李曉霞等

摘 要 采用水蒸氣蒸餾法提取金鐘藤葉中的揮發(fā)油，利用GC-MS聯(lián)用技術(shù)對(duì)金鐘藤葉揮發(fā)油進(jìn)行分析，并以蘿卜（Raphanus sativus）、萵苣（Lactuca sativa）、水稻（Oryza sativa）和紅尾翎（Digitaria radicosa）為供試植物，采用培養(yǎng)皿濾紙法對(duì)金鐘藤葉揮發(fā)油飽和水溶液的化感效應(yīng)進(jìn)行生物測(cè)定。經(jīng)GC-MS分析，從金鐘藤葉揮發(fā)油中鑒定出41種化合物，占總油量的95.32%。其中含量較高的為β-欖香烯（24.64%）、β-丁香烯（21.61%）、（Z）-β-香檸檬烯（6.11%）、α-葎草烯（6.00%）、雙環(huán)大牻牛兒烯（5.36%）、植醇（3.24%）、藍(lán)桉醇（2.43%）等萜類(lèi)、醇類(lèi)等化合物，占揮發(fā)油總量的95.32%。生測(cè)結(jié)果顯示，金鐘藤葉揮發(fā)油飽和水溶液對(duì)萵苣、蘿卜、水稻和紅尾翎4種受試植物的種子萌發(fā)均產(chǎn)生抑制作用，對(duì)萵苣、蘿卜和紅尾翎幼苗生長(zhǎng)表現(xiàn)為抑制作用，而對(duì)水稻幼苗生長(zhǎng)具有顯著促進(jìn)作用。

關(guān)鍵詞 金鐘藤；葉揮發(fā)油；GC-MS；化感作用

中圖分類(lèi)號(hào) O657；S451 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A

Chemical Compositions and Allelopathic Potential of

Volatile Oil from Merremia boisiana

LI Xiaoxia， HUANG Qiaoqiao， FAN Zhiwei *， SHEN Yide *， CHENG Hanting， LIU Lizhen

Environment and Plant Protection Institute， Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences/Key Laboratory of Integrated Pest Management on Tropical Crops， Ministry of Agriculture， China/Danzhou Scientific Observing and Experimental Station of Agro-Environment， Ministry of Agriculture， China/Hainan Key Laboratory for Monitoring and Control of Tropical Agricultural Pests， Haikou， Hainan 571101， China

Αbstract Volatile oil was obtained from the leaves of Merremia boisiana by steam distillation method， and main chemical components in the essential oil were identified by gaschromatography-mass. Allelopathy of volatile oil with saturated aqueous solution from M. boisiana on seed germination and seedling growth of 4 accompanying plant， Raphanus sativus， Digitaria radicosa， Oryza sativa and Lactuca sativa was bioassayed by culture dish method.Forty-one compounds were identified from the volatile oils of the inflorescence， accounting for 95.32% of the total volatile oil. The major constituents were identified as β-Elemene（24.64%）， β-Caryophyllene（21.61%）， （Z）-β-Bergamotene（6.11%）， α-Humulene（6.00%）， Bicyclogermacrene（5.36%）， Phytol（3.24%）and Globulol（2.43%）. The biological test results demonstrated that volatile oil of M. boisiana could inhibit the seed germination of all tested plants， and could inhibit the seedling growth of R. sativus， L. sativa and D. radicosa， but promoted the seedling growth of O. sativa.

Key words Merremia boisiana； Leaves of volatile oil； GS-MS； Allelopathy

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2014.08.033

金鐘藤[Merremia boisiana（Gagn.） v. Ooststr.]是旋花科（Convolvulaceae）魚(yú)黃草屬（Merremia Dennst.）植物，目前已在廣東、海南等地迅速蔓延擴(kuò)散成災(zāi)，是我國(guó)熱帶地區(qū)新近暴發(fā)的惡性雜草之一[1-2]。金鐘藤主要通過(guò)種子和藤莖進(jìn)行繁殖，一旦成功侵入草地、林地和荒地便可連片生長(zhǎng)，可“獨(dú)株成片”而形成單優(yōu)勢(shì)群落[3]，給生態(tài)環(huán)境造成極大威脅[4-5]。因此，關(guān)于金鐘藤如何入侵及如何迅速占據(jù)強(qiáng)大生態(tài)位的研究成為當(dāng)下重要的課題。研究發(fā)現(xiàn)，金鐘藤水提物對(duì)菜薹種子萌發(fā)有抑制作用[6]，說(shuō)明這與其含有豐富的次生代謝物質(zhì)有關(guān)；其次，高廣春等[7]對(duì)金鐘藤的酚類(lèi)化合物進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)東莨菪內(nèi)酯和槲皮素具有抑制植物生長(zhǎng)和抗菌的作用；最近，2013年黃喬喬等[8]關(guān)于金鐘藤的研究中也認(rèn)為其化感作用能抑制蔬菜種子的萌發(fā)及伴生植物的生長(zhǎng)。綜合上述研究，初步預(yù)測(cè)化感作用可能促進(jìn)了金鐘藤的競(jìng)爭(zhēng)能力。之前，筆者對(duì)金鐘藤葉脂溶性成分分析中發(fā)現(xiàn)烯類(lèi)、醇類(lèi)、萜類(lèi)、酚類(lèi)和酯類(lèi)等多種具有化感作用的化合物[9]，然而關(guān)于金鐘藤葉揮發(fā)油化學(xué)成分及其化感作用的研究尚未展開(kāi)，因此筆者采用氣相色譜-質(zhì)譜（GC-MS）聯(lián)用技術(shù)，對(duì)其揮發(fā)油主要化學(xué)成分進(jìn)行分析，并采用培養(yǎng)皿濾紙法測(cè)定了金鐘藤葉揮發(fā)油飽和水溶液對(duì)蘿卜（Raphanus sativus Linnaeus）、萵苣（Lactuca sativa Linnaeus）、水稻（Oryza sativa Linnaeus）和紅尾翎[Digitaria radicosa（J. Presl）Miquel]4種供試植物種子萌發(fā)和幼苗生長(zhǎng)的影響，以明確金鐘藤葉中次生物質(zhì)的化學(xué)成分，為揭示它與其他生物之間的化學(xué)關(guān)系及闡明它所具有的強(qiáng)大生存競(jìng)爭(zhēng)能力提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 植物材料 金鐘藤葉于2012年7月采自海南省白沙縣。

1.1.2 儀器與試劑 毛細(xì)管氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀（HP6890/HP5973 GC/MS聯(lián)用儀）（美國(guó)安捷倫公司）；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海亞榮生化儀器廠生產(chǎn)）。所用試劑均為分析純。

1.2 方法

1.2.1 揮發(fā)油的提取 取新鮮的金鐘藤葉325.0 mg，按《中華人民共和國(guó)藥典》2005年版第一部附錄[10]中的水蒸汽蒸餾方法，對(duì)金鐘藤葉的揮發(fā)油進(jìn)行提取，得到淡黃色油狀物，經(jīng)無(wú)水硫酸鈉干燥后，得金鐘藤葉揮發(fā)油0.42 g，得油率為0.13%。

1.2.2 揮發(fā)油GC-MS分析方法 提取所得的揮發(fā)油經(jīng)氯仿溶解后進(jìn)行氣相色譜和質(zhì)譜測(cè)定。

檢測(cè)儀器：儀器為美國(guó)惠普公司的毛細(xì)管氣相色譜G質(zhì)譜聯(lián)用儀（HP6890/HP5973GC/MS聯(lián)用儀）。

氣相色譜條件：色譜柱為ZB-5MSI 5% Phenyl-95% DiMethylpolysiloxane（30 m×0.25 mm×0.25 μm）彈性石英毛細(xì)管柱，柱溫45 ℃（保留2 min），以5 ℃/min升溫至320 ℃，保持5 min；汽化室溫度250 ℃；載氣為高純He（99.999%）；柱前壓52.54 kPa，載氣流量1.0 mL/min；分流比50 ∶ 1，溶劑延遲時(shí)間為4.0 min。

質(zhì)譜測(cè)定條件：離子源為EI源；離子源溫度230 ℃；四極桿溫度150 ℃；電子能量70 eV；發(fā)射電流34.6 μA；倍增器電壓1 236 V；接口溫度280 ℃；質(zhì)量范圍20～500 u。

數(shù)據(jù)處理及質(zhì)譜檢索：通過(guò)HPMSD化學(xué)工作站，結(jié)合NIST2005標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)譜圖庫(kù)和WILEY275質(zhì)譜圖庫(kù)進(jìn)行鑒定，采用色譜峰面積歸一化法計(jì)算相對(duì)含量。

1.2.3 揮發(fā)油化感作用的生物測(cè)定 揮發(fā)油化感作用的生物測(cè)定方法參照王朋等[11]的方法。取適量金鐘藤揮發(fā)油加入500 mL分液漏斗中，充分震蕩，保持液面有油滴后靜置過(guò)夜。取下層清液，即金鐘藤揮發(fā)油飽和水溶液[30 ℃時(shí)飽和溶解度為（16.1±3.0）mg/L]用于生物活性測(cè)定。

將直徑為9 cm的培養(yǎng)皿洗凈、烘干，鋪2層滅菌定性濾紙，分別加金鐘藤揮發(fā)油飽和水溶液5 mL，以蒸餾水為對(duì)照，設(shè)3個(gè)重復(fù)。待濾紙浸濕后將飽滿、大小均勻的蘿卜、萵苣、水稻和紅尾翎種子各20粒放入培養(yǎng)皿中，置于人工氣候箱（濕度70%，溫度為25 ℃，光照時(shí)間14 h/d，光照強(qiáng)度20 000 lx）恒溫培養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)期間，保持濾紙濕潤(rùn)。每天觀察并記錄發(fā)芽種子的數(shù)量，連續(xù)統(tǒng)計(jì)7 d，計(jì)算最終發(fā)芽率（以胚根或胚軸突破種皮達(dá)1～2 mm為種子萌發(fā)標(biāo)準(zhǔn)）；7 d之后測(cè)定受體植物的根長(zhǎng)（胚軸末端至根末端的長(zhǎng)度）和苗高（胚軸頂端至幼苗頂端的長(zhǎng)度）。

1.3 數(shù)據(jù)分析及統(tǒng)計(jì)方法

對(duì)照抑制百分率=（1-處理/對(duì)照）×100%；實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用DPS7.55軟件進(jìn)行處理，并進(jìn)行差異顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 金鐘藤揮發(fā)油的主要化學(xué)成分及其相對(duì)含量

金鐘藤葉揮發(fā)油化學(xué)成分的總離子流如圖1，共分離出58個(gè)峰，采用計(jì)算機(jī)檢索各相應(yīng)的質(zhì)圖譜，并參考標(biāo)準(zhǔn)圖譜鑒定了41種化合物，占色譜總餾分出峰面積的95.32%，用峰面積歸一化法測(cè)定其質(zhì)量分?jǐn)?shù)，具體結(jié)果見(jiàn)表1。

分析結(jié)果顯示，金鐘藤葉揮發(fā)油化學(xué)成分以萜類(lèi)為主，占總量的85.92%，含量較高的成分依次為β-欖香烯（24.64%）、β-丁香烯（21.61%）、（Z）-β-香檸檬烯（6.11%）、α-葎草烯（6.00%）、雙環(huán)大牻牛兒烯（5.36%）、雅欖藍(lán)烯（2.39%）、σ-欖香烯（2.10%）、氧化石竹烯（2.09%）等。其次是醇類(lèi)，主要有植醇（3.24%）、藍(lán)桉醇（2.43%）等，占總量的9.96%。再次是烴類(lèi)占總量的3.87%。此外，還含有一些酯類(lèi)（占總量的0.15%）和酮類(lèi)（占總量的0.081%）。

2.2 金鐘藤葉揮發(fā)油飽和水溶液的化感作用

2.2.1 金鐘藤葉揮發(fā)油飽和水溶液對(duì)4種供試植物種子萌發(fā)的影響 金鐘藤葉揮發(fā)油飽和水溶液對(duì)萵苣、蘿卜、水稻和紅尾翎4種供試植物種子萌發(fā)抑制率的影響見(jiàn)圖2。從圖2可以看出，金鐘藤葉揮發(fā)油飽和水溶液對(duì)不同受體植物種子萌發(fā)具有不同的化感作用，其中，紅尾翎種子對(duì)揮發(fā)油最為敏感，抑制率達(dá)45.00%，顯著高于其他處理組；水稻種子萌發(fā)抑制程度僅次于紅尾翎，而揮發(fā)油飽和水溶液對(duì)萵苣和蘿卜種子萌發(fā)抑制作用不明顯。

2.2.2 金鐘藤葉揮發(fā)油飽和水溶液對(duì)4種供試植物幼苗生長(zhǎng)的影響 金鐘藤葉揮發(fā)油飽和水溶液對(duì)萵苣、蘿卜、水稻和紅尾翎4種供試植物幼苗生長(zhǎng)的影響見(jiàn)圖3。從供試植物來(lái)看，金鐘藤揮發(fā)油飽和水溶液對(duì)萵苣、蘿卜和紅尾翎根長(zhǎng)、莖長(zhǎng)都低于對(duì)照，說(shuō)明金鐘藤葉揮發(fā)油飽和水溶液對(duì)萵苣、蘿卜和紅尾翎的生長(zhǎng)均有抑制作用，其中紅尾翎幼苗的生長(zhǎng)受到的抑制作用顯著高于萵苣和蘿卜幼苗的生長(zhǎng)，且根長(zhǎng)的抑制作用（抑制率為79.99%）強(qiáng)于對(duì)莖長(zhǎng)的抑制作用（抑制率為66.55%）；而對(duì)水稻幼苗生長(zhǎng)的影響則表現(xiàn)為促進(jìn)作用。

3 討論與結(jié)論

本研究對(duì)金鐘藤葉揮發(fā)油化學(xué)成分分析中發(fā)現(xiàn)β-欖香烯（24.64%）、β-丁香烯（21.61%）、（Z）-β-香檸檬烯（6.11%）、氧化石竹烯（2.09%）等萜類(lèi)物質(zhì)相對(duì)含量占總揮發(fā)油的85.92%是金鐘藤葉揮發(fā)油的主要成分，此外還有植醇（3.24%）、藍(lán)桉醇（2.43%）、乙酸金合歡酯（0.15%）等醇、酯類(lèi)。研究結(jié)果表明，萜類(lèi)[12-18]、酯類(lèi)[18-19]、醇類(lèi)[20-21]和酮類(lèi)[21]等多種次生代謝物具有化感作用的功能。Nesrine Zahed[12]等對(duì)柔毛肖乳香（Schinus molle L.）果和葉揮發(fā)油化學(xué)成分及化感作用進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)柔毛肖乳香揮發(fā)油化學(xué)成分主要為β-phellendrene（35.9-65.4%）、α-phellendrene（24.3-20.1%）、月桂烯（12.8-7.7%）和α-蒎烯（5.9-1.7%）等萜類(lèi)化合物，其揮發(fā)油對(duì)小麥的化感作用呈現(xiàn)濃度效應(yīng)，且對(duì)小麥種子萌發(fā)和根長(zhǎng)的抑制效果較強(qiáng)；Bradow&Connick等[13]報(bào)道，植物精油中檸檬烯、蒎烯等萜類(lèi)化合物能強(qiáng)烈抑制種子發(fā)芽和幼苗生長(zhǎng)；馬瑞君等[14]對(duì)黃帚橐吾[Ligularia virgaurea（Mαxim.）Mattf. ex Rehd. & Kobuski]揮發(fā)物開(kāi)展了化感作用研究，發(fā)現(xiàn)該植物中含有大量的萜類(lèi)物質(zhì)，并證實(shí)了該物質(zhì)是引起其發(fā)生化感作用的基礎(chǔ)性物質(zhì)；于鳳蘭等[15]對(duì)油蒿（Αrtemisiα jαponicα Thunb.）揮發(fā)油化感作用研究中發(fā)現(xiàn)導(dǎo)致影響受體植物種子萌發(fā)和幼芽生長(zhǎng)的關(guān)鍵物質(zhì)是萜類(lèi)物質(zhì)；Muller等[16-17]認(rèn)為α-蒎烯、氧化石竹烯等萜類(lèi)不僅能通過(guò)呼吸作用影響其它植物生長(zhǎng)，還能通過(guò)淋溶帶入土壤，從而影響植物種子萌發(fā)和幼苗生長(zhǎng)。張曉芳等[18]的研究結(jié)果表明，白三葉草（Trifolium repens L.）揮發(fā)物對(duì)稗草和苘麻均有化感作用，其揮發(fā)物的化學(xué)成分以烯和酯類(lèi)化合物為主；Rice等[20]等證實(shí)三十烷醇是苜蓿（Medicago sativa L.）對(duì)作物起刺激作用的關(guān)鍵物質(zhì)；Αlan等[21]的研究結(jié)果表明，根系分泌的醇類(lèi)、酮類(lèi)能抑制和迫害其他植物生長(zhǎng)。Weidenhamer等[22]認(rèn)為揮發(fā)性化感物質(zhì)在水中具有一定的溶解度，且其水溶液有一定的化感作用。本研究中，金鐘藤葉揮發(fā)油飽和水溶液對(duì)供試植物表現(xiàn)出較強(qiáng)的生物活性，筆者認(rèn)為金鐘藤葉揮發(fā)油具有一定的水溶性，且其揮發(fā)油飽和水溶液化學(xué)成分中含有多種具潛在化感功能的物質(zhì)，但要明確其具體揮發(fā)性化感成分，還需進(jìn)一步研究。

本研究發(fā)現(xiàn)經(jīng)金鐘藤葉揮發(fā)油飽和水溶液處理后萵苣、蘿卜、水稻和紅尾翎種植物種子發(fā)芽率都受到抑制，且對(duì)紅尾翎的種子發(fā)芽率抑制作用最強(qiáng)；金鐘藤葉揮發(fā)油飽和水溶液對(duì)萵苣、蘿卜和紅尾翎幼苗的生長(zhǎng)均有抑制作用，而對(duì)水稻幼苗的生長(zhǎng)表現(xiàn)為促進(jìn)作用。結(jié)合上述結(jié)果初步證實(shí)金鐘藤葉揮發(fā)油具化感作用，然而其葉片揮發(fā)油中何種化合物是致感因子將需進(jìn)一步深入研究。

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