李玲等

摘 要 以文心蘭試管苗為材料，采用RT-PCR結(jié)合RACE法，克隆文心蘭OnCOBRA基因的cDNA全長和DNA序列。結(jié)果表明：COBRA全長為1 601 bp，開放閱讀框（ORF）為1 386 bp，共編碼461個氨基酸；OnCOBRA的DNA序列共2 949 bp，且含有6個外顯子和5個內(nèi)含子。生物信息學(xué)結(jié)果表明，OnCOBRA屬于不穩(wěn)定的疏水蛋白，具有信號肽、跨膜結(jié)構(gòu)和CCVS保守區(qū)域，亞細胞定位于細胞膜中；與無油樟、玉米、秈稻、擬南芥等具有較高的同源性。系統(tǒng)進化樹分析結(jié)果表明，文心蘭OnCOBRA蛋白與玉米（ZmCOBRA）、無油樟（AtCOBRA）、秈稻（OsCOBRA）處于統(tǒng)一分枝，推測OnCOBRA基因是COBRA基因家族的成員。qPCR結(jié)果表明，OnCORBA為組成型表達，在成苗期表達量最高，在文心蘭類原球莖時期表達量最低。

關(guān)鍵詞 文心蘭；COBRA；克隆；生物信息學(xué)；qPCR

中圖分類號 S682.31 文獻標識碼 A

Molecular Cloning and Expression Pattern

of OnCOBRA Gene in Oncidium

LI Ling， LAI Zhongxiong*， CHEN Yukun， LIAN Conglong， LIN Heyan

Institute of Horticultural Biotechnology， Fujian Agriculture and Forestry University， Fuzhou， Fujian 350002 China

Abstract The RT-PCR combined with RACE method was used to clone the complete cDNA sequences and DNA sequences of OnCOBRA from Oncidium vitro plant. The complete cDNA sequence of OnCOBRA was 1 601 bp， encoding 461 amino acids， the DNA sequence of OnCOBRA was 2 949 bp which had 6 exons and 5 introns. The sequences of nucleotides of OnCOBRA and amino acids of OnCOBRA was high homologous with those of the known COBRA genes in other species. OnCOBRA located in plasma membrane， which had a signal peptide， transmembrane structure and CCVS protein domain. Phylogenetic tree of COBRA in plants indicated that OnCOBRA， ZmCOBRA， AtCOBRA， and OsCOBRA belonged to the same branch， and It putatively belonged to COBRA family. qPCR results indicated that OnCOBRA was constitutive expression and showed approximately a inverted“V”curve， it expressed at the highest levels in the seedings and the lowest levels in the PLB.

Key words Oncidium；COBRA；Clone；Bioinformatics；qPCR

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2014.08.018

文心蘭屬蘭科文心蘭屬植物，植株輕巧、花莖輕盈下垂、花朵奇異可愛且色彩鮮艷，故又名跳舞蘭、金碟蘭、舞女蘭等，是世界上重要的盆花和切花種類之一。

COBR基因首先是在分析擬南芥的根發(fā)育過程中發(fā)現(xiàn)，存在于細胞異常膨脹的突變體中[1]。COBRA基因編碼一種糖磷脂酰肌醇（Glycosyl-phosphatidyl inositol-anchored protein，GPI）錨定蛋白，控制細胞壁纖維素微纖絲的正確定位和細胞的定向伸長[1-3]，同時伴隨著纖維素含量的減少和纖維素不同方向的排列[4]。糖基磷脂酰肌醇錨定蛋白由蛋白質(zhì)、脂質(zhì)和糖鏈三者共價結(jié)合的復(fù)雜的糖復(fù)合物，是一類細胞表面蛋白[5]。在動物細胞中這種脂質(zhì)鏈接用來定位極性蛋白，且研究較為廣[6]。在植物細胞中，最近十幾年才開始研究，它作用于植物細胞膜外表面，通過糖基磷脂酰肌醇（GPI）連接，能感知細胞壁相關(guān)信息并傳導(dǎo)到細胞膜上。植物的生長發(fā)育與細胞壁有著密切的關(guān)系，如植物的形態(tài)建成、器官組織的機械強度及果實成熟軟化等[7]。最新研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，COBRA家族的某些基因與花粉管的伸長方向也有一定關(guān)系[8]。而COBRA的突變體則缺失相關(guān)功能，如擬南芥COB-5的突變體與COB-5野生型相比細胞伸長率下降[9]；水稻的bc-1突變體使得細胞壁的纖維素減少而木質(zhì)素增加，從而控制單子葉植物組織的機械強度[10]；玉米的bk2-ref的突變體造成細胞次生壁不均勻增厚，而使玉米莖桿的機械強度降低[11]。由于COBRA基因具有高度的保守性，通過比較不同物種COBRA基因核苷酸或氨基酸序列的異同，可對物種進行分類和建立各物種之間的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系。迄今為止，從許多高等植物如擬南芥[1， 8]、番茄[7]、陸地棉[12]、水稻[4]、玉米[11]等克隆到了COBRA基因，但有關(guān)蘭科植物的COBRA基因的功能研究尚未見報道。本研究利用文心蘭試管苗分離克隆了OnCOBRA基因的cDNA全長和DNA序列，并通過qPCR法研究其在文心蘭生長發(fā)育過程中的表達規(guī)律，探索OnCOBRA基因在文心蘭試管苗生根過程中的分子機制，對有效提高文心蘭移栽的成活率具有重要的經(jīng)濟意義。相關(guān)研究已報道了COBRA基因與果實成熟有密切關(guān)系，本研究將繼續(xù)探討與鮮花衰敗是否有一定聯(lián)系。

1 材料與方法

1.1 材料

“小櫻桃”文心蘭（Oncidium kutoo）由福建農(nóng)林大學(xué)園藝植物生物工程研究所提供，以原球莖誘導(dǎo)的第一代試管苗為實驗材料。

1.2 方法

1.2.1 文心蘭試管苗總RNA的提取及基因組DNA的提取 參照TRIpure Reagent試劑盒說明書提取文心蘭試管苗全株的總RNA，以CTAB法提取文心蘭試管苗基因組DNA。

1.2.2 相關(guān)cDNA的獲得 采用Fermentas公司的RevertAidTM First-Strand cDNA Synthesis Kit的試劑盒合成第一鏈，編號為cDNA-A，用于保守區(qū)、ORF和3′末端的擴增；參照Clontech的SMARTerTM RACE cDNA Amplification Kit試劑盒說明合成5′race cDNA，編號為cDNA-B，用于5′末端的擴增。

1.2.3 文心蘭試管苗OnCOBRA相關(guān)引物設(shè)計與PCR擴增

（1）OnCOBRA相關(guān)基因保守區(qū)引物設(shè)計及PCR擴增：利用DNAMAN分析GenBank數(shù)據(jù)庫中相關(guān)物種的基因，因目前蘭科植物尚未克隆此基因，因此設(shè)計兼并引物，以反轉(zhuǎn)錄的第一條cDNA為模版進行PCR擴增。

（2）OnCOBRA相關(guān)基因3′-RACE引物設(shè)計及PCR擴增：根據(jù)已克隆得到的OnCOBRA基因的保守區(qū)的核甘酸序列，設(shè)計3′-RACE特異引物，用于擴增OnCOBRA cDNA的3′末端。以反轉(zhuǎn)錄的第一鏈cDNA為模板，以3′COB-1為上游引物，GeneRacerTM 3′Primer（3P）為下游引物，進行巢式第1輪PCR擴增；以第1輪PCR反應(yīng)的產(chǎn)物為模板（進行適當稀釋），以3′COB-2為上游引物，GeneRacerTM 3′Nested Primer（3NP）為下游引物，進行巢式第2輪PCR擴增。

（3）OnCOBRA相關(guān)基因5′-RACE引物設(shè)計及PCR擴增：根據(jù)已克隆得到的OnCOBRA基因的保守區(qū)的核甘酸序列，設(shè)計5′-RACE特異引物，用于擴OnCOBRA cDNA的5′末端。以反轉(zhuǎn)錄的5′cDNA為模板，以UPM為上游引物，5′COB-1為下游引物進行第1輪PCR擴增；以第1輪PCR反應(yīng)的產(chǎn)物為模板（進行適當稀釋），以UPM為上游引物，5′COB-2為下游引物進行第2輪PCR擴增。

（4）OnCOBRA相關(guān)基因ORF的驗證：分別在OnCOBRA的5端和3端設(shè)計1對特異引物，以3′-RACE cDNA為模版進行PCR擴增。上述引物均由北京六合華大基因科技股份有限公司合成。具體設(shè)計的引物和通用引物序列及文心蘭OnCOBRA基因PCR擴增反應(yīng)和反應(yīng)程序見表1。

（5）目的片段的回收、克隆和測序：1%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR擴增，并參照BIOMIGA公司的Gel/PCR Extraction Kit試劑盒方法回收特異目的產(chǎn)物。4 μL的目的片段與1 μL的PeasyTM-T5進行連接后轉(zhuǎn)化至DH5α感受態(tài)細胞，挑單克隆進行菌液培養(yǎng)，PCR鑒定后送華大公司測序。

1.2.4 文心蘭OnCOBRA的生物信息學(xué)分析 采用NCBI（National Center for Biotechnology Information）和DNAMAN 6.0軟件對OnCOBRA基因及其編碼氨基酸序列進行同源比對分析，并通過以下在線工具對OnCOBRA蛋白質(zhì)進行其他生物信息預(yù)測。主要軟件有：ExPASy Protparam（蛋白質(zhì)基本理化性質(zhì)）、SignalP 4.0 Server（蛋白質(zhì)信號肽）、PSORT（亞細胞定位）、EMBnet Tmpred（蛋白質(zhì)跨膜）、NetPhos 2.0（蛋白磷酸化位點）、InterProScan（蛋白質(zhì)保守結(jié)構(gòu)域）、MEGA5.02（氨基酸序列的分子系統(tǒng)進化樹構(gòu)建）。

1.2.5 OnCOBRA基因熒光定量表達分析 本研究以18S rRNA為內(nèi)參基因，利用SYBR Green Ⅱ熒光染料發(fā)的實時熒光定量PCR檢測OnCOBRA基因在不同階段材料的相對表達量。利用TRIpure Reagent試劑盒提取文心蘭4個階段的總RNA，再將RNA反轉(zhuǎn)錄合成cDNA-C，進一步進行qPCR分析。內(nèi)參基因的上下游引物分別為18S rRNA-F和18S rRNA-R[13]，OnCOBRA基因熒光定量PCR的上下游引物分別為QCOB-F和QCOB-R。PCR擴增反應(yīng)體系為20 μL，其中2×SYBR 10 μL，cDNA模板1 μL，上下游引物各0.8 μL，ddH2O 7.4 μL，反應(yīng)于羅氏LightCycler 480儀器中進行。反應(yīng)程序為：95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性10 s，61 ℃退火10 s，72 ℃延伸10 s，40個循環(huán)；50 ℃冷卻30 s。反應(yīng)結(jié)束后進行擴增曲線和溶解曲線等分析，檢測引物的特異性，各不同發(fā)育階段的cDNA模板混合樣以不同梯度稀釋（5×、25×、125×、625×），制作標準曲線，獲得擴增效率等相關(guān)參數(shù)，以上qPCR反應(yīng)均重復(fù)3次。

2 結(jié)果與分析

2.1 文心蘭OnCOBRA基因全長序列的克隆

以文心蘭試管苗的cDNA第一鏈為模板，利用設(shè)計的保守區(qū)引物進行PCR反應(yīng)擴增，結(jié)果獲得了397 bp的目的條帶，與預(yù)期結(jié)果相符。在NCBI數(shù)據(jù)庫上比對，結(jié)果發(fā)現(xiàn)為目的條帶，利用OnCOBRA保守區(qū)分別設(shè)計3′端和5′端引物，分別經(jīng)過2輪巢式PCR反應(yīng)，且測序結(jié)果表明，3′端第2輪得到1 169 bp的目的條帶，5′端第2輪得到604 bp的目的條帶，利用DNAMAN將上述3個基因片段進行拼接，得到文心蘭基因的全長為1 601 bp，并設(shè)計OnCOBRA基因的ORF驗證引物，經(jīng)PCR反應(yīng)得到一條長度為1 449 bp的序列。經(jīng)過DNAMAN分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)OnCOBRA基因的ORF長度為1 386 bp，5′UTR長度為55 bp，3′UTR的長度為139 bp，終止密碼子為TAG，ploy（A）尾巴為21 bp，無典型的polyA加尾信號（圖1）。

將此轉(zhuǎn)錄本的核苷酸序列在NCBI的GenBank數(shù)據(jù)庫中進行在線Blast，文心蘭OnCOBRA基因與葡萄（Vitis vinifer）、玉米（Zea mays）、擬南芥（Arabidopsis thaliana）的相似性分別為77%、75%、74%，結(jié)果說明所得片段為文心蘭的OnCOBRA基因（GenBank檢索號為：KF739400.1）。

利用OnCOBRA基因的ORF引物，以文心蘭的基因組DNA為模版進行PCR反應(yīng)，得到1條2 949 bp左右的條帶，經(jīng)測序，并利用DNAMAN分析，發(fā)現(xiàn)OnCOBRA基因組DNA含有6個外顯子和5個內(nèi)含子，6個外顯子的長度分別為114、81、457、160、281、293 bp（圖2），GenBank檢索號為：KF861576。

2.2 文心蘭OnCOBRA基因編碼蛋白質(zhì)基本理化性質(zhì)及結(jié)構(gòu)特征分析

文心蘭OnCOBRA基因編碼了461個氨基酸，采用ExPASy Protparam工具對文心蘭OnCOBRA 蛋白的序列進行理化性質(zhì)分析，結(jié)果表明，OnCOBRA 蛋白的分子量為51.688 4 ku，理論等電點為8.63，原子組成為C2339H3543N607O656S32，總原子量為7 177，不穩(wěn)定系數(shù)是33.11，脂肪系數(shù)為75.68，總平均親水性為-0.075。說明該蛋白屬疏水的、穩(wěn)定的堿性蛋白質(zhì)。

利用SignalP 4.0 Server和PSORT軟件對OnCOBRA蛋白進行信號肽和亞細胞定位情況預(yù)測，結(jié)果顯示，OnCOBRA 蛋白含錨定信號，不屬于分泌蛋白（圖3）；亞細胞定位于質(zhì)膜的可能性最大，在上述分析的基礎(chǔ)之上，使用EMBnet開發(fā)的程序Tmpred預(yù)測OnCOBRA的跨膜區(qū)，結(jié)果顯示，該蛋白含有2個跨膜螺旋，一個是由內(nèi)到外的跨膜結(jié)構(gòu)，位于第16～35個殘基之間，長度為20個氨基酸，分值為1 830；另一個是由外到內(nèi)的跨膜結(jié)構(gòu)，位于443～461個殘基之間，長度為19個氨基酸，分值為2 266；推測文心蘭OnCOBRA蛋白主要存在于質(zhì)膜上，可能與蛋白質(zhì)的錨定有關(guān)。

2.3 文心蘭OnCOBRA蛋白保守結(jié)構(gòu)域預(yù)測與分析

采用InterProScan對小櫻桃文心蘭的OnCOBRA蛋白進行蛋白質(zhì)保守結(jié)構(gòu)域分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)小櫻桃文心蘭COBRA蛋白含有2個保守結(jié)構(gòu)域：1個登錄號為IPR006918的COBRA，plant保守結(jié)構(gòu)域，一個InterPro未登錄的（unintegrated）保守結(jié)構(gòu)域（圖4）。

2.4 文心蘭OnCOBRA氨基酸序列翻譯后的磷酸化修飾預(yù)測

蛋白質(zhì)磷酸化修飾是一種蛋白翻譯后供價修飾方式，蛋白質(zhì)的磷酸化和去磷酸化在基因轉(zhuǎn)錄、植物的發(fā)育和代謝調(diào)控中起著重要作用，可調(diào)控轉(zhuǎn)錄因子的轉(zhuǎn)錄激活或改變蛋白質(zhì)的功能及其結(jié)合DNA的能力[14-15]。采用NetPhos 2.0軟件結(jié)合PredictProtein工具對磷酸化和其他功能位點修飾進行預(yù)測，NetPhoS 2.0預(yù)測顯示文心蘭OnCOBRA基因編碼蛋白存在23個潛在的磷酸化位點，它們勻分布于整條多肽鏈中（圖5）。發(fā)生磷酸化位點數(shù)最多的是絲氨酸（Ser），其次為蘇氨酸（Thr），最少的為酪氨酸（Tyr），它們的活性位點數(shù)分別為9、10和4個。上述分析結(jié)果表明，OnCOBRA蛋白存在豐富的磷酸化位點，說明磷酸化位點修飾對OnCOBRA蛋白的功能可能是必須的，也可能這些磷酸化參與OnCOBRA蛋白活性的調(diào)控。

2.5 文心蘭OnCOBRA基因編碼的蛋白質(zhì)進化分析

采用MEGA 5.02軟件對文心蘭OnCOBRA及其他同源性序列進行系統(tǒng)進化樹分析，不同植物COBRA系統(tǒng)進化樹分析結(jié)果見圖6。結(jié)果表明，文心蘭OnCOBRA與單子葉植物玉米、秈稻的COBRA親緣關(guān)系相對較近，與無油樟親緣關(guān)系最近，與其他雙子葉植物和低等植物親緣關(guān)系較遠。 2.6 文心蘭OnCOBRA結(jié)構(gòu)分析

通過DNAMAN 6.0及相關(guān)在線軟件分析，結(jié)果表明文心蘭OnCOBRA符合了植物COBRA-like蛋白的一些特征：（1）N-末端有一段疏水區(qū)域，它主要起信號肽的作用；（2）靠近N-末端有一個纖維素結(jié)合位點；（3）蛋白質(zhì)中間部位均有一個CCVS區(qū)域；（4）在C末端含有GPI連接區(qū)，包括w位點（圖7）。

2.7 文心蘭OnCOBRA基因熒光定量的表達分析

qPCR結(jié)果經(jīng)擴增曲線和溶解曲線分析，結(jié)果表明18SrRNA引物和OnCOBRA引物特異性好，標準曲線的線性范圍較廣，在檢測的線性范圍內(nèi)，標準曲線符合試驗要求。依次采用熒光定量PCR檢測OnCOBRA基因在文心蘭各生長階段下的轉(zhuǎn)錄水平，以18S rRNA為內(nèi)參基因，OnCOBRA基因的相對表達量見圖8。以文心蘭原球莖階段的表達量為對照，發(fā)現(xiàn)文心蘭在成苗期表達量更高，可能是因為OnCOBRA作為一種胞外GPI錨定蛋白，影響植物細胞壁中纖維素含量及細胞的定向伸長，成苗期文心蘭處于生根階段，所以O(shè)nCOBRA基因的表達量最高。

3 討論與結(jié)論

3.1 文心蘭OnCOBRA基因功能的預(yù)測

GPI錨定蛋白是一類通過其羧基末端的GPI結(jié)構(gòu)錨定于真核細胞膜表面的蛋白[16]，COBRA-like則是GPI錨定蛋白的一種，經(jīng)目前已發(fā)表的文獻表明COBRA是一個超基因家族，擬南芥已獲得12個COBRA基因，且對擬南芥AtCOBRA蛋白研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，擬南芥AtCOBRA蛋白具有以下幾個結(jié)構(gòu)特征：（1）N-末端有一段疏水區(qū)域，它主要起信號肽的作用，主要功能是將蛋白質(zhì)定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上進行加工。（2）靠近N-末端有一個纖維素結(jié)合位點，芳香族氨基酸殘含量較高。cob-3突變體就是因為一個Trp（W55）殘基的突變造成了擬南芥根細胞的膨脹方向缺陷[3]。（3）蛋白質(zhì)中間部位均有一個CCVS區(qū)域，其中有一個CCVS序列，富含Cys，參與二硫鍵的形成，使蛋白形成正確的二級結(jié)構(gòu)，有植物螯合肽的功能，能螯臺金屬離子，對于蛋白發(fā)揮正常的功能有重要作用。CCVS區(qū)還含有一個保守的N-糖基化位點，N-糖基化通常是與GPl錨定蛋白合胞外蛋白的轉(zhuǎn)錄后修飾有關(guān)。（4）在C末端含有GPI連接區(qū)，包括w位點，w+2位點后緊接的一個由5～6個氨基酸組成的富含帶電氨基酸或脯氨酸的間隔區(qū)，最后有一個疏水性的尾巴。當?shù)鞍自趦?nèi)質(zhì)網(wǎng)上加工時C-末端的疏水肽段被切除，產(chǎn)生w位點，組裝好的GPI通過肽鍵連接到w位點上，在GPI的介導(dǎo)下，蛋白被錨定到細胞質(zhì)膜的外層[17]。經(jīng)過相關(guān)生物學(xué)信息學(xué)軟件在線分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)研究克隆到的文心蘭OnCOBRA基因和其他植物的COBRA是同源基因，表明文心蘭OnCOBRA符合上述GPI 錨定蛋白的全部特征。

3.2 文心蘭OnCOBRA基因在不同發(fā)育階段的表達分析

COBRA基因參與細胞壁的形態(tài)建成及纖維素的定向伸長[10]，纖維素微纖絲相互交織而成的多糖網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)是細胞壁的主體結(jié)構(gòu)[18]，對植物器官的形態(tài)發(fā)生起重要作用，與植物的壽命、體積、高度、細胞壁的機械強度有關(guān)[17]，植物很多基因的表達受到激素和物理、化學(xué)等因子的影響，表達量因不同組織、時空和環(huán)境而不同。在本研究中，利用熒光定量PCR檢測OnCOBRA基因的相對表達量，分析文心蘭4個階段的表達量，結(jié)果發(fā)現(xiàn)原球莖時期表達量最低，在成苗期表達量最高，可能是因為原球莖的機械強度較弱，細胞壁的纖維素含量較低，所以O(shè)nCOBRA表達量較低。在本實驗中，發(fā)現(xiàn)蘭科植物原球莖比較松散，且容易分離和切割，符合實驗結(jié)果。而在成苗期OnCOBRA表達量最高，COBRA最初也是在分析擬南芥根發(fā)育過程中細胞異常膨脹的突變體中發(fā)現(xiàn)的[12]，而且COBRA對植物根的定向伸長起關(guān)鍵作用[1]，此時的文心蘭屬于生根階段或根的繼續(xù)伸長，因此OnCOBRA的表達量在成苗期最高是合理的。

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責(zé)任編輯：黃東杰