陳子健等

摘 要 以‘石硤龍眼果肉為材料，在（4±0.5）℃條件下貯藏，并將貯藏后期不同狀態(tài)果肉分為自溶與未自溶2部分，對其中的乙醇脫氫酶（ADH）、抗壞血酸過氧化物酶（APX）、過氧化氫酶（CAT）、細胞色素氧化酶（COD）、蘋果酸脫氫酶（MDH）、多酚氧化酶（PPO）、過氧化物酶（POD）、超氧物歧化酶（SOD）8個酶進行同工酶電泳檢測，以果肉在貯藏過程中的變化為參照，對龍眼果肉自溶與同工酶變化的關系進行探討。結果表明：“石硤”龍眼低溫貯藏過程中，整果果肉除POD外其余7個酶同工酶酶譜變化不大；但貯藏后期自溶果肉與未自溶果肉酶譜差異顯著，其中未自溶果肉與剛采收果肉（第0天）酶譜差異不大。說明即使在同一果實中，自溶與未自溶果肉生理狀況明顯不同，龍眼采后果肉的生理變化主要集中在自溶果肉部分，未自溶的果肉基本維持與剛采收時相近的生理狀態(tài)。自溶與未自溶果肉中，APX、CAT、MDH、COD、PPD和POD酶譜條帶數(shù)目、種類以及表達量間差異顯著，這幾種酶可能與龍眼果肉的自溶有密切關系。

關鍵詞 龍眼（Dimocarpus longan Lonn.）；果肉自溶；同工酶；電泳

中圖分類號 Q814 文獻標識碼 A

Abstract The isozyme of alcohol dehydrogenase（ADH）， ascorbate peroxidase（APX）， catalase（CAT）， cytochrome c oxidase（COD）， malate dehydrogenase（MDH）， polyphenol oxidase（PPO）， peroxidase（POD） and superoxide dismutase（SOD） in Longan（Dimocarpus longan Lour cv.‘Shixia）pulp stored at 3-5 ℃ and divided into‘pulp-breakdownand‘intactat the end of storage were determined. The results showed that except the POD isozyme，the other 7 isozymes had a slightly changes in the band during storage of the pulp samples. But the bands of the breakdown pulp hada significant difference from those of the intact pulp which were similar to fresh pulp in 0 day. The results indicated that even in the same fruit pulp，there had a different physiology states between the breakdown pulp and the intact pulp. Postharvest physiology changes toke place mainly in the breakdown pulp of longan. The changes of amount，types and expression of APX， CAT， MDH， COD and POD isozymesbands indicated that these enzymes maybe associate closely with pulp-breakdown process of longan pulp.

Key words Longan；Pulp-breakdown；Isozyme；Electrophoresis

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2014.07.031

采后龍眼鮮果難以保鮮，除了果皮的迅速褐變外，果肉的快速軟化、流汁和腐爛更為突出，其特征是果殼外觀看似完整，實際上內部果肉已經開始溶解、流汁，趨于腐敗，這是龍眼果實在生命最后階段表現(xiàn)出來的相似癥狀，一些研究者又稱這種現(xiàn)象為“自溶”[1]。周云等[2]、梁漢華等[3]、韓冬梅等[4]、林河通等[5]分別對龍眼果肉自溶進行了研究，但主要是對龍眼果肉自溶現(xiàn)象進行描述，并提出了龍眼在貯藏中后期可能是先發(fā)生果肉的自溶后因微生物侵染而加速其腐敗的觀點，張強等[6]發(fā)現(xiàn)龍眼果肉衰老劣變與一些氧化還原酶及抗氧化能力的變化有密切關系。本研究探討了一些與衰老相關的氧化還原酶同工酶在龍眼果肉自溶過程中的變化，特別是對比同一果實的自溶果肉與未自溶果肉中這些酶同工酶的差異，以期為進一步弄清龍眼果肉自溶機理提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

以廣東省主栽優(yōu)質龍眼品種“石硤”龍眼（Dimocarpus longan Lour.）果實為試驗材料?！笆垺饼堁酃麑嵅勺詮V東省農科院果樹研究所龍眼園。采收成熟度為8～9成熟，上午采摘的龍眼當天運回，剪下單果后，挑選出大小均勻，無病蟲害的果實用于試驗，以0.3%含氯消毒劑清洗，晾干后，以0.02 mm厚的低密度聚乙烯袋（LDPE）包裝，每袋50個果，貯藏在（4±0.5）℃的恒溫箱（SANYO MIP-553）中。每7 d取樣一次，其中最后一天（49 d）取樣時，將果肉分成已自溶與未自溶2部分，以刀片對果肉進行隨機切割取樣。所取果肉樣品，以液氮凍結徹底后用錫箔紙包好，放入自封袋中，存放于-40 ℃冰箱。

1.2 方法

1.2.1 電泳 電泳參考胡能書等[7]的方法，以不連續(xù)的聚丙烯酰胺凝膠活性電泳法（Native-PAGE）對可溶性蛋白進行分析。

1.2.2 乙醇脫氫酶（ADH）（E C 1.1.1.1） 粗酶制備參考李振國[8]的方法，略加修改，提取緩沖液為含5 mmol/L MgCl2和1 mmol/L苯甲基磺酰氟（PMSF）的PBS（0.1 mol/L、pH7.5）。染色參照胡能書等[7]的方法，染色液組成：96 mL Tris-HCl緩沖液（50 mmol/L、pH8.0）（其中含NAD 40 mg、NBT 30 mg、PMS 3 mg），用時加入4 mL 95%乙醇，室溫避光染色，條帶呈藍紫色。

1.2.3 抗壞血酸過氧化物酶（APX）（E C 1.11.1.11） 粗酶制備參考沈文飚等[9]的方法，略作修改，提取緩沖液為含0.1 mmol/L EDTA-Na2、2 mmol/L AsA的K2HPO4-KH2PO4緩沖液（50 mmol/L、pH7.0）。染色參照Mittlet等[10]的方法。

1.2.4 過氧化氫酶（CAT）（E C 1.11.1.6） 粗酶制備參考Chance等[11]的方法，提取緩沖液為50 mmol/L、pH7.0的PBS。染色參考孫彩霞等[12]的方法略作修改分3步進行（1）將凝膠放在經過預冷的1%淀粉溶液（置于沸水浴中至無色透明）中于4 ℃浸泡90 min（2）浸泡于0.3% H2O2中，室溫下靜置1 min后以雙蒸水漂洗（3）置于0.5%KI（每200 mL加入1 mL冰醋酸酸化）中浸泡染色。此法為負染，即酶帶為藍色背景中無色透明的條帶。

1.2.5 細胞色素氧化酶（COD）（E C 1.9.3.1） 粗酶制備參照夏濤等[13]的方法，略作修改，提取緩沖液為含5 mmol/L EDTA-Na2的50 mmol/L、pH7.5的Tris-HCl。染色參照胡能書等[7]的方法，染色液體含1%二甲基對苯二胺、1%α-萘酚（溶于40%乙醇）和PBS（0.1 mol/L、pH7.4），三者以1 ∶ 1 ∶ 25（V ∶ V ∶ V）混合，室溫避光染色，條帶呈藍紫色。

1.2.6 蘋果酸脫氫酶（MDH）（E C 1.1.1.37） 粗酶制備參考歐陽光察[14]的方法，提取緩沖液為含10 mmol/L MgCl2和0.2 mmol/L EDTA的PBS（0.1 mol/L、pH7.5）。染色參考彭永康等[15]的方法，略作修改，染色液為100 mL PBS（0.1 mol/L、pH6.8），其中含NAD 30 mg、NBT 30 mg、PMS 3 mg、DL-蘋果酸250 mg，室溫避光染色，條帶呈藍紫色。

1.2.7 過氧化物酶（POD）（E C 1.11.1.7） 粗酶制備參照曾韶西等[16]的方法，略作修改，提取緩沖液為0.15 mol/L、pH7.0的PBS。染色參照沈德緒[17]的改良醋酸聯(lián)苯胺法。按次序將1份2%醋酸-聯(lián)苯胺（1 g聯(lián)苯胺溶于9 mL熱的冰醋酸，再以水定容到50 mL）、1份4%NH4Cl 、1份5% EDTA、1份0.3% H2O2和8份雙蒸水混合成染色液，室溫下浸泡染色，條帶呈天藍色。

1.2.8 多酚氧化酶（PPO）（E C 1.10.3.1） 粗酶制備參照譚興杰等[18]的方法，略作修改，提取緩沖液為50 mmol/L、pH7.0的PBS。染色參照薛俊杰等[19]的方法，將10 mmol/L鄰苯二酚、0.01 %對苯二胺與PBS（50 mmol/L、pH6.8）以3 ∶ 1 ∶ 1（V ∶ V ∶ V）混合后，室溫下浸泡染色，條帶呈紅棕色。

1.2.9 超氧化物歧化酶（SOD）（E C 1.15.1.1） 粗酶制備參考邵從本等[20]的方法，染色參照李中振等[21]的方法。

2 結果與分析

2.1 龍眼果肉貯藏及自溶過程中ADH同工酶的變化

貯藏過程中各時間段樣品間以及與完整果肉的ADH同工酶間差異不大，而自溶果肉ADH條帶則明顯減弱（圖1）。3條同工酶譜帶中，以中間譜帶較穩(wěn)定，第1條譜帶變化較大。

2.2 龍眼果肉貯藏及自溶過程中APX、CAT、COD、MDH、PPO同工酶的變化

APX（圖2）、 CAT（圖3）、 COD（圖4）、 MDH（圖5）、 PPO（圖6）5種酶同工酶在不同貯藏期樣品間及其與完整果肉相比，其圖譜差異均不大，但自溶果肉的圖譜則與未自溶果肉樣品差異顯著，特別是APX、CAT和COD同工酶。說明這些酶在龍眼果肉發(fā)生自溶的時候，其合成代謝及酶結構可能發(fā)生了明顯的變化。

2.3 龍眼果肉貯藏及自溶過程中POD同工酶的變化

POD同工酶在貯藏中，其條帶數(shù)量及表達強弱都發(fā)生變化，自溶果肉與未自溶果肉的POD同工酶圖譜差異顯著（圖7），說明POD同工酶在龍眼低溫貯藏過程中一直變化，并且在果肉自溶中發(fā)揮作用。

2.4 龍眼果肉貯藏及自溶過程中SOD同工酶的變化

龍眼果肉中SOD同工酶較穩(wěn)定，所有樣品均只分離出3條酶帶，貯藏時間及是否自溶對酶帶的數(shù)量和強弱影響不大（圖8）。

3 討論與結論

龍眼果肉自溶是龍眼采后難以長期貯藏的一個重要原因[4]，果肉的自溶導致果實喪失食用價值和商品價值。已有研究發(fā)現(xiàn)荔枝和龍眼果皮褐變與PPO和POD同工酶的變化有密切關系[22-24]，而對于果肉品質劣變中這些酶同工酶的變化報道很少。本研究發(fā)現(xiàn)在龍眼果肉發(fā)生自溶后，APX、CAT、COD、MDH、PPO和POD酶同工酶也發(fā)生了較明顯的變化，表現(xiàn)在其酶帶數(shù)量和強弱的變化上，說明它們與自溶的發(fā)生、發(fā)展有較密切的關系，但這些酶同工酶是導致果肉自溶的原因還是果肉自溶所引起的結果，還需作進一步的研究。除POD外，貯藏過程中和貯藏后期未自溶果肉中的其余7種酶同工酶的酶譜與0 d的酶譜相似，在條帶數(shù)量與染色深淺上都沒有發(fā)生明顯變化，說明低溫冷藏過程中，如果未發(fā)生果肉自溶，這些酶的性質比較穩(wěn)定。在8種酶同工酶中，貯藏時間及果肉自溶與否對SOD同工酶均無明顯的影響，說明龍眼果肉中SOD是一個較穩(wěn)定的酶，這與張強等[6]發(fā)現(xiàn)龍眼貯藏過程中果肉SOD活性變化很小的結果一致。Duan等[25]發(fā)現(xiàn)活性氧，特別是羥自由基的積累將促進細胞壁多糖的降解，導致龍眼果肉的自溶。本研究結果表明當果肉開始發(fā)生自溶時，CAT等氧化還原酶的同工酶變化可能使組織中活性氧代謝和能量代謝出現(xiàn)異常，導致活性氧的積累，從而促使果肉組織的降解與崩潰，也即出現(xiàn)自溶現(xiàn)象。

綜合各同工酶電泳的結果可見，在龍眼自溶過程中，即使同一個果實里，自溶果肉與未自溶果肉的生理變化、代謝途徑都有很大差異，因此在進行龍眼果肉自溶研究時，以整果果肉作為自溶進程的生理分析并不能真實地代表自溶本身的變化，若將果肉的不同狀態(tài)分開進行研究，更有利于揭示龍眼果肉自溶的生理機理。

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