白瑪卓嘎 何文斌 劉可可 普布赤列 伏江南 孟飛雄 大達(dá)瓦次仁

摘要 [目的]研究墊狀點(diǎn)地梅生物堿熱回流提取的較優(yōu)方法。[方法]采用熱回流提取、單因素對(duì)比試驗(yàn)、正交試驗(yàn)和紫外-可見光分光光度分析，提出了墊狀點(diǎn)地梅生物總堿的合理提取方案。[結(jié)果]乙醇體積分?jǐn)?shù)75%、回流溫度75 ℃、料液比（m/v）1∶15、回流時(shí)間3 h為最佳提取條件，此時(shí)提取墊狀點(diǎn)地梅生物總堿提取率將達(dá)1.257%。[結(jié)論]該試驗(yàn)方法簡(jiǎn)便、科學(xué)可靠，可對(duì)墊狀點(diǎn)地梅生物堿工業(yè)提取起到一定的參考價(jià)值。

關(guān)鍵詞 墊狀點(diǎn)地梅;總生物堿;提取工藝

中圖分類號(hào) S567 ?文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A ?文章編號(hào) 0517-6611（2014）34-12073-02

Reseach on the Extraction Technology of Total Alkaloids from Androsace tapete in Tibet

PAMA Droga， HE Wenbin，LIU Keke， DADAWA Ciren* et al

（College of Science，Tibet University，Lhasa，Tibet 850000）

Abstract [Objective] The research aimed to study the optimum method of alkaloids hot reflux extraction from Androsace tapete. [Method]The alkaloids reasonable extraction scheme of Androsace tapete was proposed by heat reflux extraction， single factor comparative experiment， orthogonal experiment and UVVis spectrophotometric analysis.[Result]While the volume fraction of ethanol was 75%， the refiux temperature was 75 ℃， the ratio of material to liquid（m/v） was 1∶15，and the refiux time was 3 hours，we can get the best extraction effect to the total Alkaloids of Androsace tapete.The extraction rate of alkaloids from Androsace tapete would reach 1.257%.[Conclusion]This experimental method was simple， scientific and reliable， and can have a certain reference value for the industrial extraction of alkaloids from Androsace tapete.

Key words Androsace tapete; Total alkaloids; Extraction technology

墊狀點(diǎn)地梅（藏藥名噶蒂慕布），報(bào)春花科點(diǎn)地梅屬，多年生矮小草本[1]，常生于山野草地或路旁，是青藏高原較為常見的一種植物。其藥用價(jià)值主要表現(xiàn)為清熱解毒、消腫止痛，主治扁桃體炎、咽喉炎、口腔炎、急性結(jié)膜炎、跌打損傷[2]，可全草入藥，有極高的開發(fā)前景和利用價(jià)值。

西藏墊狀點(diǎn)地梅具有較強(qiáng)的生理活性[3]，但對(duì)其活性成分的研究尚未見報(bào)道。該試驗(yàn)對(duì)西藏墊狀點(diǎn)地梅所含生物堿類化合物的含量及其提取工藝進(jìn)行初步研究，為墊狀點(diǎn)地梅的生物資源開發(fā)提供一定的參考。

1 材料與方法

1.1 材料

墊狀點(diǎn)地梅由筆者2013年7月采自西藏自治區(qū)拉薩市南次角林生態(tài)公園內(nèi)（海拔4 370 m），經(jīng)鑒定為墊狀點(diǎn)地梅。樣品全株采集，洗凈置于60 ℃干燥箱中烘干，過120目篩粉碎，密封備用[3]。

1.2 儀器及試劑

756MC紫外可見光光度計(jì)（上海菁華科技儀器有限公司）、 90-2型定時(shí)恒溫磁力攪拌器（上海精科實(shí)業(yè)有限公司）、800離心機(jī)（上海科技實(shí)驗(yàn)儀器廠）、PHS-2C數(shù)字式PH計(jì)、恒溫干燥箱（上?？萍紝?shí)驗(yàn)廠）、電子天平（上海上平儀器公司）、恒溫水浴鍋（上?？萍紝?shí)驗(yàn)儀器公司）、RE52旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海亞榮儀器廠）、SHD-Ⅲ循環(huán)水式多用真空泵（保定高新區(qū)陽(yáng)光科技儀器廠）。

95%乙醇、氯仿、溴酚藍(lán)、硫酸、氫氧化鈉、丙酮等試劑均為分析純。

1.3 方法

1.3.1 總生物堿提取及純化方法。

精確稱取墊狀點(diǎn)地梅試樣10 g，加入適量體積及濃度乙醇，置于索氏提取器中，在恒溫水浴情況下進(jìn)行回流提取[4]。得到提取母液，調(diào)節(jié)pH 3～4，利用回旋蒸發(fā)儀濃縮至無明顯乙醇[5]。攪拌后利用保鮮膜密封靜置12 h，取出溶液，過濾去不溶于酸的物質(zhì)，同時(shí)用氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH至10～11，加入等量的氯仿，振蕩，利用分液漏斗分出氯仿層，并重復(fù)萃取3次，以達(dá)到除去雜質(zhì)和色素的效果[6]。最后合并氯仿萃取液，利用回旋蒸發(fā)儀減壓回收氯仿至干，得到總生物堿[7]。將所得生物堿置于100 ml的容量瓶中加入95%乙醇溶液至刻度，定溶搖勻，備用[8]。

1.3.2 單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)。

1.3.2.1 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)生物總堿提取的影響。

分別采用體積分?jǐn)?shù)為55%、65%、75%、85%、95%的乙醇，利用上述熱回流法，在水浴溫度為65 ℃情況下回流提取3次，提取時(shí)間設(shè)定為3 h，料液比（m/v）采用1∶20。利用紫外分光光度法測(cè)定提取液總生物堿含量，確定最佳的乙醇提取體積分?jǐn)?shù)。

1.3.2.2 提取溫度對(duì)提取效率的影響。

分別采用45、55、65、75、85 ℃水浴條件下，利用95%乙醇對(duì)試樣進(jìn)行熱回流提取3 h，料液比1∶20。利用紫外分光光度法測(cè)定提取液總生物堿含量，確定最佳的生物堿提取溫度。

1.3.2.3 熱回流提取時(shí)間對(duì)生物提取率的影響。

分別將熱回流時(shí)間設(shè)定為1、2、3、4、5 h條件下，利用95%乙醇液在65 ℃水浴溫度、1∶20的料液比下提取。利用紫外分光光度法測(cè)定提取液生物堿總含量，確定最佳生物堿提取回流時(shí)間。

1.3.2.4 熱回流提取物料比對(duì)提取效率的影響。

分別采用試樣/乙醇（m/v）為1∶5、1∶10、1∶15、1∶20、1∶25為條件，利用95%乙醇在65 ℃水浴溫度下，回流提取3 h。利用紫外分光光度法測(cè)定提取液生物堿總含量，確定最佳生物堿提取回流物料比。

1.3.3 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)。

通過利用熱回流單因素試驗(yàn)對(duì)上述不同提取條件進(jìn)行初步的篩選，分析各參數(shù)影響主次因素，得到最佳的提取工藝進(jìn)行正交試驗(yàn)。參照單因素試驗(yàn)結(jié)果，以影響總生物堿提取率的乙醇體積分?jǐn)?shù)、提取溫度、回流提取時(shí)間、料液比為4個(gè)影響因素，5個(gè)水平 L9（54）進(jìn)行正交試驗(yàn)（表1）[9]，選最佳提取工藝。

表1 熱回流提取因素及水平

水平A（乙醇體積

分?jǐn)?shù)∥%）B（提取溫

度∥℃）C（回流提

取時(shí)間∥h）D（料液比）

1554511∶5

2655521∶10

3756531∶15

4857541∶20

5958551∶25

1.3.4 墊狀點(diǎn)地梅生物堿總堿提取率的測(cè)定。

1.3.4.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的配制。

精密稱取鹽酸小檗堿對(duì)照品0003 0 g，置于50 ml容量瓶中，用0.05 mol/L的硫酸溶解，并稀釋至刻度，定容搖勻備用。分別精密量取0.05、0.10、015、1.00、2.00、3.00、4.00、5.00 ml配成每1 ml含有鹽酸小檗堿0.124、0.248、0.372、2.480、4.960、7.440、9.920、12.400 mg的對(duì)照品溶液，以0.05 mol/L硫酸溶液為空白液，在波長(zhǎng)為345 nm處分別測(cè)定其吸收度，以濃度為橫坐標(biāo)、吸收度為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，求得回歸方程為y=0.067 16 x+0.023 54（r=0.999 9）。

1.3.4.2 樣品液的制備與生物堿含量測(cè)定。

將已經(jīng)提取純化的各組母液取出，各量取5 ml置于10 ml容量瓶中，利用95%乙醇定容，搖勻;再取上述配制溶液5 ml置于10 ml容量瓶中加0.05 mol/L硫酸至刻度搖勻，備用。

以0.05 mol/L硫酸為空白液，將制備好的生物堿樣品溶液在波長(zhǎng)345 nm處分別測(cè)定其吸收度。所測(cè)樣品吸收度于標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程換算后，得出試樣中總生物堿濃度，然后按下式進(jìn)行計(jì)算，得出各條件下生物堿提取率，

即提取率=（C×N×V）/M=（C‵×25×5）/10 000，

式中，C為提取液中總生物堿質(zhì)量濃度（mg/ml）;N為稀釋倍數(shù);V為初始定容體積（ml）;M為樣品質(zhì)量（mg）;C‵為根據(jù)提取液的吸光度代入回歸方程計(jì)算出的總生物堿質(zhì)量濃度（mg/ml）。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果分析

2.1.1 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)生物總堿提取的影響。

由圖1可見，在利用不同體積分?jǐn)?shù)的乙醇對(duì)墊狀點(diǎn)地梅的生物堿進(jìn)行回流提取時(shí)，隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的不斷升高，提取率也在不斷升高，當(dāng)?shù)竭_(dá)濃度為75%時(shí)達(dá)到最大，以后隨著乙醇濃度的不斷升高，提取率略微有所下降。筆者推測(cè)可能是因?yàn)橐掖己康牟粩嘣黾?，使得乙醇中可揮發(fā)性生物堿容量不斷增加，影響到回流萃取的效率，而如果存在一些水分則可以溶解一部分可揮發(fā)組分，這樣來就增加了提取的效率。所以在選取墊狀點(diǎn)地梅生物堿提取乙醇體積分?jǐn)?shù)時(shí)，75%體積分?jǐn)?shù)的乙醇較為適宜。

圖1 乙醇濃度對(duì)提取率的影響

2.1.2 提取溫度對(duì)生物堿產(chǎn)率的影響。

由圖2可知，在利用不同溫度條件對(duì)墊狀點(diǎn)地梅生物堿提取試驗(yàn)中，生物堿總堿的提取率隨溫度的升高不斷升高，到75 ℃達(dá)到最高的0.885%，高于此溫度的85 ℃時(shí)就有所下降。筆者分析認(rèn)為乙醇在拉薩汽化溫度為68 ℃，75 ℃的水浴溫度可以使乙醇以均勻的速度汽化，于儀器中產(chǎn)生適宜的蒸汽壓，有利于生物堿的提取;而高于此溫度的85 ℃使乙醇激烈的汽化，回流速度加快降低了回流提取的效率。因此，墊狀點(diǎn)地梅生物堿回流提取的溫度應(yīng)選擇75 ℃為宜。

圖2 提取溫度對(duì)提取率的影響

2.1.3 提取回流時(shí)間對(duì)生物堿提取率的影響。

在對(duì)墊狀點(diǎn)地梅的生物堿回流提取試驗(yàn)中，隨著回流時(shí)間的不斷增加，生物堿的提取率也在不斷的增加。在1～3 h過程中提取效率變化較快，3 h以后雖有增加，但變化趨于平緩（圖3）。如果僅以提取率為參考因素，則可以采用較長(zhǎng)提取時(shí)間;而綜合成本而言，可選擇3～4 h較為適宜。

圖3 回流時(shí)間對(duì)提取率的影響

2.1.4 提取料液比對(duì)提取率的影響。

由圖4分析可得，在墊狀點(diǎn)地梅生物堿回流提取試驗(yàn)中，采用不同的料液比所得到的提取率有差異，但總體而言，料液比選擇1∶15時(shí)，提取率可高達(dá)0.751%。