尹曉暢等

摘 要 應(yīng)用SSR和SRAP標(biāo)記，對(duì)20份柱花草種質(zhì)的遺傳多樣性進(jìn)行研究。從113對(duì)SSR引物中篩選出41對(duì)多態(tài)性較好的引物，共擴(kuò)增出229個(gè)位點(diǎn)，多態(tài)性比率達(dá)76.86%，平均每個(gè)引物擴(kuò)增多態(tài)性位點(diǎn)4.29個(gè)。從224對(duì)SRAP引物中篩選出25對(duì)多態(tài)性較好的引物，共擴(kuò)增出359個(gè)位點(diǎn)，平均每個(gè)引物擴(kuò)增多態(tài)性10.72個(gè)，多態(tài)性比率達(dá)74.65%。綜合SSR和SRAP兩種標(biāo)記對(duì)20份材料計(jì)算出的遺傳相似系數(shù)（GS）為0.65～0.90，表明柱花草種質(zhì)遺傳多樣性比較豐富；通過UPGMA聚類分析，把這20份材料聚為3個(gè)類群，其中類群Ⅰ又分為4個(gè)亞類。

關(guān)鍵詞 柱花草；遺傳多樣性；SSR；SRAP

中圖分類號(hào) S541.9 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A

Abstract SSR and SRAP molecular markers were used to study genetic diversity among 20 Stylosanthes cultivars. 41 of 113 SSR and 25 of 224 SRAP pairs of primer were employed. 229 SSR and 359 SRAP markers were obtained respectively， with polymorphism 76.86% and 74.65%， respectively. The genetic similarity coefficients were 0.65～0.90. It indicated that Stylosanthes had an abundant genetic polymorphism in different cultivars. In addition， using UPGMA-clustering analysis， the materials could be divided into three groups， and groups I could be further divided into four sub-groups.

Key words Stylosanthes； Genetic diversity； SSR； SRAP

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2014.07.019

柱花草（Stylosanthes spp.）是熱帶、亞熱帶地區(qū)重要的豆科牧草和飼料植物資源，原產(chǎn)南美洲及加勒比海地區(qū)，中國于20世紀(jì)60年代開始引入[1]，經(jīng)引種選育和誘變育種育出了熱研2號(hào)、熱研5號(hào)、熱研7號(hào)、熱研10號(hào)、熱研20號(hào)、熱研21號(hào)等9個(gè)柱花草品種并應(yīng)用于生產(chǎn)，柱花草已成為我國熱區(qū)重要的替代蛋白質(zhì)飼料資源和水土保持當(dāng)家草種[2-3]。

培育優(yōu)質(zhì)、高產(chǎn)、抗逆性強(qiáng)的柱花草新品種，是目前我國柱花草育種的主要目標(biāo)。分子標(biāo)記方法能真實(shí)反映品種間的親緣關(guān)系，從而為雜交育種中親本的選配提供理論支持[4]。簡(jiǎn)單序列重復(fù)標(biāo)記（Simple Sequence Repeat， SSR）具有多態(tài)性高、檢測(cè)簡(jiǎn)便、共顯性遺傳等特點(diǎn)[5]，是一種應(yīng)用十分廣泛的分子標(biāo)記方法；而相關(guān)序列擴(kuò)增多態(tài)性（Sequence Related Amplified Polymorphism， SRAP）由美國加州大學(xué)Li與Quiros于2001年開發(fā)出來，作為近年來新開發(fā)的一種分子標(biāo)記技術(shù)，具有操作簡(jiǎn)便、多態(tài)性高、高效、在基因組上分布均勻等優(yōu)點(diǎn)[6]。2種標(biāo)記聯(lián)用進(jìn)行遺傳多樣性分析的研究在國內(nèi)外都有報(bào)道[7-9]。本研究應(yīng)用SSR和SRAP分子標(biāo)記技術(shù)，對(duì)中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院（CATAS）的部分選育柱花草品種、航空誘變柱花草新品系及國外引進(jìn)的柱花草種質(zhì)[10]進(jìn)行了遺傳多樣性分析，從而為柱花草種質(zhì)鑒定及育種實(shí)踐提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試種質(zhì) 實(shí)驗(yàn)選用的20份柱花草品種（品系）由中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶作物品種資源研究所提供（表1）。這些柱花草種質(zhì)為該所育成的航空誘變品種（7號(hào)和13號(hào)）、航空誘變品系（1號(hào)～6號(hào)、8號(hào)～12號(hào)）以及從國外引進(jìn)優(yōu)良種質(zhì)（14號(hào)～20號(hào)）。

1.1.2 試劑和儀器 試驗(yàn)所用EasyTaqR DNA Polymerase for PAGE，10×EasyTaqR Buffer for PAGE，2.5 mmol/L dNTPs，6×DNA Loading Buffer購自北京全式金生物技術(shù)有限公司。DSTM 2 000 Marker購自廣州東盛生物科技有限公司。PCR儀為Biometra TGradient，電泳系統(tǒng)為北京六一廠生產(chǎn)的DYY-6C和DYC-23。

1.2 方法

1.2.1 DNA的提取方法 取柱花草嫩葉，采用改良CTAB法[11]提取基因組總DNA。

1.2.2 PCR反應(yīng)體系和擴(kuò)增程序 SSR-PCR擴(kuò)增總反應(yīng)體系為20 μL，其中Taq Polymerase 0.3 μL﹑10×Taq Buffer 2 μL﹑2.5 mmol/L dNTPs 1.2 μL﹑10 μmol/L引物0.8 μL﹑50 ng/μL模板DNA 2.5 μL﹑用ddH2O補(bǔ)足體系；SSR-PCR擴(kuò)增程序：94 ℃ 5 min；94 ℃ 40 s，55 ℃ 40 s，72 ℃ 45 s，35個(gè)循環(huán)；72 ℃ 10 min；4 ℃保存。SRAP-PCR擴(kuò)增總反應(yīng)體系為25 μL，其中Taq Polymerase 0.2 μL﹑10×Taq Buffer 2.5 μL﹑2.5 mmol/L dNTPs 2 μL﹑10 μmol/L引物0.75 μL﹑50 ng/μL模版DNA 0.5 μL﹑用ddH2O補(bǔ)足體系；SRAP-PCR擴(kuò)增程序：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，35 ℃ 45 s，72 ℃ 45 s，5個(gè)循環(huán)；94 ℃ 30 s，50 ℃ 45 s，72 ℃ 45 s，35個(gè)循環(huán)；72 ℃ 10 min。4 ℃保存。

1.2.3 引物的篩選 本實(shí)驗(yàn)所用SSR引物通過NCBI公共數(shù)據(jù)庫查得，SRAP引物參照Li等[9]所選的引物，由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。利用3個(gè)種質(zhì)進(jìn)行引物篩選，選出多態(tài)性好的引物再對(duì)20份材料進(jìn)行PCR擴(kuò)增。

1.2.4 結(jié)果檢測(cè) PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用8% PAGE膠進(jìn)行檢測(cè)，正式電泳前對(duì)已制好的PAGE膠預(yù)電泳30 min，之后加入3 μL反應(yīng)產(chǎn)物點(diǎn)樣，250 V恒壓電泳3 h。電泳結(jié)束后銀染檢測(cè)。

1.3 數(shù)據(jù)分析

統(tǒng)計(jì)SSR和SRAP多態(tài)性條帶（有帶讀1，沒有帶讀0），用NTSYS-2.10e軟件計(jì)算材料間遺傳相似系數(shù)（GS），按非加權(quán)平均法（UPGMA）聚類分析構(gòu)建樹狀圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 SSR和SRAP標(biāo)記的多態(tài)性

從113對(duì)SSR引物中篩選出41對(duì)多態(tài)性較好引物組合對(duì)20個(gè)柱花草品種（品系）進(jìn)行分析，共得到229個(gè)位點(diǎn)，多態(tài)性位點(diǎn)176個(gè)，多態(tài)性比率為76.86%，平均每個(gè)引物擴(kuò)增多態(tài)性位點(diǎn)4.29個(gè)（表2）。從224對(duì)SRAP引物中篩選出25對(duì)多態(tài)性較好的組合進(jìn)行分析，一共得到359個(gè)位點(diǎn)，多態(tài)性位點(diǎn)268個(gè)，多態(tài)性比率為74.65%，平均每個(gè)引物擴(kuò)增多態(tài)性位點(diǎn)10.72個(gè)（表3）。SSR引物SG03G8（見圖1）和SRAP引物me9+em9的擴(kuò)增結(jié)果見圖2。統(tǒng)計(jì)擴(kuò)增片段大小在100～500 bp之間。

2.2 綜合2種標(biāo)記的聚類分析

用NTSYS-2.10e軟件對(duì)20份材料基于SSR和SRAP標(biāo)記上的遺傳相似系數(shù)（GS）進(jìn)行計(jì)算，其GS值變換范圍在0.65～0.90之間，平均GS值為0.779 731。TPRC2001-15與TPRC2001-81遺傳相似系數(shù)最大為0.895 548，熱研21號(hào)和馬弓形柱花草遺傳相似系數(shù)最小為0.601 027。

用UPGMA法對(duì)SSR和SRAP所得的數(shù)據(jù)進(jìn)行聚類分析（圖3）。在GS=0.79時(shí)，將材料分為3個(gè)群體。第Ⅰ群體包含17份種質(zhì)，都為圭亞那柱花草。第Ⅱ群體只有Tardio柱花草1個(gè)品種，Tardio柱花草雖然是圭亞那種，但其表型與其他圭亞那柱花草有很大差異，尤其是其葉片表面有粘稠物質(zhì)分泌，屬高抗病柱花草品系。第Ⅲ群體包含馬弓形柱花草和Oxley柱花草，田間表現(xiàn)都有莖的生長(zhǎng)習(xí)性為斜倚型，植株矮小，葉片短小，產(chǎn)量較低的特點(diǎn)，兩者之間的遺傳系數(shù)為0.845 89，說明親緣關(guān)系較近。

在GS=0.83時(shí)，又可以將第Ⅰ群體分為A、B、C和D 4個(gè)亞類，A亞類包含TPRC2001-1、TPRC2001-5、TPRC2001-7、TPRC2001-9、TPRC2001-15、TPRC2001-79、TPRC2001-81；B亞類包含TPRC2001-55、TPRC2001-80、TPRC2001-84、TPRC2001-85、熱研20號(hào)柱花草，這12個(gè)品種（品系）為熱研2號(hào)柱花草太空誘變品系，其遺傳相似系數(shù)相近，說明太空誘變品系遺傳變異不大；C亞類包含Nina柱花草、Temprano柱花草、Stylo540（3008）、Stylo541（3009），這4個(gè)株系為澳大利亞引進(jìn)品種，聚為一類說明其親緣關(guān)系較近；D亞類為熱研21號(hào)柱花草，是20份柱花草材料中唯一開白花的品種。

3 討論與結(jié)論

本試驗(yàn)分別采用SSR和SRAP 2種分子標(biāo)記技術(shù)對(duì)20份柱花草種質(zhì)進(jìn)行遺傳分析，結(jié)果顯示這2種標(biāo)記均具有較高的多態(tài)性比率（分別為76.86%和74.65%）。但SSR多態(tài)性比率較蔣昌順等[12]報(bào)道的低，SRAP多態(tài)性比率也較張偉麗等[13]報(bào)道的低，這可能是由于他們所用的實(shí)驗(yàn)材料種間差異較大遺傳背景較寬，而本實(shí)驗(yàn)只有1份材料不是圭亞那種，且多是“熱研2號(hào)”柱花草航空誘變選出的品種或品系，遺傳背景較窄造成的，SSR引物選擇不同也是原因之一。

SSR標(biāo)記是分布于真核生物基因組中的簡(jiǎn)單重復(fù)序列，主要集中在非編碼區(qū)，更多地反映了全基因組的遺傳豐富度[14]；而SRAP標(biāo)記目標(biāo)擴(kuò)增區(qū)域是開放讀碼框，功能區(qū)域比基因組的其他區(qū)域更具保守性[15]。在進(jìn)行譜系分析時(shí)，為了得到盡可能準(zhǔn)確的親緣關(guān)系進(jìn)化圖，用不同的分子標(biāo)記綜合起來進(jìn)行親緣關(guān)系的評(píng)價(jià)是非常必要的，綜合多種分子標(biāo)記的分析可以有效減少各自方法產(chǎn)生的誤差[16]。本實(shí)驗(yàn)綜合SSR和SRAP兩種標(biāo)記所得的數(shù)據(jù)分析柱花草品種間的親緣關(guān)系，TPRC2001-15與TPRC2001-81遺傳相似系數(shù)最大為0.895 548，這兩個(gè)誘變品系的產(chǎn)量較高和開花期接近[17]。熱研21號(hào)（S. guianensis cv.Ryan no.21）和馬弓形柱花草（S.hippocampoides Fine stem stylo）遺傳相似系數(shù)最?。?.601 027），兩者屬于不同種，熱研21號(hào)柱花草莖的生長(zhǎng)習(xí)性為直立型、開白花、產(chǎn)量高，而馬弓形柱花草為斜倚型植株、黃花、植株矮小。

通過聚類分析作圖將20份柱花草材料分為3類群。第Ⅰ群體A、B和D亞類中的13個(gè)株系為熱研2號(hào)柱花草太空誘變后代，其在產(chǎn)量、花期和抗病等方面差異明顯[17]。熱研21號(hào)柱花草單獨(dú)在D亞類，也是這20份種質(zhì)中唯一開白花的柱花草，沒有和其他熱研2號(hào)柱花草誘變品系聚在一起可能是產(chǎn)生了較大變異，此聚類結(jié)果可以在分子水平上提供依據(jù)。

Tardio柱花草（S. guianensis Tardio）單獨(dú)聚為第Ⅱ類，Tardio柱花草具有葉片表面粘稠的顯著特點(diǎn)，且是20份種質(zhì)中唯一來源于哥倫比亞，因此它跟其他圭亞那類柱花草的遺傳相似系數(shù)較低。

馬弓形柱花草（S. hippocampoides Fine stem stylo）和Oxley柱花草（S. guianensis cv. Oxley），雖然從種名來看應(yīng)該分屬于不同種，但也存在著不同的觀點(diǎn)，如Orr D M等[18]認(rèn)為馬弓形柱花草來源于Oxley柱花草，是Oxley柱花草的早花品種。本實(shí)驗(yàn)分子標(biāo)記聚類結(jié)果顯示兩者聚成第Ⅲ類（見圖3），且兩者田間表型相似，都具有莖的生長(zhǎng)習(xí)性為斜倚型，葉片短小、植株矮小、早花等特點(diǎn)。但是否來源于同一個(gè)種，有待進(jìn)一步研究。

綜上所述，應(yīng)用SSR及SRAP標(biāo)記聚類分析的結(jié)果表明了供試的柱花草材料的遺傳關(guān)系與其地理分布、生態(tài)類型、形態(tài)特征等具有一定的相關(guān)性。能夠有效分析柱花草種質(zhì)的親緣關(guān)系和遺傳多樣性。綜合2種標(biāo)記協(xié)同的方法，對(duì)柱花草基因的功能區(qū)域和全基因組有較好的檢測(cè)能力，對(duì)柱花草種質(zhì)資源的鑒定、利用及其育種實(shí)踐等具有一定的參考價(jià)值。

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