劉召亮等

摘 要 為研究芒果MiRab11蛋白的互作及其它生物學(xué)功能，本文在MiRab11基因序列基礎(chǔ)上，采用重疊PCR定點(diǎn)突變技術(shù)，獲得了2個(gè)結(jié)構(gòu)域突變體Mi-Rab11CA和Mi-Rab11DN，將其構(gòu)建原核表達(dá)載體，并成功轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21。SDS-PAGE結(jié)果顯示，在28 ℃條件下，用0.5 mmol/L IPTG誘導(dǎo)4 h，可獲得大量可溶性蛋白的表達(dá)。將可溶性蛋白經(jīng)Ni-NTA argrose層析柱純化并western blot鑒定，該重組蛋白均可與抗His單克隆抗體發(fā)生特異性免疫反應(yīng)。本研究為深入研究芒果pET-Rab11蛋白生理活性、特異性結(jié)合位點(diǎn)及功能調(diào)控打下良好基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞 芒果；MiRab11；突變體蛋白；原核表達(dá)；純化；鑒定

中圖分類號(hào) S667.7 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A

Abstract In order to study the interaction of MiRab11 with proteins and other biological functions overlapping PCR was applied to obtain two mutant（MiRab11CA and MiRab11DN）based on the known sequence of MiRab11. And the prokaryotic expression vectors of pET-Rab11， pET-Rab11CA， and pET-Rab11DN were successfully constructed and transformed into E.coli BL 21（DE3）. SDS-PAGE results showed that the fusion protein were expressed induced by 0.5 mmol/L IPTG， at 28 ℃ for 4 hours in E.coli BL21. And these soluble proteins could be purified by chromatography on nickel agarose column. Western blotting demonstrated that the recombinant fusion proteins can be recognized by anti-6-His monoclonal antibody. These results provide the basis for the studies of the physiological activity and the specific binding site and the function regulation of the MiRab11 protein.

Key words Mango； MiRab11 gene； Mutant proteins； Prokaryotic expression； Protein purification； Identification

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2014.09.012

Rab家族是Ras蛋白超家族中最大最復(fù)雜的小G蛋白成員，普遍存在于真核細(xì)胞，定位于細(xì)胞內(nèi)與胞吞和胞吐相關(guān)的不同的膜區(qū)室上，起分子開關(guān)作用，調(diào)節(jié)囊泡的形成、轉(zhuǎn)運(yùn)、粘附和融合過程[1-2]，廣泛調(diào)控植物的生長發(fā)育、形態(tài)建成、逆境脅迫反應(yīng)等[3]；轉(zhuǎn)AtRab7基因擬南芥可明顯提高對鹽的耐受性[4]；AvrPto因子可以與Rab蛋白發(fā)生互作，破壞番茄RabE蛋白調(diào)節(jié)的膜運(yùn)輸途徑，使植物感病[5]。Rab11是Rab家族成員中數(shù)量最多、功能最多樣化的亞家族[6-7]。擬南芥基因組中有57個(gè)Rab，其中26個(gè)為rab11亞家族成員；葡萄基因組中存在26個(gè)Rab，其中rab11為14個(gè)[8-9]。芒果MiRabX基因特異性表達(dá)于成熟果實(shí)中，以此序列為探針，獲得番茄SlRab11，反義番茄不能正常成熟[10-11]。煙草NtRab11基因與花粉管的極性生長密切相關(guān)[12]。轉(zhuǎn)水稻OsRab11基因擬南芥及其突變體對鹽的耐受性明顯提高[13]。百脈根基因組中存在10個(gè)LcRab11基因，其中4個(gè)與根瘤的形成有關(guān)[14]。

在前期對芒果進(jìn)行逆境相關(guān)基因差異顯示分析中[15]，從芒果逆境脅迫組織中分離獲得了一個(gè)Rab蛋白家族成員MiRab11，該基因可能與果實(shí)成熟，環(huán)境脅迫和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)。為進(jìn)一步分析其基因蛋白功能，本文采用定點(diǎn)突變技術(shù)與原核表達(dá)，構(gòu)建、表達(dá)和純化了MiRab11的原核表達(dá)蛋白及其結(jié)構(gòu)域突變蛋白，并經(jīng)Western Blot證實(shí)，上述重組蛋白均可與抗His單克隆抗體發(fā)生特異性結(jié)合反應(yīng)。為深入研究芒果MiRab11基因蛋白生理活性、特異性結(jié)合位點(diǎn)及功能調(diào)控打下良好基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株與載體 大腸桿菌DH5α和宿主菌BL21（DE3）細(xì)胞購于北京全式金生物公司；原核表達(dá)載體pET-30a由廣西大學(xué)亞熱帶農(nóng)業(yè)生物資源保護(hù)與利用國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室王凜饋贈(zèng)。pMD-18T載體購自TaKaRa。

1.1.2 試劑 限制性內(nèi)切酶BamHⅠ、SalⅠ、Taq DNA聚合酶、dNTPs等都購自于Fermentas公司（加拿大）；M-MLV逆轉(zhuǎn)錄、RNase H、pMD-18T載體、Ligation Kit Ver.2.1均購自TaKaRa；蛋白預(yù)染marker、氨節(jié)青霉素（Amp）、卡那霉素（Kan）、IPTG購于上海生工；質(zhì)粒提取試劑盒、凝膠回收試劑盒購自Bioer公司；Ni金屬螯合柱和試劑均購自Qiagen 公司；鼠源His標(biāo)簽抗體、山羊抗鼠IgG購自TIANGEN 公司（北京）；其它試劑均為國產(chǎn)分析純試劑。引物合成及序列測定由上海生工完成。

1.2 方法

1.2.1 MiRab11基因CDS的克隆 根據(jù)已克隆的MiRab11基因全長cDNA序列（GenBank登錄號(hào)為KF768564），設(shè)計(jì)包含酶切位點(diǎn)的上游和下游引物與定點(diǎn)突變引物（表1）。以芒果果實(shí)cDNA為模板，通過高保真Dream Taq聚合酶PCR擴(kuò)增，產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測后，回收目的片段，連接到pMD-18T載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞后，經(jīng)藍(lán)白斑篩選和菌液PCR檢測陽性后，進(jìn)行測序。

1.2.2 MiRab11基因結(jié)構(gòu)域定點(diǎn)突變體片段的擴(kuò)增

基因突變體片段擴(kuò)增，參照Ho等[16]重疊PCR定點(diǎn)突變技術(shù)。用包含MiRab11基因的大腸桿菌菌株質(zhì)粒作為模板，以MCF引物與Erab11R引物和MCR引物與Erab11F引物，分別進(jìn)行第一輪PCR，將產(chǎn)物分別稀釋100倍后，各取1 μL作為第二輪PCR的模板，以Erab11F和Erab11R引物進(jìn)行第二輪PCR，即可得到Erab11的突變片段MiRab11CA（Q72L）。同理，可得到Erab11的突變片段MiRab11DN（S27N）。

1.2.3 重組表達(dá)載體的構(gòu)建 以測序正確的重組pMD18-T-Rab11、pMD18-T-Rab11CA和pMD18-T-Rab11DN菌株提取質(zhì)粒，用BamHⅠ與 SalⅠ分別雙酶切表達(dá)載體pET-30a（+）和上述提取的質(zhì)粒，回收線性載體片段和目的基因片段，用SolutionⅠ連接后，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞。菌液PCR和測序檢測正確后，提取質(zhì)粒。經(jīng)BamHⅠ與 SalⅠ雙酶切驗(yàn)證無誤后，將質(zhì)粒轉(zhuǎn)化原核表達(dá)菌株BL21，篩選陽性菌株，用于重組蛋白表達(dá)。

1.2.4 基因原核表達(dá)分析 將上述重組表達(dá)質(zhì)粒和空載體pET-30a（+）分別轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21（DE3），挑取單菌落接種于終濃度為50 mg/mL Kan的LB培養(yǎng)基（20 mL）中，37 ℃ 培養(yǎng)過夜，以1 ∶ 50的比例加入含Kan的LB培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)至OD600約為0.8時(shí)，用終濃度為0.5 mmol/L誘導(dǎo)劑IPTG 28 ℃誘導(dǎo)4 h。收集2 mL菌液，12 000 r/min ，離心5 min，用80 μL PBS（pH7.4）懸浮，加入5×SDS-Loading Buffer 20 μL，混勻后置冰上10 min，煮沸10 min，12 000 r/min，離10 min，取10 μL上清進(jìn)行15% SDS-PAGE電泳分析誘導(dǎo)蛋白表達(dá)情況，以pET30a（+）空載體轉(zhuǎn)化菌樣品、BL21菌樣品和未經(jīng)誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)化菌為對照。

1.2.5 重組蛋白的純化與Western Blot檢測 將上述重組陽性菌株pET-Rab11、pET-Rab11CA和pET-Rab11DN按同樣的條件誘導(dǎo)蛋白表達(dá)后，收集菌體，重懸于含有蛋白酶抑制劑的PBS緩沖液中，超聲破碎至菌液澄清，離心收集上清。將收集的上清過Ni-NTA小柱，得到純化的重組蛋白。經(jīng)SDS-PAGE電泳，電轉(zhuǎn)至硝酸纖維素膜上，封閉液室溫封閉90 min后4 ℃過夜；加入1 ∶ 5 000稀釋的鼠抗6×His的單抗，室溫反應(yīng)2 h；TBS洗滌后，加入1 ∶ 5 000稀釋的辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗小鼠抗體室溫反應(yīng)1.5 h；充分洗滌，加入新鮮配制的二氨基聯(lián)苯胺（DAB）顯色液；待顯色條帶清晰后立即用蒸餾水洗滌硝酸纖維素膜。同時(shí)設(shè)BL21菌和pET30a（+）空載體轉(zhuǎn)化菌樣品對照。

2 結(jié)果與分析

2.1 MiRab11基因CDS片段及結(jié)構(gòu)域突變體的擴(kuò)增

MiRab11基因編碼的蛋白具有Rab家族保守的G1-G5結(jié)構(gòu)域，其中G1（GDSGVGKS）和G3（DTAGQE）結(jié)構(gòu)域，與GTP的結(jié)合有關(guān)。通過定點(diǎn)突變結(jié)構(gòu)域中的特定氨基酸，可以突變產(chǎn)生激活態(tài)和失活態(tài)的Rab蛋白。通過定點(diǎn)突變重疊PCR技術(shù)可獲得包含酶切位點(diǎn)的MiRab11基因CDS片段及結(jié)構(gòu)域突變體。經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分析，突變體MiRab11CA和MiRab11DN的第一輪PCR產(chǎn)物電泳（圖1-a），經(jīng)過兩輪PCR后，得到結(jié)構(gòu)域突變MiRab11CA和MiRab11DN。結(jié)果顯示兩突變體與未突變的MiRab11基因CDS片段大小相等，均約為660 bp，與預(yù)期結(jié)果相符（圖1-b）。

2.2 原核表達(dá)載體的構(gòu)建

提取原核重組的陽性表達(dá)菌株pET-Rab11、pET-Rab11CA和pET-Rab11DN質(zhì)粒，用BamHⅠ與SalⅠ分別雙酶切，用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測。結(jié)果顯示，上述質(zhì)粒均可得與預(yù)期結(jié)果相符的目的片段，大小約為660 bp（圖2）。結(jié)果表明，原核重組表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建成功。

2.3 原核表達(dá)載體的表達(dá)

重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌，經(jīng)37 ℃培養(yǎng)至OD600約為0.8時(shí)，用終濃度為0.5 mmol/L誘導(dǎo)劑IPTG 28 ℃，180 r/min，誘導(dǎo)4 h后，取樣進(jìn)行SDS-PAGE電泳分析。結(jié)果顯示，重組質(zhì)粒在大腸桿菌BL 21中得到表達(dá)，表達(dá)的重組蛋白為融合蛋白，分子量約為25 ku（圖3），與理論值大小相符。

2.4 重組蛋白純化與蛋白印跡分析

純化的重組蛋白pET-Rab11、pET-Rab11DN、pET-Rab11CA與小鼠6×His的單克隆抗體進(jìn)行Western Blot分析。結(jié)果顯示，上述重組蛋白在約25 ku處均出現(xiàn)特異性條帶（圖4），而空白BL 21和pET30a-BL21總蛋白在同一處沒有出現(xiàn)特異性條帶。

3 討論與結(jié)論

結(jié)合原核蛋白表達(dá)和定點(diǎn)突變技術(shù)是研究蛋白功能的有效方法，通過對Rab蛋白的功能結(jié)構(gòu)域的突變能有效推斷蛋白結(jié)構(gòu)域的功能。根據(jù)Rab家族成員具有的保守結(jié)構(gòu)域，分別突變與GTP結(jié)合有關(guān)典型結(jié)構(gòu)域的G1（GDSGVGKS）和G3（DTAGQE），定點(diǎn)突變這些結(jié)構(gòu)域的特定氨基酸，可以產(chǎn)生失活和激活狀態(tài)下的Rab蛋白突變體，如煙草突變體Rab11b（S28N）和Rab11b（Q73L）均不同程度地影響花粉管的生長；番茄突變體LeRab11a表達(dá)可以負(fù)調(diào)控細(xì)胞的分泌活動(dòng)[17-18]。為研究MiRab11的功能，對該基因及突變體原核表達(dá)分析，pET-Rab11及突變體pET-Rab11DN和pET-Rab11CA，經(jīng)誘導(dǎo)均可獲得特異性表達(dá)。一般而言，異源真核基因在大腸桿菌中容易受密碼子偏好表達(dá)影響[15]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，pET-Rab11及其結(jié)構(gòu)域突變蛋白不受密碼子偏好性問題的影響，能夠在大腸桿菌中大量特異性表達(dá)。一方面，由于Rab11蛋白保守的結(jié)構(gòu)決定了其理化性質(zhì)，蛋白編碼區(qū)內(nèi)不存在信號(hào)肽，有跨膜結(jié)構(gòu)[16]，如條斑紫菜Rab11基因構(gòu)建原核pET-28a表達(dá)重組載體可以在大腸桿菌BL 21中成功表達(dá)該蛋白[17]；另一方面，使用的高效表達(dá)載體pET-30a具有功能強(qiáng)大的 T7 啟動(dòng)子，可以使大多數(shù)的細(xì)胞資源在誘導(dǎo)充分條件下，被用于目的基因的表達(dá)，可獲得高效表達(dá)的重組蛋白[18]。此外，pET-30a載體含有的6×His標(biāo)簽作為純化的標(biāo)識(shí)，其His融合蛋白經(jīng)過Ni-NTA argrose層析柱容易純化。純化的蛋白經(jīng)Western Blot表明，均可與抗His單克隆抗體發(fā)生特異性結(jié)合反應(yīng)。

總之，由于直接從芒果樹體內(nèi)分離純化MiRab11蛋白，難度大，獲取量少，不能滿足制備MiRab11蛋白多克隆抗體等實(shí)驗(yàn)的需要。本研究通過重疊PCR定點(diǎn)突變技術(shù)對MiRab11蛋白的功能結(jié)構(gòu)域進(jìn)行突變，結(jié)合原核表達(dá)分析獲得了大量純化的MiRab11蛋白及突變蛋白MiRab11DN和MiRabCA，為深入研究芒果MiRab11蛋白生理活性，特異性結(jié)合位點(diǎn)及功能調(diào)控打下了良好基礎(chǔ)。

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