周秋平等

摘 要 采用80 ℃水浴處理與稀釋涂布法從鶯歌海鹽場(chǎng)30%鹽度曬鹽池底泥中分離獲得215株芽胞桿菌。采用16S rDNA PCR-RFLP與16S rDNA序列分析技術(shù)，對(duì)分離的菌株進(jìn)行遺傳多樣性分析。16S rDNA PCR-RFLP酶切圖譜UPGMA聚類分析結(jié)果表明，在100%的相似性水平上，分離菌株歸屬到9種酶切類型。16S rDNA測(cè)序結(jié)果顯示，這些菌株主要分布在Pontibacillus、Halobacillus、Oceanobacillus和Bacillus等4個(gè)屬，其中Pontibacillus為優(yōu)勢(shì)屬。有7株芽胞桿菌的16S rDNA序列與數(shù)據(jù)庫中相應(yīng)模式菌的最大相似性在97.4%～99.0%之間，有可能為芽胞桿菌新種資源。

關(guān)鍵詞 芽胞桿菌；多樣性；16S rDNA PCR-RFLP；系統(tǒng)發(fā)育分析

中圖分類號(hào) S476.1 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A

Abstract 215 Bacillus-like bacterial strains were obtained from Yinggehai Saltern sediment of 30% salinity salt pond by using the method of 80 ℃ water bath treatment and diluting spread. The genetic diversities were analyzed by 16S rDNA PCR-RFLP and 16S rRNA gene sequence analysis. In the similarity level of 100%， cluster analysis of UPGMA map and 16S rDNA PCR-RFLP macrorestriction map showed that the isolates were grouped into 9 clusters， including genus Pontibacillus， Halobacillus， Oceanobacillus and Bacillus， in which Pontibacillus was the dominant one. Based on the comparison of 16S rRNA gene sequences， the highest similarities of seven strains with the corresponding type strains ranged from 97.4% to 99.0%. The results showed that culturable Bacillus-like species from Yinggehai Saltern sediment revealed high genetic diversity and there existed some novel species.

Key words Bacillus-like species； Diversity； 16S rDNA PCR-RFLP； Phylogeny analysis

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2014.09.028

芽胞桿菌為土壤細(xì)菌中的常見類群，是一類好氧或兼性厭氧、革蘭氏染色多為陽性、能產(chǎn)生芽胞的化能異養(yǎng)型細(xì)菌，廣泛分布于各種生態(tài)環(huán)境中，如水體[1]、土壤[2]、深海沉積物[3]。芽胞桿菌種類繁多、數(shù)量巨大、能夠產(chǎn)生多種生理活性物質(zhì)和代謝產(chǎn)物。芽胞桿菌在工農(nóng)業(yè)、醫(yī)藥衛(wèi)生、環(huán)保等領(lǐng)域具有廣泛的用途，如防治植物病蟲害[4]、處理工業(yè)廢水[5]等。

鶯歌海鹽場(chǎng)位于海南省樂東縣西南部海濱，是中國南方最大的海鹽廠，海灘涂地帶鹽田總面積37.97 km2，占全島鹽田總面積的63%，屬人工形成的海洋高鹽環(huán)境。高鹽環(huán)境中存在著獨(dú)特的微生物區(qū)系，過去對(duì)陸地高鹽環(huán)境中微生物的研究較多[6-11]，且發(fā)現(xiàn)芽胞桿菌屬為優(yōu)勢(shì)菌群。鶯歌海鹽場(chǎng)由一系列的曬鹽池組成，本研究對(duì)鶯歌海鹽場(chǎng)鹵水鹽度為30%曬鹽池底泥中的可培養(yǎng)芽胞桿菌資源進(jìn)行分離培養(yǎng)及遺傳多樣性研究，為了解、利用極端環(huán)境中的芽孢桿菌資源奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品采集 底泥樣品采集于鶯歌海鹽場(chǎng)鹵水鹽度為30%的曬鹽池。采用5點(diǎn)采樣法采集5～25 cm深的底泥50 g左右，放入無菌采樣袋中混合均勻，冰盒儲(chǔ)存，及時(shí)帶回實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行菌株分離，剩余樣品置4 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.2 培養(yǎng)基 R2A培養(yǎng)基：1 000 mL中含有可溶性淀粉10 g，酵母膏0.5 g，蛋白胨0.5 g，酸水解酪素0.5 g，葡萄糖 0.5 g，丙酮酸鈉0.3 g。PBMY培養(yǎng)基：1 000 mL中含有蛋白胨10 g，酵母膏3 g，牛肉膏0.5 g，MgSO4·7H2O 0.2 g。改良營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基：1 000 mL中含有牛肉膏0.3 g，蛋白胨1 g。淡薄培養(yǎng)基：1 000 mL中含有酵母膏0.7 g，蛋白胨1 g，葡萄糖1 g，（NH4）2SO4 0.2 g，MgSO4·7H2O 0.2 g，K2HPO4 1 g。所有培養(yǎng)基鹽濃度15%，采用30%的鹵水稀釋配制，pH7.0，瓊脂粉20～25 g/L。

1.2 方法

1.2.1 芽胞桿菌的分離純化 稱取10 g底泥樣品，放入盛有90 mL無菌鹵水的三角瓶中，置恒溫?fù)u床中振蕩30 min（30 ℃、200 r/min）；將得到的懸液稀釋至10-1～10-6梯度，80 ℃水浴處理20 min以滅活非芽胞細(xì)菌；吸取熱處理后的懸液0.1 mL，涂布平板，于30 ℃培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)，觀察菌落形狀、顏色等表型特征，挑單菌落劃線純化，直至得到純培養(yǎng)。

1.2.2 芽胞桿菌16S rDNA PCR-RFLP多樣性分析

基因組DNA的提取參照相關(guān)文獻(xiàn)[12]進(jìn)行。選用以下引物（由上海生工生物技術(shù)有限公司合成）擴(kuò)增16S rDNA基因：P1（5′-AGAGTTTGATCCTGGCT

CAGAACGAACGCT-3′），P6（5′-TACGGCTACCTTG

TTACGACTTCACCCC-3′）。PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?95 ℃ 15 min；94 ℃ 1 min，58 ℃ 1 min，72 ℃ 2 min，共30個(gè)循環(huán)；72 ℃ 10 min。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)MspⅠ（TaKaRa）酶切后，用3%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。用NTSYS-pc2.01軟件進(jìn)行相似性分析，采用平均連鎖法（UPGMA）聚類，得出菌株間的聚類關(guān)系[13]。

1.2.3 16S rDNA序列測(cè)定及其系統(tǒng)發(fā)育分析

從16S rDNA PCR-RFLP分型的不同遺傳類型中，各選取1～2株菌進(jìn)行16S rDNA測(cè)序（由上海生工生物工程有限公司完成）。將測(cè)序結(jié)果在EzTaxon server 2.1和GenBank 中進(jìn)行BLAST比較分析。采用MEGA5.0以鄰位相連法（Neighbor-Joining）構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

2 結(jié)果與分析

2.1 芽胞桿菌的分離

采用80 ℃水浴處理與稀釋涂布相結(jié)合的方法，從4種培養(yǎng)基上共分離獲得芽胞桿菌215株。分離于R2A培養(yǎng)基的72株，占分離總數(shù)的33.5%；分離于PBMY培養(yǎng)基的61株，占28.4%；分離于改良營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基的48株，占22.3%；分離于淡薄培養(yǎng)基的34株，占15.8%。在R2A培養(yǎng)基上生長的菌落，形態(tài)種類較多，而淡薄培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)較少。

2.2 鶯歌海鹽場(chǎng)曬鹽池底泥芽胞桿菌遺傳多樣性

從鶯歌海鹽場(chǎng)30%鹽度曬鹽池底泥中分離的215株芽胞桿菌，經(jīng)16S rDNA PCR-RFLP初步分型，每1個(gè)限制性片斷長度多態(tài)性類型代表1種酶切類型，共得到9種酶切類型，從9種類型中選出18株代表菌株的酶切圖譜見圖1。由代表菌株的聚類樹狀圖（圖2）可知，相似系數(shù)為0.62時(shí)，芽胞桿菌分為2個(gè)類群；相似系數(shù)為0.81時(shí)，分為7個(gè)類群；相似系數(shù)增大至1.00時(shí)，芽胞桿菌可分為9個(gè)類群。

2.3 菌株16S rDNA序列測(cè)定及其系統(tǒng)發(fā)育分析

根據(jù)每個(gè)遺傳型包含的菌株數(shù)量及其菌落形態(tài)特征，從9種酶切類型中選取15株代表菌進(jìn)行16S rRNA基因序列的測(cè)定。將所得序列在EzTaxon server 2.1和GenBank中進(jìn)行Blast比對(duì)分析。結(jié)果顯示，鶯歌海鹽場(chǎng)曬鹽池底泥可培養(yǎng)芽胞桿菌資源主要分布在芽胞桿菌科（Bacillaceae）和類芽胞桿菌科（Paenibacillaceae）。其中，Bacillaceae科下包含喜鹽芽胞桿菌屬（Halobacillus，33.3%）、芽胞桿菌屬（Bacillus，占13.3%）、海洋芽孢桿菌屬（Oceanobacillus，6.7%）3個(gè)屬；Paenibacillaceae科下有Pontibacillus屬（占46.7%），為可培養(yǎng)芽孢桿菌的優(yōu)勢(shì)屬，Halobacillus為次優(yōu)勢(shì)屬。

通過序列比對(duì)還發(fā)現(xiàn)，16S rDNA最大同源性在99.3%以上的有8株；同源性在98%～99%的有4株，分別是HB12542（98.0%）、HB12541（98.0%）、HB12547（98.1%）和HB12543（98.9%）；同源性在98%以下的有3株，分別是HB12536（97.7%）、HB12548（97.4%）和HB12569（97.8%）。這6株菌有可能代表著芽胞桿菌的新資源，為潛在的新分類單元。

各菌株間的系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系見圖3所示。菌株HB12527與菌株HB12530屬于Pontibacillus屬，在系統(tǒng)發(fā)育樹上聚為一簇，親緣關(guān)系較近；菌株HB12535與Pontibacillus yanchengensis聚于一簇，參考其16S rDNA的最大同源性數(shù)值（99.7%），推測(cè)HB12535可能為Pontibacillus yanchengensis；而HB12536、HB12542、HB12547和HB12569聚于系統(tǒng)發(fā)育樹上Pontibacillus屬的另一簇，同時(shí)其16S rDNA最大同源性為97.7%～98.1%，這4株菌可能代表著Pontibacillus屬新的分類單元。菌株HB12541與Halobacillus naozhouensis的序列相似性最高（98.0%），但在系統(tǒng)發(fā)育樹中處于一個(gè)相對(duì)獨(dú)立的分支，也可能是潛在的新種，有待于進(jìn)一步進(jìn)行多相分類以確定其最終歸屬地位。

3 討論與結(jié)論

高鹽環(huán)境微生物具有獨(dú)特的種群類型，它們具有特殊的生理機(jī)制及代謝產(chǎn)物類型，是一類極具開發(fā)潛力的生物資源。本文對(duì)鶯歌海鹽場(chǎng)30%鹽度曬鹽池底泥中可培養(yǎng)芽胞桿菌資源進(jìn)行研究，從中分離到215株芽胞桿菌，序列分析結(jié)果表明，這些菌株分屬于Pontibacillus、Halobacillus、Oceanobacillus和Bacillus屬，存在較高的多樣性；此外，系統(tǒng)發(fā)育分析表明，鶯歌海高鹽環(huán)境不同種芽胞桿菌間的進(jìn)化距離比較接近。

海洋（或沿海）高鹽環(huán)境中的微生物區(qū)系不同于內(nèi)陸高鹽環(huán)境[14]。肖煒[6]在研究昆明鹽礦古老巖鹽沉積中可培養(yǎng)細(xì)菌多樣性時(shí)發(fā)現(xiàn)，Bacillus為鹵水和鹽晶中的優(yōu)勢(shì)菌，各占總細(xì)菌分離量的26.1%和59.9%。馮二梅等[15]對(duì)煙臺(tái)海域中度嗜鹽菌進(jìn)行了分離鑒定，結(jié)果表明這些菌分布于7個(gè)屬，其中芽胞桿菌有Bacillus、Virgibacillus、Gracilibacillus。在陸地高鹽環(huán)境的研究中，鄭賀云等[7]在研究新疆阿克蘇地區(qū)鹽堿地中細(xì)菌多樣性時(shí)得出，Bacillus為其中的主要類群。潘媛媛等[8]在松嫩平原鹽堿地中也發(fā)現(xiàn)了Bacillus和Oceanobacillus資源。對(duì)新疆不同地區(qū)高鹽環(huán)境中嗜鹽菌的研究結(jié)果表明，不同高鹽地區(qū)的嗜鹽菌在組成上具有一定的相似性：Bacillus和Halobacillus在這些地區(qū)均有分布，但在各地區(qū)的優(yōu)勢(shì)度不同[9-11]。本研究在鶯歌海30%鹽度曬鹽池底泥中也發(fā)現(xiàn)了Halobacillus、Oceanobacillus和Bacillus等嗜鹽芽胞桿菌資源，反映出不同高鹽環(huán)境芽胞桿菌資源在群落組成上具有一定的相似性。但是，本研究中Pontibacillus為優(yōu)勢(shì)屬，與陸地高鹽環(huán)境中的不同，這也證明了海洋高鹽環(huán)境中芽胞桿菌資源的獨(dú)特性。

本研究還發(fā)現(xiàn)了一些潛在的芽孢桿菌新種，鶯歌海高鹽環(huán)境曬鹽池底泥中分離的嗜鹽菌HB12536與模式菌種Pontibacillus yanchengensis的親緣關(guān)系最近（相似性為97.7%），是Pontibacillus屬的潛在新種。Pontibacillus yanchengensis是一株革蘭氏陽性、嚴(yán)格好氧的中度嗜鹽芽胞桿菌[16]。菌株HB12541與模式菌種Halobacillus naozhouensis的親緣關(guān)系最近（相似性為98.0%），而Halobacillus naozhouensis是一株革蘭氏陽性、具有過氧化氫酶活性、好氧的桿狀中度嗜鹽細(xì)菌[17]。中度嗜鹽細(xì)菌對(duì)環(huán)境的適應(yīng)能力極強(qiáng)，分布廣泛，能分泌耐高溫的胞外酶（淀粉酶、脂肪酶等）和多聚體，可應(yīng)用于食品工業(yè)、酶制劑和化妝品生產(chǎn)、石油回收、基因工程領(lǐng)域以及環(huán)境污染的生物修復(fù)領(lǐng)域有著廣泛的應(yīng)用前景[18]。由此可見，鶯歌海高鹽環(huán)境曬鹽池底泥中存在著較為豐富的芽孢桿菌資源，并且存在一些潛在的芽孢桿菌新種，有待進(jìn)一步研究開發(fā)。

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