鄭乾坤等

摘 要 ADP葡萄糖焦磷酸化酶（AGPase）是淀粉合成起始的關鍵酶，利用保守序列設計簡并引物，得到一條橡膠樹AGPase大亞基的類似序列，再以木質(zhì)部cDNA為模板通過RACE（Rapid amplification of cDNA ends）技術克隆得到AGPase基因的cDNA全長，命名為HbLSUI（GenBank NO：KJ020930）。生物信息學分析結果表明，AGPase基因所編碼的蛋白具有AGPase大亞基保守結構域。RT-PCR表達分析結果表明，AGPase基因在木質(zhì)部和樹皮中的表達量較高。利用熒光定量PCR分析AGPase基因在不割膠、常規(guī)割膠和乙烯刺激割膠3種割膠強度下的表達情況，結果表明，割膠和刺激割膠可導致該基因的表達量降低。

關鍵詞 橡膠樹；AGPase；淀粉；定量PCR

中圖分類號 S794.1 文獻標識碼 A

Cloning of One Full-length AGPase Large

Subunit cDNA Sequence and Expression Analysis

ZHENG Qiankun1， WEI Fang2， LUO Shiqiao2，

WU Ming2， QIU Jian2， YANG Wenfeng2， XIAO Xianzhou1，2*

1 College of Agronomy， Hainan University， Haikou， Hainan 570228， China

2 Rubber Research Institute， Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences/Key Laboratory of

Biology and Genetic Resources of Rubber Tree， Ministry of Agriculture， Danzhou， Hainan 571737， China

Abstract ADP glucose pyrophosphorylase（AGPase）is a key enzyme to the process of starch synthesis. In this research， one cDNA sequence of AGPase large subunit was isolated from rubber tree xylem by RACE（rapid amplification of cDNA ends）technique， named HbLSUI（Genebank NO：KJ020930）. Bioinformatic analysis showed that HbLSUI had the conserved domains of AGPase large subunit. Semi-quantitative PCR indicated the transcripts of HbLSUI was abundant in xylem and bark. Quantitative PCR indicated： tapping and ethylene stimulate tapping reduced the transcript levels of HbLSUI significantly.

Key words Hevea brasiliensis；AGPase；Starch；Quantitative PCR

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2014.08.013

淀粉是高等植物中主要的貯藏碳水化合物，是植物中最豐富和最重要的儲備多糖，是能量來源最重要的物質(zhì)之一。巴西橡膠樹是一種產(chǎn)膠植物，橡膠合成的前體分子是蔗糖，而蔗糖可由淀粉降解而來，因此，淀粉與橡膠合成之間存在一定的相關性。但由于淀粉并不是合成橡膠的直接原材料，關于橡膠樹中淀粉代謝方面的研究較少。近年來發(fā)展起來的刺激割膠大幅度地提高了橡膠的產(chǎn)量，但由于割膠強度較大，不可避免的需要動員儲藏碳庫來供應原料供應，這個過程中淀粉的作用不可忽略。

植物在進行光合作用時，除了產(chǎn)生滿足當前需要的碳水化合物外，剩余的碳水化合物被植物儲藏用于代謝系統(tǒng)的維護和再生[1]。作為光合作用最重要的終產(chǎn)物，淀粉被運輸?shù)剿璧母鱾€組織和器官，但大多數(shù)是作為儲存性的物質(zhì)儲存以備動用，特別是在光合作用不足以滿足生長和發(fā)育需求的時候，植物就會動用它自身儲存的非結構性多糖[2]。在一些特定的情況下，如植株遭受傷害或者闊葉植物早春生長時，橡膠樹由于割膠和強度割膠時，此時光合作用的即時供應滿足不了植株需求，儲藏物質(zhì)被動員起來用于支持植物度過高能量消耗期[3]。

淀粉在動員之前需要先完成淀粉的積累過程，淀粉的合成是個復雜的過程，而ADP葡萄糖焦磷酸化酶（ADP-glucose pyrophosphorylase，AGPase）是淀粉合成起始的關鍵酶，淀粉合成關鍵步驟是ADP-葡萄糖在AGPase催化下的合成[4]。ADP-葡萄糖在植物的光合組織和非光合組織中都具有重要的作用[5]。ADP-葡萄糖是葡萄糖基的供體，也是合成淀粉的底物。在真核生物中，AGPase是由2個不同的亞基組成的四聚體，包括2個大亞基和2個小亞基蛋白。在許多作物中，如菠菜、馬鈴薯、甘薯、西紅柿、小麥、鷹嘴豆、水稻、玉米、柑橘的AGPase的亞基基因均已被克隆，并且有很多已經(jīng)做了表達分析[6-16]。AGPase的基因功能與淀粉合成也有一定的關聯(lián)，姚慶榮等[17]將該基因轉化得到了轉基因的煙草，并獲得了淀粉含量較高的轉基因煙草。Smidansky等[18]將玉米的AGPase基因轉入小麥中，結果獲得了籽粒和生物量都增加的轉基因小麥。

目前，有關橡膠樹AGPase基因在分子生物學方面的研究還處于空白。本研究從巴西橡膠樹中克隆得到一條AGPase大亞基基因的cDNA序列，命名為HbLSUI，并對該基因的表達特征進行分析。

1 材料與方法

1.1 材料

基因全長克隆以開割后PR107品種的橡膠樹木質(zhì)部作為材料，組織特異性分析采用橡膠樹的不同組織（分別是橡膠樹的木質(zhì)部、樹皮、葉片、膠乳和根）作為實驗材料提取RNA。

不同割膠強度下的材料取樣方法：在試驗場七隊選取開割后的橡膠樹，品種為PR107，于1982年定植，1990年開割。選取3組橡膠樹分別作為對照、常規(guī)割膠和刺激割膠，每組3個重復，對選取的橡膠樹不割膠處理3個月，9月開始取樣，取割線下方2～3 cm處的樹皮和木質(zhì)部樣品作為實驗材料提取RNA。經(jīng)過2個月的常規(guī)割膠（1/2 s，3 d）和乙烯刺激割膠（1/2 s，3 d+ET），11月再次取割線下方2～3 cm處的樹皮和木質(zhì)部樣品作為實驗材料提取RNA。

1.2 方法

1.2.1 RNA的提取與反轉錄 RNA的提取采用百泰克RNA提取試劑盒提取（具體方法參照說明書）。反轉錄是利用Ferments反轉錄試劑盒完成（具體方法參照說明書）。

1.2.2 利用RACE技術克隆大亞基基因 利用AGPase簡并引物（SenseP和AntiP）克隆部分序列，通過RACE技術擴增基因全長，接頭引物為UMP和NUP，正向引物為5′GSP和5′NGSP，反向引物為3′GSP和3′NGSP（表1）。得到的電泳序列經(jīng)過凝膠回收試劑盒（Axygen，KE10101003-G）純化回收后連接到pEASY-T1（Transgen）載體上，并送北京華大基因測序。

1.2.3 生物信息學分析 等電點分子量預測：利用在線（http：//web.expasy.org/compute_pi/）工具預測該基因表達蛋白的等電點；亞細胞定位：利用在線的（http：//www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/）singalP工具對該基因表達的蛋白進行定位預測；功能域預測：利用ncbi（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）工具對該基因的結構域進行了預測和比對。

1.2.4 表達分析 分別提取橡膠樹木質(zhì)部、樹皮、葉片、膠乳和根的RNA，通過RT-PCR得到cDNA模板，以18S rRNA（GenBank登陸號：AB268099）（引物：18S-FP、18S-RP）作為內(nèi)參基因調(diào)節(jié)模板濃度，通過半定量PCR法分析不同組織中該基因的表達情況，半定量的最佳循環(huán)數(shù)為26個循環(huán)。利用熒光定量PCR法分析HbLSUI在不同割膠強度下（對照、常規(guī)、刺激）的表達情況。利用重復不等隨機單因子的分析方法對其差值做差異顯著性分析。

2 結果與分析

2.1 RACE結果及序列分析

克隆得到一條AGPase大亞基基因序列，經(jīng)過測序，其全長為1 696 bp（GenBank登錄號：KJ020930），預測編碼527個氨基酸，5′-UTR有59 bp，3′-UTR有53 bp，理論預測推導氨基酸分子量為58.399 ku，等電點為7.18。通過SignalP分析，該推導序列定位在細胞質(zhì)中，屬于胞質(zhì)型大亞基。該基因序列編碼的蛋白序列與蓖麻、楊樹的序列有較高的同源性，分別為89%和86%（表2）。

HbLSUI推導的氨基酸序列見圖1，與已經(jīng)鑒定功能的玉米（ZmLSU，GenBank NO：S48563）保守結構域[13]的比較分析，結果表明該推導序列包含AGPase大亞基的5個功能區(qū)序列，橫線部分依次是：191～199：ATP結合區(qū)（ATP-binding motif）；222～231：催化區(qū)（Catalytic motif）；271～280：GTP結合區(qū)（GTP-binding motif）；376～429：亞基結合區(qū)（Between-subunit interaction motif）；511～527：調(diào)控區(qū)（Regulation motif）。初步證明推導的氨基酸序列具有AGPase大亞基蛋白的功能。

2.2 HbLSUI基因的表達模式分析

雖然HbLSUI基因從木質(zhì)部中克隆得到，但該基因在不同組織中均有表達。由圖2可以看出，HbLSUI基因在不同組織中的表達情況不同，在木質(zhì)部、樹皮中的表達量比在葉片、膠乳中的表達量高。

2.3 割膠對HbLSUI基因表達的影響

為了更深入的了解淀粉在樹皮和木質(zhì)部的合成，分別在割膠和刺激割膠條件下，研究HbLSUI基因的表達分析情況。通過熒光定量PCR，得到HbLSUI在轉錄水平對于不同割膠強度的反應，由于樹皮與木質(zhì)部中淀粉的積累情況區(qū)別較大，因此，本研究對2個部位分別進行了分析。

由圖3可以看出，在木質(zhì)部中，9月實驗前HbLSUI的表達量顯著高于11月實驗后的表達量。經(jīng)過11月常規(guī)割膠和刺激割膠后，HbLSUI的表達量比對照明顯降低。

為了排除物候的影響，本研究選取前后2次取樣的結果，利用重復不等隨機單因子的分析方法對其差值做差異顯著性分析，結果表明，刺激割膠和常規(guī)割膠下，木質(zhì)部中該基因的表達量顯著低于對照（圖3）。在樹皮中，刺激和常規(guī)割膠下，HbLSUI的表達量也顯著降低（圖4），與木質(zhì)部的表達結果吻合。

3 討論與結論

橡膠樹淀粉的消長規(guī)律是重要的割膠理論基礎，包括合成和降解2個過程，淀粉的合成是一種正向的積累碳源的過程，對其進行研究有助于更好地理解消長規(guī)律。AGPase是淀粉合成過程的關鍵酶，該研究通過RACE技術從橡膠樹木質(zhì)部克隆得到一個AGPase大亞基基因的cDNA全長序列（HbLSUI），經(jīng)過比對發(fā)現(xiàn)與其同科的蓖麻同源性較高， 屬于胞質(zhì)型大亞基， 與已報道的玉米、柑橘、毛果楊[12-13]等大亞基基因的結構域相似，具有AGPase大亞基蛋白的5個功能區(qū)。

HbLSUI在木質(zhì)部和樹皮中的表達量較高，而在葉片中的表達量較低，這種表達模式與其他植物不同。大多數(shù)植物AGPase的組織特異性表達表現(xiàn)為葉片表達高，如康國章等[9，19]在對小麥的研究中發(fā)現(xiàn)AGPase大亞基基因在小麥的葉片中表達量最高，莖和根表達量相對較低；類似的研究在木本植物柑橘[12]和鷹嘴豆[4]的研究中也得到證實。推測該基因在橡膠樹中的表達具有特異性，在木質(zhì)部和樹皮中的表達較其他組織活躍。

在樹皮中，淀粉作為即時的緩沖；木質(zhì)部中，淀粉可以看做一種長效儲藏源[19]，淀粉在2個部分的作用不同。HbLSUI表達受物候影響較大，包括對照在內(nèi)，不同強度割膠下，木質(zhì)部中HbLSUI基因在9月和11月的表達量發(fā)生了顯著變化，9月的表達量顯著高于11月的。9月光照充足，光合作用旺盛，橡膠樹處于代謝旺產(chǎn)期，11月氣溫降低，光合作用減弱，淀粉合成減慢；這種狀況同樣出現(xiàn)在樹皮中，可見木質(zhì)部和樹皮中淀粉合成與HbLSUI有關。常規(guī)割膠和刺激割膠對樹皮和木質(zhì)部中HbLSUI轉錄水平都產(chǎn)生了影響，差異顯著性分析結果表明，割膠引起HbLSUI的表達比對照降低，而且割膠強度大的刺激割膠處理降低程度更大，分析原因，推測是割膠傷害對表達產(chǎn)生了影響，組織細胞學研究結果表明，持續(xù)割膠導致割面最近處膠乳再生區(qū)的樹皮軟組織淀粉短缺[20]，Junjittakarn等[21]認為割膠引起的短期效應導致碳源的局部沉默，由于本研究取樣部位是割線附近，也可能是持續(xù)傷害僅對割線處HbLSUI的表達產(chǎn)生負面影響。割膠引起HbLSUI的表達降低，而Silpi等[22-23]在對橡膠樹樹干的研究中認為，割膠引起了樹干淀粉的積累，在割面上部離割面越近積累效果越顯著，鑒于以上研究，割膠對于淀粉的合成存在促進還是抑制作用，有待進一步討論。

參考文獻

[1] Le Roux X， Lacointe A， Escobar-Gutiérrez A， et al. Carbon-based models of individual tree growth.a critical appraisal[J]. Annals of Forest Science， 2001， 58（5）： 469-506.

[2] Chantuma P， Lacointe A， Kasemsap P， et al. Carbohydrate storage in wood and bark of rubber trees submitted to different level of C demand induced by latex tapping[J]. Tree Physiology， 2009， 29（8）： 1 021-1 031.

[3] Barbaroux C， Bréda N， Dufrêne E. Distribution of above-ground and below-ground carbohydrate reserves in adult trees of two contrasting broad-leaved species（Quercus petraea and Fagus sylvatica）[J]. New Phytologist， 2003， 157（3）： 605-615.

[4] Morell M K， Bloom M， Knowles V， et al. Subunit structure of spinach leaf ADPglucose pyrophosphorylase[J]. Plant Physiol，1987， 85（1）： 182-187.

[5] Singh S， Choi SB， Modi M K， et al. Isolation and characterization of cDNA clones encoding ADP-glucose pyrophosphorylase（AGPase） large and small subunits from chickpea（Cicer arietinum L.）[J]. Phytochemistry， 2002， 59（3）：261-268.

[6] Okita T W， Nakata P A， Anderson J M， et al. The subunit structure of potato tuber ADPglucose pyrophosphorylase[J]. Plant Physiol， 1990， 93（2）： 785-790.

[7] Bae J M， Liu J R. Molecular cloning and characterization of two novel isoforms of the small subunit of ADPglucose pyrophosphorylase from sweet potato[J]. Molecular & General Genetics， 1997， 254（2）： 179-185.

[8] Park S W， Chung W I. Molecular cloning and organ-specific expression of three isoforms of tomato ADP-glucose pyrophosphorylase gene[J]. Gene， 1998， 206（2）： 215-221.

[9] 康國章， 劉 超， 沈丙權. 小麥AGPase 4個亞基的克隆及其組織特異性表達[J]. 西北農(nóng)業(yè)學報， 2009， 18（1）： 60-64.

[10] Olive M R， Ellis R J， Schuch W W. Isolation and nucleotide sequences of cDNA clones encoding ADP-glucose pyrophosphory

lase polypeptides from wheatleaf and endosperm[J]. Plant Molecular Biology， 1989， 12（5）： 525-538.

[11] Singh S， Choi S B， Modi M K， et al. Isolation and characterization of cDNA clones encoding ADP-glucose pyrophosphorylase（AGPase）large and small subunits from chickpea[J]. Phytochemis-try， 2002， 59（3）： 261-268.

[12] Kim I J， Noh S J， Lee B H， et al. Molecular characterization of cDNA clones for ADP-glucose pyrophosphorylase from Citrus[J]. Biochimica et Biophysica Acta（BBA）-Gene Structure and Expression， 2001， 1 518（3）： 324-328.

[13] Prioul J L， Jeannette E， Reyss A， et al. Expression of ADP-glucose pyrophosphorylase in maize（Zea mays L.）grain and source leaf during grain filling[J]. Plant Physiology， 1994， 104（1）： 179-187.

[14] Corbi J， Dutheil J Y， Damerval C， et al. Accelerated evolution and coevolution drove the evolutionary history of AGPase sub-units during angiosperm radiation[J]. Annals of Botany， 2012， 109（4）： 693-708.

[15] Kang G， Liu G， Peng X， et al. Increasing the starch content and grain weight of common wheat by overexpression of the cytosolic AGPase large subunit gene[J]. Plant Physiology and Biochemistry， 2013， 73C： 93-98.

[16] Petreikov M， Eisenstein M， Yeselson Y， et al. Characterization of the AGPase large subunit isoforms from tomato indicates that the recombinant L3 subunit is active as a monomer[J]. The Biochemical Journal， 2010， 428（2）： 201-212.

[17] 姚慶榮， 郭運玲， 孔 華. AGPase基因植物表達載體的構建及對煙草的轉化[J]. 西北植物學報， 2007， 27（5）： 859-863.

[18] Smidansky E D， Clancy M， Meyer F D， et al. Enhanced ADP-glucose pyrophosphorylase activit y in wheat endosperm increases seed yield[J]. Proceedings of National Academic Science of USA， 2002， 99（9）： 1 724-1 729.

[19] 康國章， 王永華， 劉 超，等. 小麥AGPase胞質(zhì)型大亞基基因的克隆與表達分析[J]. 作物學報， 2008， 34（7）： 1 290-1 293.

[20] Gohet E. The production of latex by Hevea brasiliensis. Relation with growth. Influence of different factors：clonal origin， hormonal stimulation，carbohydrate reserves[D]. France：Université de Montpellier II. Montpellier， 1996.

[21] Junjittakarn J， Limpinuntana V， Pannengpetch K， et al. Short term effects of latex tapping on micro-changes of trunk girth in Hevea brasiliensis[J]. AJCS， 2012， 6（1）： 65-72.

[22] Silpi U， Thaler P， Kasemsap P， et al. Effect of tapping activity on the dynamics of radial growth of Hevea brasiliensis trees[J]. Tree Physiology， 2006， 26（12）： 1 579-1 587.

[23] Silpi U， Lacointe A， Kasempsap P， et al. Carbohydrate reserves as a competing sink：evidence from tapping rubber trees[J]. Tree Physiology， 2007， 27（6）： 881-889.

責任編輯：黃東杰