許文江等

摘 要 以7株拮抗細菌對蝴蝶蘭葉基腐病菌進行室內抑菌及小區(qū)防病試驗。室內平板對峙法結果表明：以蘭花內生枯草桿菌FJAT-9986的拮抗作用最強，其抑菌率為61.90%；JK-2抑菌率為50.44%；FJAT-8769的拮抗作用最弱，抑制率僅為34.09%。抑菌圈法復篩測定結果表明，菌株JK-2對蝴蝶蘭葉基腐病菌的抑制作用最強，其抑菌圈直徑為22.42 mm。拮抗細菌對病原菌孢子萌發(fā)實驗結果表明，稀釋50倍后，JK-2顯示出強的抑制病原菌孢子的萌發(fā)作用，對蝴蝶蘭葉基腐病的田間防效為76.7%，表明JK-2可作為田間防治的菌株。

關鍵詞 拮抗細菌；蝴蝶蘭葉基腐病菌；抑菌作用；防效評價

中圖分類號 S432.4 文獻標識碼 A

Inhibition of Seven Strains of Antagonistic Bacteria Against the Pathogen of Butterfly Orchid Leaf Based Rot

XU Wenjiang1， LI Jinyu1， LIN Zhikai1， HUANG Yuhuan1， LIN Qinghong1， GE Cibin2

1 Fujian Institute of Subtropical Botany， Xiamen， Fujian 361006， China

2 Agro-bio Resource Research Institut， Fujian Academy of Agricultural Science， Fuzhou， Fujian 350000， China

Abstract Seven strains of antagonistic bacteria were studied for biocontrol effect and inhition against the pathogen of butterfly orchid leaf based rot. The result of pairing culture showed that Bacillus subtilis of orchids' antagonism with a bacteriostatic rate 61.90% is the strongest， followed by JK-2（bacteriostatic rate 50.44%）and FJAT-8769（inhibition rate 34.09%）based on bacteriostatic ring method complex screen test. The inhibitory effect of JK-2 aim at butterfly orchid leaf based rot germs was the strongest， and the inhibition zone diameter was 22.42 mm. The antagonistic bacteria for pathogen spore germination test after dilution 50 times revealed JK-2 showed stronger inhibitory pathogen spore germination effect. Field experiments showed JK-2 exhibited a inhibition rate 76.7%. In conclusion JK-2 can be used as a test strain in field to control butterfly orchid leaf based rot disease.

Key words Antagonistic bacteria；Fusarium solani；Inhibition；Control efficiency

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2014.08.026

蝴蝶蘭（Phalaenopsis）為蘭科蝴蝶蘭屬的美麗草本花卉，其姿態(tài)優(yōu)美、花色艷麗，形似蝴蝶，開花期長，在熱帶蘭中素有“蘭花皇后”的美稱，深受世界各國人民的喜愛。近幾年，蝴蝶蘭在國內的年宵花卉市場上無比暢銷，盡管種植數(shù)量迅速增加，但高質量的蝴蝶蘭仍能銷售一空。然而，在蝴蝶蘭的栽培中，常受蝴蝶蘭葉基腐病的危害，最下部葉基受侵染后，產(chǎn)生黑色小點、水漬狀、形態(tài)半圓形或不規(guī)則病斑，后期葉片失水黃化、紅化，葉基部出現(xiàn)灰白色菌核，紅褐色的子座組織，然后病斑擴展至整個葉基部，葉片斷裂、脫落，繼續(xù)侵染上一片葉基部，直至整株枯死[1]。發(fā)病率輕者為5%，重者達20%左右，嚴重危害蝴蝶蘭的人工栽培。

目前，蝴蝶蘭產(chǎn)區(qū)都是以化學防治為主，造成環(huán)境污染，病原菌抗藥性。Thangavelu等[2]報道熒光假單胞桿菌（P. fluorescens）和枯草芽孢桿菌（Bacillussubtilis）對香蕉枯萎病的防治效果可達41%。曹理想等[3]發(fā)現(xiàn)玫瑰淺灰鏈霉菌（Streptomyces roseogriseolus）對香蕉枯萎病有一定的拮抗作用。肖愛萍等[4]從果園土壤中分離到1株對香蕉枯萎病有顯著抑制作用的假單胞桿菌。至今國內外還沒有蝴蝶蘭葉基腐病生物防治方面的報道，本試驗采用銅綠假單胞桿菌FJAT-346、短短芽胞桿菌JK-2、芽胞桿菌FJAT-8789、FJAT-8769、FJAT-8756、FJAT-8767、蘭花內生枯草芽胞桿菌FJAT-9986等菌株對蝴蝶蘭葉基腐病菌的室內抑制活性和田間小區(qū)防效，以期為生產(chǎn)上該病害的有效防控提供基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

病原菌：蝴蝶蘭葉基腐病菌（Fusarium solani）[1]由福建省亞熱帶植物研究所自行分離、純化、回接獲得。

供試細菌：銅綠假單胞桿菌FJAT-346、短短芽胞桿菌JK-2、芽胞桿菌FJAT-8789、FJAT-8769、FJAT-8756、FJAT-8767、蘭花內生枯草芽胞桿菌FJAT-9986等菌株由福建省農業(yè)科學院農業(yè)生物資源研究所農業(yè)微生物研究中心提供。

供試培養(yǎng)基：PDA固體培養(yǎng)基、NA固體培養(yǎng)基、NB液體培養(yǎng)基。

蝴蝶蘭品種：甜新由廈門國際航空港花卉科技有限公司蝴蝶蘭生產(chǎn)基地提供。

1.2 方法

1.2.1 平板對峙法初篩對病原菌具有拮抗作用的拮抗菌 采用PDA平板對峙法，在PDA培養(yǎng)基平板中間接入直徑6 mm生長旺盛的病原菌菌餅，同時在距離菌餅中間2.5 cm處的PDA平板的一側或相對稱的兩側，用接種環(huán)劃直線接種活化后的各細菌菌株，放置于28 ℃培養(yǎng)箱內培養(yǎng)；以不接細菌的平板為對照，每處理重復3次；接種3、5 d后，觀察病原菌菌落的生長情況，測量菌落半徑，并計算各細菌對病原菌的抑制率[2-8]。

抑菌率/%=（對照菌落半徑-處理菌落半徑）/對照菌落半徑×100%

1.2.2 抑菌圈法復篩對病原菌具有拮抗作用的拮抗菌 收集對峙培養(yǎng)法中篩選出的細菌菌株，用NB液體培養(yǎng)基（瓶裝量30 mL/250 mL三角瓶），30 ℃、200 r/min下振蕩培養(yǎng)；48 h后收集培養(yǎng)液，8 000 r/min離心5 min，收集上清液，用細菌過濾器過濾除菌，得無菌濾液，測得OD值為0.87，菌體數(shù)為2.4×109 cfu/mL，備用。

病原菌孢子懸液的制備：PDA培養(yǎng)基平板接種病原菌，28 ℃下培養(yǎng)7 d后，平板上長滿棉花狀的病原菌菌落，向平板內加入適量（約10 mL）無菌水，用無菌涂布棒刮菌落表面，使菌絲及孢子懸浮在無菌水中；收集孢子及菌絲懸液，用無菌紗布濾去菌絲體，得孢子懸液（濃度需在1.0×108 cfu/mL），備用。

吸取鐮刀菌孢子懸液0.5 mL，加入到熔化并冷卻到50 ℃左右、呈熔融態(tài)、0.7%瓊脂的6 mL PDA培養(yǎng)基內，混合均勻后，作為上層培養(yǎng)基，倒入預先已凝固的PDA平板上。

待上層培養(yǎng)基凝固后，用直徑0.6 cm的打孔器在每塊平板上打4個孔，用移液槍分別向每個孔內加入不同的細菌培養(yǎng)液無菌濾液各100 μL，以無菌水做對照，然后將平板放置在26 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)72 h后，采用十字法測量抑菌圈的直徑，比較各菌株抑制病原菌能力的大小[2-8]。

1.2.3 拮抗菌培養(yǎng)液對病原菌孢子萌發(fā)的抑制作用 對抑菌圈試驗篩選出的拮抗菌，按1.2.2的方法制備無菌濾液，并分別用無菌水配制成5、25倍的稀釋液。按1.2.2的方法制備病原菌孢子懸液，并用無菌水稀釋至1.0×106 cfu/mL；取病原菌孢子懸液與不同濃度的拮抗菌培養(yǎng)液各1 mL，加入到無菌試管（18 mm×180 mm）中，混勻，置28 ℃、100 r/min下振蕩培養(yǎng)12 h，以無菌水和相應稀釋倍數(shù)的NB液體培養(yǎng)基為對照。每處理重復3次。每重復隨機鏡檢10個視野，鏡檢的小型孢子數(shù)為200以上，觀察孢子的萌發(fā)狀況（以萌發(fā)的芽管超過孢子長徑的一半或與短徑等長視為萌發(fā)），統(tǒng)計孢子萌發(fā)數(shù)與未萌發(fā)數(shù)，并計算各拮抗菌培養(yǎng)液最終稀釋成2、10、50倍條件下的孢子萌發(fā)抑制率。

1.2.4 田間小區(qū)試驗 田間小區(qū)在福建省亞熱帶植物研究所溫室試驗地進行，選擇健康無病中苗期的蝴蝶蘭植株200株，每小區(qū)66～67株，重復3次，隨機排列。JK-2菌株OD值為0.87，稀釋100倍，每株100 mL，10 d施1次，共施6次，以清水為對照，于最后一次施藥后30 d進行調查，統(tǒng)計發(fā)病株數(shù)，并計算發(fā)病率和防治效果[9]。

2 結果與分析

2.1 平板對峙法初篩的結果

由表1和圖1可知，通過平板對峙培養(yǎng)，7株細菌菌株拮抗作用測定結果表明，在處理2 d后，JK-2等7株即表現(xiàn)出對病原菌的拮抗作用，其中以蘭花內生枯草桿菌FJAT-9986的拮抗作用最強，對病原菌的抑制率達36.39%；菌株FJAT-8781的拮抗作用其次，抑制率為20.49%。處理5 d后，處理組病原菌的生長進一步受到抑制，對照組病原菌生長正常，使得各拮抗細菌的抑制率上升；蘭花內生枯草桿菌FJAT-9986仍表現(xiàn)出最強的拮抗作用，抑制率為61.90；JK-2、芽胞桿菌FJAT-8781、FJAT346、FJAT-8756、FJAT-8767等菌株對蝴蝶蘭葉基腐病菌的拮抗作用也較強，抑制率均在46%以上；菌株FJAT-8769的拮抗作用最弱，抑制率僅為34.09%。

2.2 抑菌圈法復篩的結果

用抑菌圈法對平板對峙試驗篩選出的拮抗細菌進行復篩，結果見表2和圖2。菌株JK-2對蝴蝶蘭葉基腐病菌的抑制作用最強，處理3 d后的抑菌圈直徑為22.42 mm，顯著大于其它6個菌株的抑菌圈直徑；芽胞桿菌FJAT-8781、蘭花內生枯草桿菌、FJAT-346對病原菌的抑制作用也較強，其抑菌圈直徑分別為17.73、14.19、10.57 mm；菌株FJAT-8756、FJAT-8767、FJAT-8769在病原菌平板上未形成抑菌圈，因此，對病原菌未表現(xiàn)出抑制作用。

2.3 拮抗細菌培養(yǎng)液對病原菌孢子萌發(fā)的抑制作用

由表3可知，菌株JK-2和FJAT-8781對病原菌孢子萌發(fā)的抑制作用最強，這2個菌株培養(yǎng)液2、10、50倍稀釋液對病原菌孢子萌發(fā)均有抑制作用，其中以2倍稀釋液處理組的孢子萌發(fā)率最低，50倍稀釋液處理組的孢子萌發(fā)率最高。與相應稀釋倍數(shù)的NB培養(yǎng)液處理組相比，菌株JK-2和FJAT-8781培養(yǎng)液2、10、50倍稀釋液處理組中，其對病原菌孢子萌發(fā)的抑制率分別為99.94%、96.57%、92.30%和99.28%、95.28%、35.23%。比較菌株JK-2和FJAT-8781對病原菌孢子萌發(fā)的抑制作用，結果表明，在稀釋2、10倍的條件下，這2個菌株培養(yǎng)液抑制率間的差異不顯著；而稀釋50倍后，JK-2的抑制率顯著大于FJAT-8781，顯示出強的抑制病原菌孢子萌發(fā)的作用。

2.4 JK-2對蝴蝶蘭葉基腐病的田間防治效果

田間小區(qū)試驗在本所的試驗地進行，在處理30 d后，清水對照區(qū)的發(fā)病率為60%，JK-2處理的發(fā)病率為14%，JK-2的防治效果為76.7%。

3 討論與結論

平板對峙法結果表明，以蘭花內生枯草桿菌FJAT-9986的拮抗作用最強，抑菌率為61.90%；JK-2抑菌率為50.44%；FJAT-8769的拮抗作用最弱，抑制率僅為34.09%。

抑菌圈法結果表明，菌株JK-2對蝴蝶蘭葉基腐病原菌菌絲的抑制作用最強，其抑菌圈直徑為22.42 mm，芽胞桿菌FJAT-8781次之，處理3 d后的抑菌圈直徑為17.73 mm，菌株FJAT-8756、FJAT-8767、FJAT-8769未形成抑菌圈，因此，對病原菌未表現(xiàn)出抑制作用。

拮抗細菌對病原菌孢子萌發(fā)結果表明，菌株JK-2和FJAT-8781稀釋2、10倍，抑制率間的差異不顯著；而稀釋50倍后，JK-2顯示出強的抑制病原菌孢子萌發(fā)作用，可作為田間防治蝴蝶蘭葉基腐病的菌株。

JK-2菌株田間防治蝴蝶蘭葉基腐病，其防治效果為76.7%。

郝曉娟等[9]認為短短芽胞桿菌JK-2菌株對番茄枯萎病的拮抗作用表現(xiàn)為造成枯萎病菌菌絲消解、產(chǎn)生泡狀物、破壞生長點。但本平板對峙法及抑菌圈法結果顯示短短芽胞桿菌JK-2菌株對蝴蝶蘭葉基腐病病原菌菌絲、孢子有有很強抑制效果，但其對不同的病菌是否產(chǎn)生不同拮抗反應，還有待進一步研究。

參考文獻

[1] 林清洪， 林光榮， 曾碧玉，等. 蝴蝶蘭葉基腐病病原鑒定及生物學特性[J]. 熱帶作物學報， 2007， 28（4）： 93-97.

[2] Thangavelu R， Paaniswami A， Doraiswamy S， et al. The effect of Pseudomonas fluorescens and Fusarium oxyaporum f. sp. cubenseon induction of defence enzymes and phenolics in banana[J]. Biological Plantarum， 2003， 46（1）： 107-110.

[3] 曹理想， 田新莉， 周世寧. 香蕉內生真菌、 放線菌類群分析[J]. 中山大學學報（自然科學版）， 2003， 42（2）： 70-73.

[4] 肖愛萍， 李庚花， 游春平， 等. 5株拮抗細菌對香蕉枯萎病的抑制作用[J]. 江西農業(yè)大學學報， 2005， 27（4）： 572-575.

[5] 岳 菊， 劉郵洲， 張榮勝， 等. 西瓜枯萎菌拮抗細菌的篩選、鑒定及防效測定[J]. 中國生物防治學報， 2011， 27（3）： 428-432.

[6] 程 亮， 肖愛萍， 游春平. 拮抗菌對香蕉枯萎病菌的抑菌作用初步研究[J]. 仲愷農業(yè)技術學院學報， 2005， 18（1）： 9-13.

[7] 馬紅娟， 楊秀娟， 阮宏椿，等. 拮抗細菌對香蕉枯萎病菌的離體抑菌活性研究[J]. 福建農業(yè)學報， 2008， 23（3）： 251-254.

[8] 黃小光， 徐志宏， 鄺哲師， 等. 香蕉枯萎病拮抗菌篩選試驗[J]. 廣東農業(yè)科學， 2006， 33（11）： 96-99.

[9] 郝曉娟， 劉 波， 謝關林，等. 短短芽孢桿菌JK-2菌株對番茄枯萎病的抑菌作用及小區(qū)防效[J]. 中國生物防治， 2007， 23（3）： 233-236.