桑利偉等

摘 要 采用形態(tài)特征鑒定及rDNA-ITS序列分析相結(jié)合的方法，對(duì)海南可可黑果病病原進(jìn)行鑒定，并通過定點(diǎn)連續(xù)調(diào)查研究該病在海南的發(fā)生規(guī)律。結(jié)果表明，該病病原為柑橘褐腐疫霉（Phytophthora citrophthora）。降雨量對(duì)該病的發(fā)生有著顯著的影響，在海南發(fā)病高峰期一般在9～11月份。

關(guān)鍵詞 可可黑果??；病原鑒定；核糖體DNA-ITS；發(fā)病規(guī)律

中圖分類號(hào) S432.44 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼A

Pathogen Identification and Occurrence of Cacao

Black Pod in Hainan Province

SANG Liwei1，2， LIU Aiqin1，2 *， SUN Shiwei1，2， GAO Shengfeng1，2

GOU Yafeng1，2， TAN Lehe1，2

1 Spice and Beverage Research Institute， CATAS， Wanning， Hainan 571533， China

2 Hainan Provincial Key Laboratory of Genetic Improvement and Quality Regulation for Tropical Spice and

Beverage Crops， Wanning， Hainan 571533， China

Abstract Cacao Black pod is an important disease threatening cocoa industry， The pathogen and occurrence of cacao black pod were studied through the morphological characteristics and the sequence of ribosomal DNA-ITS.Results showed that the pathogen from Hainan was Phytophthora citrophthora and the weather condition had obvious effects on the occurrence of the disease， especially for rainfall. The period of peak incidence in Hainan is September - November.

Key words Cacao Black pod； Pathogen identification； Ribosomal DNA-ITS； Occurrence

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2014.08.023

可可（Theobroma cacao L.）是世界三大飲料作物之一，產(chǎn)量?jī)H次于咖啡和茶葉?？煽晒麑?shí)營養(yǎng)豐富，味醇香，具有興奮與滋補(bǔ)作用，可可豆加工成可可脂和可可粉，可可脂主要用于制作巧克力，可可粉用來配制高級(jí)飲料。現(xiàn)在世界主要產(chǎn)地為委內(nèi)瑞拉、巴西、加納等熱帶地區(qū)。中國1922年引入臺(tái)灣，1954年引入海南島試種[1]。1960年中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院香料飲料研究所（原興隆試驗(yàn)站，以下簡(jiǎn)稱“香飲所”）引種試種，對(duì)可可的生物學(xué)特性及適應(yīng)性進(jìn)行了長(zhǎng)期系統(tǒng)的觀察研究，證實(shí)可可適合在海南省東南部發(fā)展[2]。目前，海南省可可種植面積為70多hm2，主要分布在萬寧和陵水。目前我國所需可可豆主要靠進(jìn)口，種植可可市場(chǎng)前景廣闊。

可可黑果?。ㄓ址Q可可疫?。┦菫楹煽勺顕?yán)重的一種真菌病害，主要危害可可果實(shí)，引起黑色腐爛，產(chǎn)量損失可達(dá)50%[3]。2010年10月，在香飲所可可種植園首次發(fā)現(xiàn)該病，主要為害嫩果，為害率達(dá)15%左右。此后有擴(kuò)大蔓延之勢(shì)，對(duì)可可產(chǎn)業(yè)的推廣發(fā)展造成很大威脅。準(zhǔn)確地鑒定引起該病的病原菌并摸清其發(fā)生規(guī)律是制定防控策略的基礎(chǔ)。國外報(bào)道可可黑果病的病原主要有Phytophthora palmivora、P. citrophthora、P. megakarya、P. capsici等[4]，其中，Phytophthora palmivora是世界性分布，P. citrophthora和P. capsici主要為害巴西、印度、墨西哥等的可可果，P. megakarya則在喀麥隆、加蓬、加納、尼日利亞等的受害可可果中被發(fā)現(xiàn)。關(guān)于海南省可可黑果病的病原及其發(fā)生規(guī)律還未見報(bào)道。本研究采用形態(tài)學(xué)特征鑒定和核糖體DNA-ITS 序列分析相結(jié)合，對(duì)海南可可黑果病病原進(jìn)行鑒定；通過定點(diǎn)定期觀察，摸清該病發(fā)生流行與氣候條件之間的關(guān)系，以期為進(jìn)一步開展可可黑果病防治技術(shù)研究提供科學(xué)依據(jù)，為海南可可產(chǎn)業(yè)的快速發(fā)展提供技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 從香飲所可可種植基地發(fā)生可可黑果病的果實(shí)中分離獲得致病菌株“kk6a”，保存于香飲所病蟲害防控研究室。

1.1.2 試驗(yàn)試劑 PDA培養(yǎng)基：稱取200 g馬鈴薯切成小塊，加水煮爛（煮沸20～30 min，能被玻璃棒戳破即可），用四層紗布過濾，再加葡萄糖16 g和瓊脂15 g，繼續(xù)加熱攪拌混勻，稍冷卻后加去離子水至1 000 mL，（121 ℃）滅菌20 min左右后取出備用。

快速DNA提取檢測(cè)試劑盒（KG203）：由天根生化科技（北京）有限公司生產(chǎn)。

1.1.3 試驗(yàn)儀器 專業(yè)顯微數(shù)碼攝像系統(tǒng)、PCR儀、凝膠成像系統(tǒng)、高速冷凍離心機(jī)等。

1.2 方法

1.2.1 病原菌分離及其致病性測(cè)定 從香飲所可可種植基地采集發(fā)病的可可果樣品帶回實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行分離，同時(shí)記錄田間為害癥狀，分離及致病性測(cè)定方法參見文獻(xiàn)[5]。

1.2.2 病原菌鑒定

（1）形態(tài)特征鑒定。方法參見文獻(xiàn)[6]。將病原菌接種到PDA培養(yǎng)基平板上培養(yǎng)5 d后，觀測(cè)菌落、菌絲的形態(tài)特征；從菌落邊緣切取1.5 mm×1.5 mm的菌絲塊，移至滅菌水中，在25 ℃光照條件下培養(yǎng)5 d，每隔12 h換1次滅菌水，在顯微鏡下觀測(cè)孢子囊的形態(tài)大小等特征；將待測(cè)菌株分別與Phytophthora palmivora A1、A2標(biāo)準(zhǔn)菌株在PDA平板上進(jìn)行配對(duì)培養(yǎng)，半個(gè)月后觀察是否產(chǎn)生卵孢子。

（2）rDNA-ITS序列分析?；蚪MDNA提取、PCR反應(yīng)參數(shù)以及擴(kuò)增產(chǎn)物的克隆參照王源超[7]的方法，采用通用引物ITS1：5′-TCCGTAGGTGAAC

CTGCGG-3′和ITS4：5′-TCCTCCGCTTATTGATAT

GC-3′，PCR產(chǎn)物送交上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司進(jìn)行測(cè)序。利用Mega 5.0系統(tǒng)發(fā)育分析軟件對(duì)病原菌rDNA-ITS序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.2.3 發(fā)生規(guī)律觀察 2011～2013年，在香飲所可可種植基地隨機(jī)選取5個(gè)小區(qū)[8]，每小區(qū)選10株，小區(qū)面積50 m2，共50株。每隔10 d調(diào)查1次，每月調(diào)查3次，計(jì)算每個(gè)月的平均發(fā)病率。試驗(yàn)小區(qū)生長(zhǎng)季節(jié)不進(jìn)行藥劑防治，水肥管理及農(nóng)事操作正常進(jìn)行。每月平均降雨量、平均溫度及相對(duì)濕度等氣象資料由萬寧市氣象局和香飲所生態(tài)研究室提供。運(yùn)用SPSS軟件，分析病害發(fā)生率同降雨量、溫度及相對(duì)濕度等氣象因子之間的相關(guān)性。

2 結(jié)果與分析

2.1 為害癥狀

病菌主要侵害莢果。莢果染病（圖1），開始在果面出現(xiàn)細(xì)小的半透明斑點(diǎn)，很快變褐色，后變黑色，斑點(diǎn)迅速擴(kuò)大，直到整個(gè)莢果表面被黑色斑塊覆蓋。潮濕時(shí)病果表面長(zhǎng)出一層白色霉?fàn)钗?，剖開病果內(nèi)部組織變褐色。后期病果干縮、變黑、不脫落。

2.2 病原菌分離及其致病性測(cè)定

從采集的樣品中分離獲得菌株“kk6a”。按照柯赫氏法則，結(jié)果發(fā)現(xiàn)將菌株“kk6a”回接后可可果的表現(xiàn)癥狀與田間自然為害癥狀一致（圖2），且從發(fā)病可可果上可以重新分離到該菌株，因此確定菌株“kk6a”是可可黑果病的致病菌。

2.3 病原菌鑒定

2.3.1 形態(tài)特征 菌株kk6a在PDA培養(yǎng)基上菌落生長(zhǎng)茂盛，絨毛或綿絮狀，呈白色（圖3）。菌絲粗2～6 μm，平均4 μm；具少量球形菌絲膨大體，頂生，直徑24～35 μm（圖4～5）。孢子囊形態(tài)變異較大，卵形、橢圓形、倒梨形或不規(guī)則形，基部圓形，大小為29～91 μm×25～49 μm，平均60 μm×30.2 μm，長(zhǎng)寬比為1.1～2.1，平均1.7；具明顯乳突，大多1個(gè)，少數(shù)2個(gè)，乳突高2～6 μm；孢子囊不脫落，柄長(zhǎng)8～20 μm。孢囊梗簡(jiǎn)單合軸分枝、不規(guī)則分枝或不分枝，粗1.5～4.0 μm（圖6）。在PDA培養(yǎng)基上與標(biāo)準(zhǔn)菌配對(duì)培養(yǎng)，未見有性器官產(chǎn)生。

以上形態(tài)特征表明，菌株kk6a可能是柑橘褐腐疫霉（Phytophthora citrophthora）。

2.3.2 rDNA-ITS序列分析 分析結(jié)果表明，菌株“kk6a”的rDNA-ITS基因序列長(zhǎng)度為828 bp（GenBank登錄號(hào)為KF269243）。將菌株kk6a的rDNA-ITS序列在GenBank中進(jìn)行同源性比對(duì)，發(fā)現(xiàn)與其同源性最高的150個(gè)ITS序列菌株全部為疫霉菌，同源性達(dá)到94%～100%，其中與菌株KF269243.1、GU111603.1、GU111602.1的同源性分別為100%、99%和99%，這3個(gè)菌株均為柑橘褐腐疫霉（Phytophthora citrophthora）。結(jié)合形態(tài)學(xué)特征和核糖體DNA-ITS序列的分析，進(jìn)一步利用Mega 5.0系統(tǒng)發(fā)育分析軟件建立菌株kk6a的系統(tǒng)發(fā)育樹，結(jié)果是菌株kk6a的序列與GenBank中Phytophthora citrophthora（登錄號(hào)：KF269243.1）的遺傳距離最近，位于系統(tǒng)發(fā)育樹的同一分支（圖7）。進(jìn)一步證明了本研究從香飲所可可種植基地受害果中分離的致病菌kk6a為柑橘褐腐疫霉（Phytophthora citrophthora）。

2.4 病害發(fā)生規(guī)律

由圖8～10可見海南可可黑果病的發(fā)生規(guī)律。SPSS相關(guān)性分析結(jié)果表明，2011年該病發(fā)生率與降雨量、相對(duì)濕度及氣溫的相關(guān)系數(shù)（r）分別為0.76、0.74和0.32（p=0.01），2012年相關(guān)系數(shù)（r）分別為0.77、0.43、0.21，2013年相關(guān)系數(shù)（r）分別為0.95、0.61和0.19。可見，發(fā)病率與降雨量之間具有很強(qiáng)的相關(guān)性（r=0.76～0.95），降雨量越多，發(fā)病率越高；發(fā)病率與相對(duì)濕度之間的相關(guān)性中等（r=0.43～0.74）；發(fā)病率與氣溫之間呈弱相關(guān)（r=0.19～0.32）。

降雨量是影響可可黑果病發(fā)生和流行的最主要因素。在海南，此病菌在旱季進(jìn)入休眠狀態(tài)，病菌在表層土壤、殘留在樹上的病果或其他寄主植物中存活，2～3月份連續(xù)一段陰雨天后，從這些處所產(chǎn)生孢子囊，孢子囊主要借雨水濺散傳播，為流行提供初侵染菌源，可可植株開始出現(xiàn)零星病果，發(fā)病率一般在5%左右；直到5月份出現(xiàn)雨水較多之前發(fā)病率一般不超過15%；6～8月份氣溫高雨水較少，出現(xiàn)短暫干旱，病害停止發(fā)展，發(fā)病率降低；到9～11月份臺(tái)風(fēng)雨季，連續(xù)強(qiáng)降雨后發(fā)病率急劇上升，嚴(yán)重時(shí)發(fā)病率達(dá)40%以上；12月至翌年1月出現(xiàn)低溫少雨干旱天氣病害流行結(jié)束。2012年10月底至11月中旬，可可樹同時(shí)出現(xiàn)開花、結(jié)小果、成熟果的物候期，且興隆地區(qū)連續(xù)出現(xiàn)降雨天氣，氣溫均在20～30 ℃之間，所以這段時(shí)間可可疫病相對(duì)嚴(yán)重，發(fā)病率40%左右?？傊?，在持續(xù)高濕的地區(qū)黑果病特別嚴(yán)重，小果期連續(xù)降雨且出現(xiàn)20～27 ℃的氣溫是該病發(fā)生的主要條件。

3 討論與結(jié)論

可可黑果病可由多種病原菌引起，Blaha G[4]利用同工酶技術(shù)和RFLP方法鑒定發(fā)現(xiàn)Phytophthora palmivora（sensu stricto）、P. megakarya、P. capsici和P. citrophthora等均可引起可可黑果病。徐同等[9]從喀麥隆主要可可產(chǎn)區(qū)自然發(fā)病的黑果病病果中分離到12個(gè)疫霉菌株，并對(duì)這些疫霉菌株的形態(tài)學(xué)、生理特征及致病性進(jìn)行了鑒定，結(jié)果這12個(gè)疫霉菌株均為P. megakarya。本研究采用形態(tài)特征鑒定及rDNA-ITS序列分析相結(jié)合的方法，將海南可可黑果病病原鑒定為柑橘褐腐疫霉（Phytophthora citrophthora）。由于本研究調(diào)查范圍和取樣數(shù)量有限，是否也有其他幾種國外報(bào)道的疫霉菌引起該病還有待進(jìn)一步研究。

Deberdt P等[10]研究指出由P. megakarya引起的可可黑果病的發(fā)病率與降雨量之間呈顯著正相關(guān)，但未明確氣溫和濕度與該病發(fā)病率之間的相關(guān)性大小。本文研究結(jié)果表明，在海南，可可黑果病發(fā)病率與降雨量之間具有很強(qiáng)的相關(guān)性（r=0.76～0.95），降雨量越多，發(fā)病率越高；發(fā)病率與相對(duì)濕度之間的相關(guān)性為中等（r=0.43～0.74）；發(fā)病率與氣溫之間呈弱相關(guān)（r=0.19～0.32）。在海南，可可幾乎周年都可開花，但以每年5～11月開花最多（占全年的94%左右），從開花到結(jié)成幼果將近2個(gè)月時(shí)間，因此7～11月正是幼果期集中的時(shí)期，而8～11月恰逢高溫多雨和臺(tái)風(fēng)雨季節(jié)，因此可可黑果病的發(fā)病高峰期與幼果期相對(duì)一致，這也說明該病菌主要侵染幼果。在生產(chǎn)上建議在每年8月中下旬雨季來臨前，全園進(jìn)行可可黑果病預(yù)防，否則嚴(yán)重時(shí)可導(dǎo)致40%以上的可可幼果腐爛脫落，嚴(yán)重影響產(chǎn)量。

本次將菌株kk6a在PDA平板上進(jìn)行單株培養(yǎng)及與Phytophthora palmivora A1、A2標(biāo)準(zhǔn)菌株進(jìn)行配對(duì)培養(yǎng)，都未發(fā)現(xiàn)有性器官產(chǎn)生，可能是本研究所獲得的菌株喪失了育性或育性較弱。ITS是介于18S rDNA、5.8S rDNA和28S rDNA之間的區(qū)域，該區(qū)域進(jìn)化速度較編碼區(qū)快，已有的研究結(jié)果表明，ITS在真菌的種間存在著豐富的變異，而在種內(nèi)不同菌株間卻高度保守，可以為真菌的系統(tǒng)發(fā)育和分類鑒定提供豐富的遺傳信息。本研究采用分子生物學(xué)方法對(duì)海南可可黑果病致病菌kk6a的核糖體DNA-ITS序列進(jìn)行分析，其核糖體DNA-ITS序列與柑橘褐腐疫霉（Phytophthora citrophthora）的同源性為100%，從分子生物學(xué)水平上進(jìn)一步鑒定菌株kk6a為柑橘褐腐疫霉（Phytophthora citrophthora）。

參考文獻(xiàn)

[1] 華南亞熱帶作物科學(xué)研究所華南熱帶作物學(xué)院. 熱帶作物栽培學(xué)[M]. 北京： 農(nóng)業(yè)出版社， 1962.

[2] 朱自慧. 世界可可業(yè)概況與發(fā)展海南可可業(yè)的建議[J]. 熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)， 2003， 23（3）： 28-33.

[3] Deberdt P， Mfegue C V， Tondje P R， et al. Impact of environmental factors， chemical fungicide and biological control on cacao pod production dynamics and black pod disease（Phytophthora megakarya）in Cameroon[J]. Biological Control： Theory and Application in Pest Management， 2008， 44（2）：149-159.

[4] Blaha G. Use of isoenzyme patterns and RFLP to identify the Phytophthora spp. on cacao[J]. Bulletin OEPP， 1990， 20（1）：59-65.

[5] 方中達(dá). 植病研究方法[M]. 北京： 中國農(nóng)業(yè)出版社， 1998.

[6] 鄭小波. 疫霉菌及其研究技術(shù)[M]. 北京：中國農(nóng)業(yè)出版社， 1997.

[7] 王源超， 張正光， 鄭小波. 核糖體基因ITS作為苧麻疫霉、 惡疫霉分類輔助性狀的研究[J]. 菌物系統(tǒng)， 2000， 19（4）： 485-491.

[8] 劉愛勤， 曾 濤， 曾會(huì)才， 等. 海南香草蘭疫病發(fā)生情況調(diào)查及疫霉菌種類鑒定[J]. 熱帶作物學(xué)報(bào)， 2008（6）： 803-807.

[9] 徐 同， Fouda Bikoe J C， Omokolo D N， et al. 喀麥隆可可黑果病病原疫霉種的鑒定[J]. 菌物系統(tǒng)， 1998， 17（2）： 190-192.

責(zé)任編輯：沈德發(fā)