出現(xiàn)癥狀減輕的現(xiàn)象，但隨后PLDMV積累量又逐步升高，病癥愈發(fā)嚴(yán)重。由此可以看出，保護(hù)處理的效果要優(yōu)于治療性處理，這一結(jié)果與張德詠[10]和楊國峰[14]所得結(jié)果相似?？梢灶A(yù)見，在大田生產(chǎn)上，于PLDMV的高發(fā)期，若每個(gè)月對(duì)未感病的番木瓜植株噴施2～3次CP879-dsRNA粗提液，或許能夠有效預(yù)防PLDMV對(duì)番木瓜植株的侵染。但具體的施用濃度與施用量仍有待于進(jìn)一步驗(yàn)證與研究。

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