林 海,崔 軒,董穎博,張國華,李笑晴,季 振 (北京科技大學(xué)土木與環(huán)境工程學(xué)院,北京 100083)

銅尾礦庫重金屬Cu、Zn對細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的影響

林 海*,崔 軒,董穎博,張國華,李笑晴,季 振 (北京科技大學(xué)土木與環(huán)境工程學(xué)院,北京 100083)

以湖北某銅礦尾礦庫為主要研究對象,采集庫內(nèi)尾礦樣品11個、對照樣某小型廢棄尾礦庫尾礦樣品2個和附近耕地土壤樣品1個,采用變性梯度凝膠電泳方法對上述樣品中細(xì)菌的16S rRNA V3～V6可變區(qū)擴(kuò)增片段進(jìn)行分析,利用分析得到的圖譜數(shù)據(jù)與所測得樣品的理化性質(zhì)及重金屬Cu、Zn含量進(jìn)行相關(guān)性及冗余度(RDA)分析.結(jié)果表明,尾礦庫內(nèi)Cu、Zn污染嚴(yán)重并波及周邊,與尾礦樣品的理化性質(zhì)存在不同的相關(guān)性,其中Zn的污染程度與有機(jī)質(zhì)存在極顯著正相關(guān)[R=0.668(P<0.01)].DGGE圖譜分析結(jié)果發(fā)現(xiàn),樣品細(xì)菌多樣性較低,相似性較高(最低相似度53.1%),優(yōu)勢菌群相對穩(wěn)定,PCA分析表明,Cu和Zn對細(xì)菌多樣性具有抑制作用.RDA分析結(jié)果說明Cu和Zn的含量對細(xì)菌種群分布影響很大,Cu對大部分種群具有抑制作用,而Zn一方面能促進(jìn)某些種屬數(shù)量,另一方面又能抑制其他種群的結(jié)構(gòu)變化,這種影響并不是實驗室研究的簡單線性關(guān)系.

銅尾礦庫；細(xì)菌群落；Cu；Zn；DGGE

重金屬在這個特殊環(huán)境中有著獨特的地球化學(xué)行為及生物有效性.尾礦顆粒細(xì)小、易隨風(fēng)揚塵,

導(dǎo)致空氣污染,特別是長期堆存條件下的尾礦在微生物和風(fēng)化作用影響下,尾礦中重金屬元素將發(fā)生大規(guī)?；罨?、遷移、形態(tài)轉(zhuǎn)化,外排的廢液或揚塵進(jìn)入周邊環(huán)境,從而對周邊環(huán)境產(chǎn)生重金屬污染和危害,對周圍生態(tài)系統(tǒng)造成潛在的、長期的巨大威脅[2].

重金屬污染能夠明顯影響土壤微生物群落結(jié)構(gòu),已有研究表明微生物群落結(jié)構(gòu)的變化能夠較早地預(yù)測土壤養(yǎng)分及環(huán)境質(zhì)量的變化過程,被認(rèn)為是最有潛力的敏感性生物指標(biāo)[3].隨著現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展,在分子水平上研究重金屬對微生物群落的影響已成為可能.變性梯度凝膠電泳技術(shù)(DGGE)是目前研究微生物遺傳多樣性比較有力的分子生物技術(shù)之一,這一技術(shù)能夠提供群落中優(yōu)勢種類信息,同時分析多個樣品,具有可重復(fù)和易操作等特點,適合于調(diào)查群落結(jié)構(gòu)變化[4-5].Gomes[6]等通過向土壤中投加富含Cd、Zn的污泥觀察細(xì)菌的DGGE圖譜發(fā)現(xiàn),不管是短期還是長期污染過程中其基因圖譜都產(chǎn)生了顯著變化.潘雪蓮等[7]通過對黃土高原 5個土壤樣品進(jìn)行DGGE分析發(fā)現(xiàn)不同微生物群落結(jié)構(gòu)的成因與季風(fēng)性氣候引起的溫濕環(huán)境變化及冰期有關(guān).

近年來,國內(nèi)外學(xué)者對銅尾礦、鉛鋅尾礦污染區(qū)重金屬污染現(xiàn)狀,包括重金屬含量、形態(tài)特征以及對污染區(qū)微生物及植被的影響等方面進(jìn)行了研究[8-13].但有關(guān)尾礦庫這個污染源內(nèi)在的微生物群落結(jié)構(gòu)的研究報道較少.據(jù)此,本研究通過對湖北某銅礦尾礦庫重金屬污染及對其最為敏感的微生物—細(xì)菌特性進(jìn)行研究,旨在探討重金屬污染與細(xì)菌特征指標(biāo)間的內(nèi)在關(guān)系,以期為土壤重金屬污染程度與細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的相互影響研究提供新的證據(jù).

1 尾礦庫自然概況與研究方法

1.1 尾礦庫自然概況

所取樣銅尾礦庫位于湖北省大冶市西南,距大冶市區(qū)約 3km.地表土壤旱地主要為紅壤和磚紅壤,農(nóng)田主要為稻田土[14].庫長 1km,寬 0.7km,庫面面積為0.6km2,近似卵圓形,壩內(nèi)已堆存尾礦500余萬t.尾礦砂的主要礦物組分為鐵礦物和銅礦物以及少量含鋅礦物,如黃銅礦、赤鐵礦及黃鐵礦等;主要脈石礦物為方解石、石英和玉髓等[15].

1.2 研究方法

1.2.1 樣品的采集和保存 在尾礦庫里設(shè)置 5個相互距離較遠(yuǎn)的樣點,每個樣點根據(jù)尾礦樣形態(tài)、色澤、土質(zhì)取表層和深層樣品;另取附近距離約1km一小型廢棄銅尾礦庫樣品和附近長有植物的耕土作對照,樣品裝入塑料保鮮袋,24h內(nèi)帶回實驗室,取樣結(jié)果如表 1.一部分新鮮土壤置于 4℃保存供土壤生物性指標(biāo)分析,一部分土樣風(fēng)干保存,研磨過1mm網(wǎng)篩,用于測定理化性質(zhì).

表1 取樣點的選擇及編號Table 1 The number of sampling points

1.2.2 樣品理化性質(zhì)及重金屬測定 土壤理化性質(zhì)按常規(guī)方法測定[9],分別測定pH值、氧化還原電位(Eh)、電導(dǎo)率(κ).陽離子交換量(CEC)采用BaCl2交換法測定;有機(jī)質(zhì)采用K2Cr2O7容量法測定.鑒于取樣尾礦庫僅有 Cu和 Zn超標(biāo)(Pb、Cd、Cr含量均低于檢出限—Pb≤0.05%、Cd、Cr≤0.01%,由北京科技大學(xué)化學(xué)分析中心提供),所以重點對Cu和Zn進(jìn)行檢測.Cu離子用水質(zhì)分析儀測定,Zn離子采用比色法測定[16].

1.2.3 土壤微生物DNA提取及細(xì)菌16S rRNA的PCR擴(kuò)增 土壤總DNA采用康為世紀(jì)生物公司生產(chǎn)的土壤 DNA提取試劑盒提取,提取的DNA經(jīng)純化后置于-20℃下儲存.采用英駿公司合 成 的 細(xì) 菌 特 異 性 引 物 GC-357F(5′-CGCCGGGGGCGCGCCCCGGGCGGGGCGGG GGCACGGGGGGCCTACGGGAGGCAGCAG-3′,下劃線部分為 GC夾子序列)和通用引物518R(5′-ATTACCGCGGCTGCTGG-3′)對土壤細(xì)菌的16S rRNA的V3～V6區(qū)進(jìn)行PCR擴(kuò)增. 25μL的 PCR反應(yīng)體系:2×Taq MasterMix for PAGE 12.5μL,上下游引物(10μmol/L)各 0.5μL, DNA模板0.5μL,去離子水11μL.擴(kuò)增條件:95℃預(yù)變性3min,94℃變性1min,55℃退火1min,72℃延伸1min,35個循環(huán),最后72℃延伸10min.PCR產(chǎn)物采用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測.

1.2.4 變性梯度凝膠電泳 各樣品的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)純化后進(jìn)行DGGE電泳,然后用Quantity One 4.6.7軟件對DGGE圖進(jìn)行條帶識別和圖譜分析使用北京君意東方電泳公司生產(chǎn)的JY-TD331A型號對細(xì)菌16S rRNA PCR產(chǎn)物進(jìn)行DGGE測試.使用8%的聚丙烯酰胺凝膠,電泳緩沖液為1×TAE,變性梯度區(qū)間30%～45%,上樣量為10μL.60℃、100V恒溫恒壓電泳10h,采用銀染:先用固定液固定 15min,然后避光銀染15min,最后用顯色液顯色至條帶清晰,凝膠顯色后拍照.

1.2.5 數(shù)據(jù)分析方法 采用 SPSS進(jìn)行差異性和相關(guān)性分析,利用quantity one(Version 4.6.7)進(jìn)行DGGE圖譜識別和統(tǒng)計,確定各個樣品電泳條帶的數(shù)量和亮度峰值,利用Canoco for Windows軟件進(jìn)行細(xì)菌群落和理化因子的冗余度分析(RDA).

2 結(jié)果與討論

2.1 樣品理化性質(zhì)與重金屬污染之間的關(guān)系

由表2和表3可見,樣品的pH都在8.0以上,屬堿性土且普遍比耕土土壤的pH值高,可能是因為選礦過程中堿性浮選藥劑的添加導(dǎo)致pH值普遍偏高[17].土壤電導(dǎo)率是測定土壤水溶性鹽的指標(biāo),而所測電導(dǎo)率普遍較低,與pH值相關(guān)性不高,說明不溶性鹽的存在導(dǎo)致電導(dǎo)率較低,并不是堿性環(huán)境的原因.氧化還原電位可以影響土壤中重金屬的形態(tài)和化合價等,從而影響其活性和毒性.樣品的氧化還原電位變化不大,與 pH值有著極顯著的負(fù)相關(guān)性(P<0.01),在此情況下,重金屬既不能形成難溶的硫化物(Eh<8mV),又不能以氧化難溶物的形式沉積[18],有可能導(dǎo)致重金屬毒性增強(qiáng).樣品的 CEC均值為452mmol/kg,比耕土的68mmol/kg高很多,可能由于尾礦庫內(nèi)樣品粒度較細(xì)、黏粒含量較多有關(guān)[19].樣品與耕地土的有機(jī)質(zhì)相差不大,均較低,不適合作物生長[20].

而重金屬 Cu、Zn的含量均超過了GB15618-1995一級標(biāo)準(zhǔn)[21],結(jié)合內(nèi)梅羅污染指數(shù)分析[22]得出所有樣品均屬于重度污染.由表 3得出ω(Zn)與OM成極顯著正相關(guān)(P<0.01),可以推測Zn與有機(jī)質(zhì)的絡(luò)合能力強(qiáng)于Cu且對有機(jī)質(zhì)的地球化學(xué)過程有重要影響[23].

表2 尾礦樣品基本理化性質(zhì)及重金屬含量(含耕地樣品)(n=13)Table 2 Physico-chemical characteristics and mental content of soil samples (n=13)

表3 重金屬含量與理化性質(zhì)的相關(guān)性系數(shù)Table 3 The relationship between soil characterisitics and total metal content

2.2 土壤細(xì)菌群落DGGE圖譜分析

由圖1可見,14個樣品基因組總DNA的16S rRNA-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物全部擴(kuò)增出來且位置正確、亮度明顯,大小在250bp左右,片段大小符合下一步實驗需求.

DGGE圖譜中不同位置的條帶代表不同的微生物類群,不同泳道同一位置條帶的明暗程度(光密度值大小)則反映該菌群在不同環(huán)境樣品中的相對豐度[24].電泳條帶越多說明生物多樣性豐富,條帶信號越強(qiáng),表明該種屬數(shù)量越多,從而確定不同樣品中所含的微生物的種類和數(shù)量關(guān)系,得出其中微生物多樣性的信息[25].由圖2可見,樣品中的條帶數(shù)目整體都較少(最多只有15條),相似性較高(與樣品1最低相似度53.7%),不同條帶的亮度在不同樣品間有差異,有些條帶較亮,有些條帶較模糊,但差異主要表現(xiàn)在較弱的條帶上,表明優(yōu)勢菌種相對穩(wěn)定,但較弱的條帶代表的細(xì)菌類群存在較大差異.根據(jù)圖譜中條帶數(shù)目以及強(qiáng)度(軟件中計算峰面積值來表示)進(jìn)一步對樣品進(jìn)行 UPGMA(unweighted pair～group method with arithmetic means,非加權(quán)組算術(shù)平均數(shù))聚類分析,結(jié)果如圖 3.從中發(fā)現(xiàn)大部分同一剖面的樣品聚在一起,1#、2#、3#樣品相似度達(dá)到67%,4#和5#相似度達(dá)到74%.只有12#和14#聚在一起且與其他樣品相似度較低,可能原因是植物的生長改善了土壤本身的一些細(xì)菌群落結(jié)構(gòu),而廢棄的尾礦庫表層的 12#土壤樣品則是在氣候與時間的綜合作用下跟周邊土壤達(dá)到相似的生物性,但其與尾礦庫內(nèi)部的其他樣品相似度還是達(dá)到了45%,從側(cè)面說明了污染仍是較為嚴(yán)重.

圖1 細(xì)菌PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳圖譜Fig.1 PCR detection of bacterial 16SrRNA based on ethidium bromide～stained gel

圖2 樣品細(xì)菌DGGE圖譜及泳道對比Fig.2 DGGE fingerprint and lane comparison of sample bacteria

圖3 基于DGGE的細(xì)菌群落聚類分析Fig.3 The cluster analysis of bacterial community based on DGGE

2.3 群落結(jié)構(gòu)與理化因子及重金屬的 RDA分析

表4 冗余分析結(jié)果Table 4 Main variance composition of the first four significant axes as revealed by RDA

圖4 土壤細(xì)菌群落樣品～環(huán)境RDA分析Fig.4 Redundancy discrimination analysis relating environmental variables to community structure of bacteria

采用線性回歸的冗余分析(RDA)對引起微生物群落結(jié)構(gòu)變化的因素進(jìn)行分析,結(jié)果見表4.RDA是一種直接梯度分析方法,能從統(tǒng)計學(xué)的角度來評價一個或一組變量與另一組多變量數(shù)據(jù)之間的相互關(guān)系[26].將細(xì)菌的種屬作為解釋變量,將理化因子及重金屬含量作為 RDA分析中的響應(yīng)變量,通過進(jìn)一步選擇(forward selection)和蒙特卡羅檢驗(Monte Carlo permutation test)(P<0.05,n = 999)得到解釋細(xì)菌群落變化的顯著變量[27].由表4中可見,第1排序軸解釋了影響土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)因素的 25.2%,第2排序軸解釋了14.2%,而前4排序軸中共解釋了54.0%的影響因素.這說明本研究中所測得 pH、ω(OM)等理化因子及ω(Cu)、ω(Zn)是影響土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的重要因素,但是還存在其他可能對細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)產(chǎn)生較大影響的因素尚待考察[28].

圖4為土壤細(xì)菌群落樣品～環(huán)境RDA排序.環(huán)境因子的矢量線的長短表示樣點或種群與該過程因子相關(guān)系數(shù)的大小,從箭頭的連線長度可以看出,選取的環(huán)境因子對細(xì)菌種群的梯度分布有著不同程度的影響[29].從圖4中可以看出,重金屬銅和鋅的量對細(xì)菌群落有顯著影響.銅對大部分物種都是抑制作用,少量鋅對某些物種反而有促進(jìn)作用.一些理化因子pH值、有機(jī)質(zhì)、陽離子交換量等對物種分布無顯著關(guān)系.

2.4 多樣性指數(shù)分析

表5 基于DGGE的細(xì)菌種群結(jié)構(gòu)多樣性分析Table 5 The Diversity analysis of bacteria communities based on DGGE

DGGE指紋圖譜中的1個條帶被稱作1個操作分類單元(OTU),根據(jù)DGGE圖譜中OTU的數(shù)量、種類及豐度,分別計算每個樣品的土壤細(xì)菌多樣性指數(shù),結(jié)果見表 5.物種多樣性是指群落中物種數(shù)目的多少,它是衡量群落規(guī)模和重要性的基礎(chǔ)[30].一般來說種類越多, 各種個體數(shù)量分布越均勻,物種多樣性指數(shù)越大[31].從表5中可看出,所取樣品的剖面深度與種群多樣性并無直接關(guān)系,例如 2#樣品的多樣性比更表層的 1#更豐富.圖 5揭示了銅和鋅對多樣性指數(shù)都起到了抑制作用.而對于同一樣品,不管從多樣性指數(shù)或豐富度指數(shù),還是優(yōu)勢度指數(shù)都具有較好的一致性,不過 3個主成分因子卻把均勻度指數(shù)區(qū)分開來,證明還存在影響多樣性指數(shù)的其他因素.

圖5 重金屬含量與細(xì)菌多樣性的主成分分析Fig.5 PCA of the heavy mental contents and bacteria community

3 結(jié)論

3.1 對銅尾礦庫所采各個樣品的理化性質(zhì)及重金屬Cu、Zn含量進(jìn)行測試分析,結(jié)果表明,重金屬含量遠(yuǎn)遠(yuǎn)超標(biāo)(Cu平均值為3989mg/kg, Zn平均值為 885mg/kg)并影響了樣品的理化性質(zhì)(Cu與pH和Eh、Zn與CEC和OM都呈顯著相關(guān)性)導(dǎo)致其并不適于作物生長.

3.2 圖譜結(jié)果表明土壤細(xì)菌的多樣性較低,與樣品所取深度并無直接關(guān)系.銅和鋅對群落多樣性有抑制作用.而在尾礦庫這個大環(huán)境的長期作用下各個樣品之間的種群相似性較高(相似度在45%以上),存在的大部分菌群是對重金屬銅和鋅具有抗性的菌群,一些對污染敏感的菌類相對較少.長有作物的耕土樣品與尾礦庫的樣品多樣性相差不多均較低,說明土壤根本上已受到污染.

3.3 冗余度分析證明了影響細(xì)菌群落的理化因素還有很多并不是簡單的只有本研究所測的因子;Cu和Zn對于細(xì)菌群落的影響作用不完全相同,Cu的抑制作用較明顯,而 Zn體現(xiàn)了兩面性,一方面促進(jìn)了群落結(jié)構(gòu)多樣性的豐富,另一方面又抑制了種群的分布,并不是簡單的實驗室研究的線性關(guān)系.

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LIN Hai*, CUI Xuan,

DONG Ying-bo, ZHANG Guo-hua, LI Xiao-qing, JI Zhen (School of Civil and Environmental Engineering, University of Science and Technology Beijing, Beijing 100083, China). China Environmental Science, 2014,34(12)：3182～3188

To examine the spatial changes of bacterial community in a copper mine tailing of Hubei, 14soil samples were collected, including 12 tailing samples and 3 compared samples (one from cultivated land ,two from another small copper mine tailing). DGGE (denaturing gradient gel electrophoresis) was employed to analyze V3～V6variable regions of bacterial 16S rRNA. Pearson correlation analysis and redundancy analysis (RDA) between bacterial community data and physicochemical parameters were carried out respectively to reveal relationships of the bacterial community structure, physical and chemical factors of the total samples, and contents of Cu, Zn. The results showed serious copper and zinc pollution, and there were significant differences for contents of Cu, Zn correlated with different physico～chemical characteristics of tailing samples, notably the significant position correlation [R=0.668(P<0.01)] between the content of Zn and organic matter. According to analysis of gene separated by DGGE the bacterial structures were different between samples. Overall, there was certain rule in the samples that low bacterial diversity, high similarity (the lowest similarity 53.1%) and relatively stable dominant bacteria. RDA demonstrated that the content of Cu, Zn influenced on bacteria community, Cu can inhibit microbial population, so can Zn, but in a certain concentration range, Zn may contribute to the development of microbial diversity, that is not laboratory studied simply linear relationship with their concentrations.

copper mine tailing；bacterial community；Cu；Zn；DGGE我國是有色金屬礦產(chǎn)資源大國,由于大部分礦產(chǎn)資源品位較低,導(dǎo)致開采過程中產(chǎn)生大量尾礦,一般占入選礦石的 70%～95%.這些尾礦利用率極低,大部分長期存放于尾礦庫中[1].而尾礦庫是一個物理、化學(xué)以及生物條件復(fù)雜多變的場所,

X171.5

A

1000-6923(2014)12-3182-07

林 海(1966-),男,四川儀隴人,教授,博士,主要從事礦山環(huán)境保護(hù)、礦物環(huán)境材料和水處理技術(shù)研究.發(fā)表論文80余篇.

2014-03-25

國家自然科學(xué)基金資助項目(51204011);北京市優(yōu)秀博士學(xué)位論文指導(dǎo)教師科技項目(20121000803)

* 責(zé)任作者, 教授, linhai@ces.ustb.edu.cn