吳等等,宋志文,王 琳,徐愛玲,夏 巖 (青島理工大學(xué)環(huán)境與市政工程學(xué)院,山東 青島 266033)

人工濕地污水處理系統(tǒng)春季空氣微生物群落結(jié)構(gòu)分析

吳等等,宋志文*,王 琳,徐愛玲,夏 巖 (青島理工大學(xué)環(huán)境與市政工程學(xué)院,山東 青島 266033)

通過構(gòu)建16S/18S rDNA基因文庫,分析自由表面流人工濕地污水處理系統(tǒng)春季空氣細(xì)菌和空氣真菌群落結(jié)構(gòu)特征.結(jié)果表明,空氣細(xì)菌分布在變形菌門(Proteobacteria)、放線菌門(Actinobacteria)、浮霉菌門(Planctomycetes)、藍(lán)藻門(Cyanophyta)、綠彎菌門(Chloroflexi)、擬桿菌門(Bacteroidetes)和厚壁菌門(Firmicutes),主要為β-變形菌綱(71.04%)、γ-變形菌綱(12.03%)、α-變形菌綱(3.83%)、藍(lán)藻綱(4.38%)、芽孢桿菌綱(3.28%)和鞘脂桿菌綱(2.19%),優(yōu)勢菌屬是馬賽菌屬(Massilia 66.66%)、假單胞菌屬(Pseudomonas 4.37%)、藍(lán)絲細(xì)菌屬(Cyanothece 3.83%)和沙雷氏菌屬(Serratia 3.28%).空氣真菌主要類群為座囊菌綱(Dothideomycetes 61.18%),其次是接合菌綱(Zygomycetes 16.47%)、盤菌綱(Discomycetes 14.12%),優(yōu)勢菌屬是核腔菌屬(Pyrenophora 48.31%)、被孢霉屬(Mortierella 15.7%)、緣刺盤菌屬(Cheilymenia 12.4%)、Boothiomyces (4.5%).人工濕地空氣微生物中未檢測出大腸桿菌(Escherichia coli)、沙門氏菌(Salmonella spp.)和產(chǎn)氣莢膜梭菌(Clostridium perfringens),但存在粘質(zhì)沙雷氏菌(S. marcescens)、惡臭假單胞菌(P. putida)、表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermidis)等致病菌或條件致病菌.

人工濕地；空氣細(xì)菌；空氣真菌；群落結(jié)構(gòu)；基因文庫

生活污水中含有沙門氏菌(Salmonella spp.)、志賀氏菌(Shigella spp.)、霍亂弧菌(Vibrio cholerae)和腸道病毒等多種病原微生物,其處理過程中由于污水流動(dòng)、溢流跌落、攪拌或曝氣產(chǎn)生的微生物氣溶膠增加了污水處理廠工作人員及周邊人群的健康風(fēng)險(xiǎn)[1].對污水處理廠工作人員和周邊人群健康狀態(tài)研究顯示,呼吸道疾病、腸道疾病、污水源病毒感染等疾病與微生物氣溶膠密切相關(guān).

人工濕地具有凈化污染物效果好、運(yùn)行費(fèi)用低、易維護(hù)等優(yōu)點(diǎn),在污水處理、污染物控制和改善環(huán)境等方面應(yīng)用廣泛[2].與傳統(tǒng)的二級污水處理工藝相比,人工濕地微生物氣溶膠對公眾健康和生態(tài)安全的影響更應(yīng)該引起足夠重視[3],主要表現(xiàn)在:(1)隨著城市化進(jìn)程加快,原來遠(yuǎn)離城區(qū)的人工濕地距離商業(yè)居住區(qū)越來越近,隨之也帶來環(huán)境衛(wèi)生安全問題.(2)與傳統(tǒng)污水處理工藝的嚴(yán)格封閉式管理不同,人工濕地是相對開放的生態(tài)系統(tǒng),部分人工濕地還作為旅游景點(diǎn),接待游客.(3)在污水處理中,人工濕地通常作為二級或三級處理工藝,研究發(fā)現(xiàn),即使作為三級污水處理工藝,人工濕地中仍可檢測出一定數(shù)量的沙門氏菌和產(chǎn)氣莢膜梭菌(Clostridium perfringens)[4].(4)人工濕地基質(zhì)是污水中病原微生物的匯,在特殊情況下,人工濕地有可能成為周圍環(huán)境病原微生物的源,并以微生物氣溶膠形式傳播[5].(5)研究表明,自由表面流人工濕地細(xì)菌氣溶膠和真菌氣溶膠易進(jìn)入肺部的細(xì)菌和真菌氣溶膠(0.65～4.7μm)顆粒數(shù)分別占總數(shù)的22.2%～62.3%和54.2%～87.6%[6]. (6)除生活污水外,人工濕地內(nèi)恒溫動(dòng)物和鳥類糞便也可能成為病原微生物的源,并且存在季節(jié)性變化,有較大的不確定性.(7)人工濕地植物葉片可以成為真菌孢子棲息和繁殖場所,使得人工濕地既是真菌孢子的匯也是周邊環(huán)境的源[7].

目前,國內(nèi)外一些學(xué)者已在污水處理系統(tǒng)空氣微生物檢測、曝氣系統(tǒng)對微生物氣溶膠影響、不同處理單元微生物氣溶膠濃度變化、工藝改造對微生物氣溶膠的影響、微生物氣溶膠季節(jié)變化及控制措施等領(lǐng)域開展了一些工作[8-17].這些研究大多采用傳統(tǒng)微生物培養(yǎng)方法,由于“可培養(yǎng)類”僅占空氣微生物總數(shù)的不到1%[18-19],并且還有部分微生物處于活的不可培養(yǎng)狀態(tài),同時(shí)培養(yǎng)結(jié)果受培養(yǎng)基組分影響較大,導(dǎo)致測得的數(shù)據(jù)與實(shí)際情況有較大偏差.相對于純培養(yǎng)法,分子生態(tài)學(xué)手段能夠克服上述缺陷[20],但目前尚未見到利用分子生態(tài)學(xué)手段研究人工濕地空氣微生物群落結(jié)構(gòu)的報(bào)道.

本研究以自由表面流人工濕地污水處理系統(tǒng)為研究對象,通過構(gòu)建 16S/18S rDNA基因文庫,對春季空氣細(xì)菌和空氣真菌群落結(jié)構(gòu)組成和系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)行分析,確定優(yōu)勢菌群,明確其中致病菌及條件致病菌種類,以期為其環(huán)境衛(wèi)生評價(jià)提供參考.

1 材料與方法

1.1 研究地點(diǎn)概況

人工濕地污水處理系統(tǒng)位于山東省青島市,東面和南面臨黃海,西面為人工濕地進(jìn)水前的倒置A2O預(yù)處理區(qū),北面為住宅區(qū).人工濕地為自由表面流蘆葦濕地,由99個(gè)并聯(lián)運(yùn)行濕地單元組成,每個(gè)單元大小為140m×32m,總占地面積76.7ha,處理規(guī)模 3×104m3/d,污水來源為生活污水和工業(yè)廢水(約1:1).

1.2 空氣樣品采集

采樣時(shí)間為2013年5月,采用KC-6120空氣綜合采樣器采集空氣微生物,空氣流量100L/min,采樣時(shí)間持續(xù) 3d.采樣結(jié)束后取下濾膜,用滅菌生理鹽水沖洗濾膜,使沉積微生物粒子溶于其中,然后12000r/min離心20min,濃縮微生物粒子于2mL離心管,作為實(shí)驗(yàn)樣品備用.

1.3 DNA提取

用DNA提取試劑盒(OMEGA)提取上述樣品中環(huán)境總DNA,操作過程參照DNA提取試劑盒說明書.DNA濃度和純度通過Nanodro檢測.

1.4 16S/18S rDNA序列PCR擴(kuò)增

采用細(xì)菌通用引物 27f/1500R[21](上游: 5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3';下游:5'-AGAAAGGAGGTGATCCAGCC-3');真菌通用引 物 EF4f/EF3r[22](上 游 :5’-GGAAGGGGT GTATTTATTAG-3’;下游:5’-TCCTCTAAATGACCAGTTTG-3’)擴(kuò)增空氣微生物16S/18S rDNA片段.PCR 反應(yīng)體系:ddH2O19μL,上游引物(5μmol/L)2μL,下游引物(5μmol/L)2μL,DNA樣品2μL,Master mix 25μL,總體積50μL;PCR反應(yīng)程序:94℃預(yù)變性 5min,94℃變性 45s,58.5退火45s,72℃延伸 90s,共 36個(gè)循環(huán);72℃延伸10min;4℃保存.PCR產(chǎn)物用經(jīng)EB染色的1%瓊脂糖凝膠電泳檢測.

1.5 16S/18S rDNA克隆文庫構(gòu)建

用瓊脂糖凝膠回收純化試劑盒(OMEGA)對PCR產(chǎn)物進(jìn)行回收純化,將純化后的DNA片段通過T4連接酶克隆試劑盒(MBI Fermentas)連接在載體上,轉(zhuǎn)化到感受態(tài)大腸桿菌(Top10)細(xì)胞中,涂布到含有氨芐青霉素、IPTG和 X-Gal的LB(Luria-Bertani)培養(yǎng)基上,37℃培養(yǎng) 16h.隨機(jī)選取一定數(shù)量白色克隆子,采用菌體直接擴(kuò)增方式,用pTZ57R/T Vector通用引物M13/PUCR和M13/PUCF擴(kuò)增外源插入片段,重新獲得16S/18S rDNA片段.菌落PCR擴(kuò)增程序:94℃預(yù)變性5min;94℃變性45s,55℃退火45s,72℃延伸1.5min,共36個(gè)循環(huán);72℃延伸10min;4℃保存.通過含有EB的1%瓊脂糖凝膠電泳篩選含有插入片段的克隆子,完成克隆文庫構(gòu)建.

1.6 RFLP分析

用限制性核酸內(nèi)切酶HhaI(Thermo, FD1854)消化從各克隆子擴(kuò)增的16S rDNA片段,用限制性核酸內(nèi)切酶 RsaI(Thermo, FD1123)消化 18S rDNA片段.酶切反應(yīng)體系:ddH2O5.25μL、10×酶切緩沖液 1μL、PCR產(chǎn)物 3.5μL、HhaI(RsaI) 0.25μL.酶切反應(yīng)條件:37℃ 20min,80℃ 5min,4℃保存.用含有EB染色的3%瓊脂糖凝膠分離酶切片段,200V下電泳 2.5h,用凝膠成像儀拍照,并對瓊脂糖凝膠電泳圖譜進(jìn)行分析,將每個(gè)酶切分型結(jié)果作為一個(gè)OUT (operational taxonomic unit).

1.7 多樣性指數(shù)分析

表1 克隆文庫多樣性指數(shù)與覆蓋度計(jì)算方法Table 1 The Formulae for the analysis of genotypic diversity and community coverage

采用覆蓋度(Coverage Value, C)、香農(nóng)多樣性指數(shù)(Shannon Diversity Index, H’)、辛普森指數(shù) (Simpson Index, D)、 豐 富 度 (Species Richness)、均勻度(Species evenness, E)對16S/18S rDNA克隆文庫進(jìn)行微生物多樣性分析.計(jì)算方法[23]見表1.

1.8 測序及文庫分析

根據(jù)酶切分型結(jié)果,從每個(gè)OTU中選取一個(gè)克隆子對其插入片段測序.測序委托生工生物工程(上海)股份有限公司完成.測序結(jié)果在NCBI中利用 BLAST程序(http://www.ncbi. nlm.nih. gov/BLAST/)查找相似序列,分析和鑒定克隆文庫細(xì)菌、真菌群落結(jié)構(gòu)組成,并采用MEGA5.0軟件進(jìn)行細(xì)菌、真菌系統(tǒng)發(fā)育分析(建樹模型為kimura 2-parameter, bootstrap值為1000).

2 結(jié)果與分析

2.1 克隆文庫構(gòu)建和RFLP分析

人工濕地空氣微生物16S/18S rDNA PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳圖譜如圖 1所示.擴(kuò)增片段長度均在1500bp左右,電泳條帶均一、信號較強(qiáng),能夠滿足PCR產(chǎn)物膠回收純化要求.

人工濕地空氣微生物16S/18S rDNA克隆文庫部分菌落PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳圖譜如圖2所示, PCR片段長度分別為1600bp、1700bp,大部分電泳條帶均一且信號較強(qiáng),但有少部分菌落 PCR產(chǎn)物電泳條帶信號較弱且不均一,同時(shí)也存在一些假陽性克隆.因此,根據(jù)菌落 PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳圖譜,挑選信號較強(qiáng)且均一性好的電泳條帶對應(yīng)的克隆子,完成克隆文庫構(gòu)建.

人工濕地空氣微生物16S/18S rDNA基因文庫部分菌落PCR產(chǎn)物酶切產(chǎn)物電泳圖譜如圖3所示.電泳條帶較豐富,且位置差異性較大,能夠達(dá)到區(qū)分空氣不同類型細(xì)菌/真菌的目的.酶切分型結(jié)果表明,人工濕地空氣細(xì)菌16S rDNA克隆文庫包括190個(gè)克隆子,被分為54個(gè)OTUs;空氣真菌18S rDNA克隆文庫包括89個(gè)克隆子,被分為14個(gè)OTUs.

圖1 16S/18S rDNA PCR產(chǎn)物電泳圖譜Fig.1 Agarose gel electrophoresis of 16S/18S rDNA gene of bacteria and fungi

圖2 16S/18S rDNA克隆文庫部分菌落PCR產(chǎn)物電泳圖譜Fig.2 Agarose gel electrophoresis of PCR products of 16S/18S rDNA clone libraries

圖3 16S/18S rDNA克隆文庫部分菌落PCR產(chǎn)物酶切電泳圖譜Fig.3 Partial restriction fragment length profiles of 16S/18S rDNA fragments: The 16S/18S rDNA amplifer was digested with restriction endonucleases and analyzed by agarose gel electrophoresis

2.2 微生物群落結(jié)構(gòu)和系統(tǒng)發(fā)育分析

克隆文庫能夠反映研究區(qū)域微生物群落結(jié)構(gòu)和種群多樣性,但由于方法本身局限性,其并不能包含實(shí)際環(huán)境中所有微生物類群,為了明確構(gòu)建的克隆文庫是否可以準(zhǔn)確反映實(shí)際環(huán)境微生物群落結(jié)構(gòu)組成和種群多樣性,需要計(jì)算克隆文庫各種多樣性參數(shù).其中,覆蓋度(C)表示克隆文庫所包含微生物種類占樣品全部微生物種類的比例,其數(shù)值越大,表明所構(gòu)建的克隆文庫越能真實(shí)的反映該樣品中微生物多樣性特征;香農(nóng)多樣性指數(shù)(H’)、辛普森指數(shù)(D)、豐富度和均勻度(E)等均能從不同側(cè)面反映克隆文庫微生物多樣性.表2是人工濕地克隆文庫多樣性參數(shù),可以看出,細(xì)菌16S rDNA克隆文庫包括190個(gè)克隆子,覆蓋率85.3%,真菌18S rDNA克隆文庫包括89個(gè)克隆子,覆蓋率 91.0%,克隆文庫包含了大部分空氣細(xì)菌和真菌類群,能夠代表環(huán)境樣品微生物多樣性16S rDNA克隆文庫Shannon指數(shù)、豐富度指數(shù)和均勻度指數(shù)均大于 18S rDNA,說明人工濕地空氣細(xì)菌多樣性高于真菌,且個(gè)體分配均勻性也較高.

根據(jù)人工濕地空氣微生物 16S/18S rDNA克隆文庫分析結(jié)果(表 3和表 4),構(gòu)建空氣細(xì)菌、空氣真菌系統(tǒng)發(fā)育樹(圖4和圖5).人工濕地春季空氣細(xì)菌16S rDNA克隆文庫中與已公布的模式菌株有著 81%～99%的相似性,其中, 72.1%克隆子序列能在 NCBI中找到相似度大于 97%的菌株. 18S rDNA克隆文庫中與已公布的模式菌株有著 91%～99%的相似性,74.2%克隆子序列能在NCBI中找到相似度大于97%的菌株.

表2 克隆文庫微生物多樣性及覆蓋度Table 2 Diversity index and coverage in 16S/18S rDNA clone library

表3 人工濕地16S rDNA克隆文庫分析結(jié)果Table 3 Inventory of bacterial 16S rDNA cloned fragments in constructed wetlands, arranged in groups according to their sequence similarities

續(xù)表3

表4 人工濕地18S rDNA克隆文庫分析結(jié)果Table 4 Inventory of fungal 18S rDNA cloned fragments in constructed wetlands, arranged in groups according to their sequence similarities

人工濕地空氣細(xì)菌群落具有較高的生物多樣性,分布在 7 個(gè)門,包括變形菌門(Proteobacteria)、放線菌門(Actinobacteria)、浮霉菌門(Planctomycetes)、藍(lán)藻門(Cyanophyta)、綠彎菌門(Chloroflexi)、擬桿菌門(Bacteroidetes)和厚壁菌門(Firmicutes).其中大部分屬變形菌門中的β-變形菌綱(71.04%)、γ-變形菌綱(12.03%)和α-變形菌綱(3.83%),藍(lán)藻門中的藍(lán)藻綱(4.38%),厚壁菌門中的芽孢桿菌綱(3.28%),擬桿菌門中的鞘脂桿菌綱(2.19%).此外,還有少量屬浮霉菌門中的浮霉菌綱(1.10%)、變形菌門中的 ε-變形菌綱(0.55%)、放線菌門中的放線菌綱(0.55%)、厚壁菌門中的梭菌綱(0.55%)和綠彎菌門中的厭氧繩菌綱(0.55%)的細(xì)菌.

空氣真菌相似度最高的菌株分布在 5個(gè)類群中,座囊菌綱(Dothideomycetes61.18%)占絕對優(yōu)勢,其次是接合菌綱(Zygomycetes16.47%),盤菌綱(Discomycetes14.12%),壺菌綱(Chytridiomycetes5.89%)和糞殼菌綱(Sordariomycetes2.36%)相對較少.

3 討論

16S/18S rDNA克隆文庫法是微生物分子生態(tài)學(xué)中用來調(diào)查環(huán)境微生物組成的常用方法之一[24],突破了傳統(tǒng)微生物分離純化方法的局限性,能較全面揭示各種生態(tài)環(huán)境中微生物多樣性[25].為了客觀反映環(huán)境樣品微生物群落結(jié)構(gòu),構(gòu)建的克隆文庫應(yīng)包含環(huán)境樣品中所有微生物,即庫容值是100%.但Kemp等[26]分析比較文獻(xiàn)中225個(gè)來自多種環(huán)境的 16S rDNA組成,發(fā)現(xiàn)隨 16S rDNA克隆文庫庫容增大,檢測到的OTU數(shù)目總在增加,說明在實(shí)際克隆文庫構(gòu)建過程中,由于PCR反應(yīng)偏向性等因素影響,克隆文庫不能窮盡樣品中微生物種類和組成,覆蓋度不可能達(dá)到100%.本研究中空氣細(xì)菌和空氣真菌 16S/18S rDNA克隆文庫庫容值分別為85.3%和91.0%,說明構(gòu)建的克隆文庫包括樣品中大部分細(xì)菌和真菌種類,能夠較好的反映人工濕地空氣細(xì)菌和真菌群落結(jié)構(gòu).克隆子測序結(jié)果與 NCBI比對結(jié)果顯示,空氣細(xì)菌和空氣真菌中分別有 72.1%和74.2%克隆子序列能在NCBI中找到相似度大于97%的菌株.一般認(rèn)為,原核生物16S rDNA序列3%之內(nèi)的變異屬于種間變異[27],說明人工濕地空氣微生物中存在部分未被認(rèn)知的微生物種類.相對于傳統(tǒng)培養(yǎng)方法,構(gòu)建 16S/18S rDNA克隆文庫方法能夠獲得對空氣微生物群落結(jié)構(gòu)多樣性相對全面的認(rèn)識,為空氣中未知的微生物純化培養(yǎng)及功能研究奠定基礎(chǔ).

圖4 人工濕地空氣細(xì)菌系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.4 Phylogenetic tree based on 16S rDNA clones of airborne bacteria in constructed wetlands

人工濕地利用基質(zhì)、植物、微生物的物理、化學(xué)和生物三重協(xié)同作用凈化污水,其空氣微生物群落結(jié)構(gòu)與地理環(huán)境、社會(huì)環(huán)境及人類活動(dòng)密切相關(guān). 16S rDNA克隆文庫分析結(jié)果表明,β-變形菌綱和 γ-變形菌綱屬優(yōu)勢菌群,說明變形菌門細(xì)菌適合大氣環(huán)境生長,這與國內(nèi)外的研究一致[28-30].革蘭氏陰性菌明顯多于革蘭氏陽性菌,符合革蘭氏陰性菌可生活在低溫,甚至嗜冷環(huán)境以及對輻射有抗性的結(jié)論[31-32].從人工濕地空氣細(xì)菌菌屬組成上看,馬賽菌屬(Massilia 66.66%)占絕對優(yōu)勢,其次是假單胞菌屬(Pseudomonas 4.37%)、藍(lán)絲細(xì)菌屬(Cyanothece 3.83%)和沙雷氏菌屬(Serratia 3.28%). Massilia以易降解有機(jī)物質(zhì)為底物,屬于生長速度較快的富營養(yǎng)菌[33],當(dāng)環(huán)境中存在足夠碳源和能源時(shí),能夠以高增殖率繁殖,是許多植物土壤根際的優(yōu)勢菌群[34-45],從戈壁和沙漠表層沙[46]、土壤[47-49]、湖泊(水庫)沉積物[50-51]、垃圾填埋場氣溶膠[52-53]、飲用水[54]中也檢測到其存在,說明人工濕地基質(zhì)(土壤)是空氣微生物的重要源.假單胞菌在大氣中普遍存在,是寄生于植物的潛在病原菌,表明植被也是人工濕地空氣微生物的源[55].藍(lán)絲細(xì)菌屬對鹽度具有一定耐受性[56],可能來源于海洋環(huán)境.粘質(zhì)沙雷氏菌則廣泛分布于自然界,是水和土壤中的常居菌群.

圖5 人工濕地空氣真菌系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.5 Phylogenetic tree based on 18S rDNA clones of airborne fungi in constructed wetlands

人工濕地空氣微生物群落組成與傳統(tǒng)污水處理系統(tǒng)存在一定差異.劉建偉等[16]對北京某污水處理廠研究發(fā)現(xiàn),格柵間空氣中異養(yǎng)細(xì)菌種類相對較多,包括芽孢桿菌、大腸桿菌、假單胞菌、葡萄球菌和短桿菌,污泥濃縮池和污泥脫水池優(yōu)勢異養(yǎng)細(xì)菌主要是假單胞菌、大腸桿菌和芽孢桿菌,且在不同時(shí)間內(nèi)在各采樣點(diǎn)所取的樣品中,假單胞菌一直保持優(yōu)勢地位;余貴英等[17]對污水處理廠反應(yīng)池、污泥濃縮池、廠前區(qū)等功能區(qū)微生物氣溶膠研究表明,空氣中主要為大腸桿菌、綠色鏈球菌、枯草芽孢桿菌、不動(dòng)桿菌、變形桿菌和表皮葡萄球菌,污泥濃縮池主要為大腸桿菌.從本研究的分析結(jié)果看,在上述細(xì)菌類型中,除假單胞菌為人工濕地空氣細(xì)菌優(yōu)勢菌屬外,其他大部分種類雖然檢測到,但均不占優(yōu)勢,并且未檢測到大腸桿菌,只檢測到同屬的E.fergusonii.說明人工濕地與傳統(tǒng)二級污水處理系統(tǒng)中空氣微生物來源有較大差異,本研究地點(diǎn)位于海濱區(qū)域,空氣微生物構(gòu)成受到基質(zhì)、污水、植被、鳥類與恒溫動(dòng)物、海洋等諸多因素影響,其空氣微生物來源更為復(fù)雜.另外,不同研究方法也可能造成空氣微生物群落結(jié)構(gòu)差異.于淼等[6]采用傳統(tǒng)培養(yǎng)方法對自由表面流人工濕地微生物氣溶膠進(jìn)行研究,發(fā)現(xiàn)空氣真菌主要有酵母菌、鐮刀菌屬、枝孢屬、毛霉屬、交鏈孢屬、肉座菌屬、枝霉屬、青霉屬和曲霉屬,而本研究結(jié)果表明人工濕地空氣真菌優(yōu)勢菌屬為核腔菌屬、被孢霉屬、Boothiomyces和緣刺盤菌屬.

人工濕地空氣中存在部分致病菌或條件致病菌.其中,粘質(zhì)沙雷氏菌(S.marcescens)可引起泌尿系統(tǒng)、下呼吸道、傷口感染及菌血癥,機(jī)體抵抗力低下、免疫功能不全、慢性虛弱人群容易感染;表皮葡萄球菌(S.epidermidis)常引起人類呼吸道、傷口、泌尿生殖道、眼部等感染;惡臭假單胞菌(P. putida)是人類重要的臨床病源,已從敗血癥、化膿性中耳炎、角膜鞏膜炎和痢疾樣腹瀉患者標(biāo)本中分離出該菌;織片草螺菌(H. seropedicae)可導(dǎo)致菌血癥.水稻黃單胞菌水稻致病變種(Xanthomonas oryzae pv. oryzae)可以引起水稻白葉枯病,是世界水稻生產(chǎn)上重要的細(xì)菌病害之一[57].值得注意的是,盡管前期研究發(fā)現(xiàn)人工濕地污水中存在一定數(shù)量的沙門氏菌和產(chǎn)氣莢膜梭菌[4,58],從空氣樣品中并未檢測到其存在,為此今后擬采用高通量測序和實(shí)時(shí)熒光定量PCR等高靈敏度方法進(jìn)一步研究.

4 結(jié)論

4.1 人工濕地春季空氣細(xì)菌群落具有較高的多樣性,分布在7個(gè)門,其中β-變形菌綱和γ-變形菌綱屬優(yōu)勢菌群.優(yōu)勢菌屬為馬賽菌屬、假單胞菌屬、藍(lán)絲細(xì)菌屬和沙雷氏菌屬.空氣真菌中座囊菌綱占絕對優(yōu)勢,其次是接合菌綱和盤菌綱, 優(yōu)勢菌屬為核腔菌屬、被孢霉屬、Boothiomyces和緣刺盤菌屬.

4.2 人工濕地春季空氣微生物中未檢測出大腸桿菌、沙門氏菌和產(chǎn)氣莢膜梭菌,但存在粘質(zhì)沙雷氏菌、施氏假單胞菌、表皮葡萄球菌等致病菌或條件致病菌.

4.3 人工濕地空氣微生物中存在部分未被認(rèn)知的種類.采用構(gòu)建 16S/18S rDNA克隆文庫方法分析污水處理系統(tǒng)空氣微生物群落結(jié)構(gòu)特征,其結(jié)果與傳統(tǒng)微生物培養(yǎng)方法存在較大差異.

[1] Pillai S D, Ricke S C. Bioaerosols from municipal and animal wastes: background and contemporary issues [J]. Canadian Journal of Microbiology, 2002,48:681-696.

[2] Song Z W, Zheng Z P, Li J, et al. Seasonal and annual performance of a full-scale constructedwetland system for sewage treatment in China [J]. Ecological Engineering, 2006,26: 272—282

[3] 徐 敏,宋志文,楊 光,等.人工濕地與環(huán)境衛(wèi)生安全 [J]. 生態(tài)學(xué)雜志, 2007,26(11):1873-1877.

[4] 孫 群,吳 蕾,夏文香,等.人工濕地中指示和病原微生物分布與衰減研究 [J]. 安全與環(huán)境學(xué)報(bào), 2009,9(5):63-66.

[5] Karim M R, Manshadi F D, Karpiscak M M. The persistence and removal of enteric pathogens in constructed wetlands [J]. Water Research, 2004,38:1831-1837.

[6] 于 淼,孫 群,宋志文,等.自由表面流人工濕地微生物氣溶膠研究 [J]. 環(huán)境污染與防治, 2010,32(2):8-12.

[7] Levetin E, Dorsey K. Contribution of leaf surface fungi to the air spora [J]. Aerobiologia, 2006,22(1):3-12.

[8] Patentalakis N, Pantidou A, Kalogerakis N. Determination of enterobacteria in air and wastewater samples from a wastewater treatment plant by epi-fluorescence microscopy [J]. Water, Air and Soil Pollution, 2008,8:107-115.

[9] Korzeniewska E, Filipkowska Z, Gotkowska-plachta A, et al. Determination of emitted airborne microorganisms from a BIOPAK wastewater treatment plant [J]. Water Research, 2009,43: 2841-2851.

[10] Heinonen-Tanski H, Reponen T, Koivunen J. Airborne enteric coliphages and bacteria in sewage treatment plants [J]. Water Research, 2009,43:2558-2566.

[11] Sanchez-Monedero M A, Aguilar M I, Fenoll R, et al. Effect of the aeration system on the levels of airborne microorganisms generated at wastewater treatment plants [J]. Water Research, 2008,42:3739-3744.

[12] Karra S, Katsivela E. microorganisms in bioaerosol emissions from wastewater treatment plants during summer at a Mediterranean site [J]. Water Research, 2007,41:1355-1365.

[13] Hung H F, Kuo Y M, Chien C C, et al. Use of floating balls for reducing bacterial aerosol emissions from aeration in wastewater treatment processes [J]. Journal of Hazardous Materials, 2010, 175(1-3):866-871.

[14] Fernan N L, Fedorak P M. Changes at an activated sludge sewage treatment plant alter the umbers of airborne aerobic microorganisms [J]. Water Research, 2005,39:4597-4608.

[15] 吳萬寧,查 勇,王 強(qiáng),等.南京地區(qū)冬夏季大氣重污染個(gè)例對比分析 [J]. 中國環(huán)境科學(xué), 2014,34(3):581-587.

[16] 劉建偉,周競男,馬文林,等.北京某城市污水處理廠微生物氣溶膠污染特性研究 [J]. 環(huán)境污染與防治, 2013,35(6):1-4.

[17] 余貴英,趙振新,宋 宏,等.某污水處理廠微生物氣溶膠污染調(diào)查 [J]. 疾病控制雜志, 1999,3(1):1-4.

[18] Brock T. The study of microorganisms in situ: Progress and problems [J]. Symposium of the Society for General Microbiology, 1987,41:1-17.

[19] Amann R I, Ludwig W, Schleifer K H. Phylogenetic identification and in situ detection of individual microbial cells without cultivation [J]. Microbiology Reviews, 1995,59(1):143-169.

[20] Grif fi n D W, Kubilay N, Kodak M, et al. Airborne desert dust and aeromicrobiology over the Turkish Mediterranean coastline [J]. Atmospheric Environment, 2007,41(19):4050-4062.

[21] Spr?er C, Reichenbach H, Stackebrandt E. The correlation between morphogenetic classification of myxobacteria [J]. International Journal of Systematic Bacteriology, 1999,49:1255-1262.

[22] Smit E, Leeflang P, Glandorf B, et al. Analysis of fungal diversityin the wheat rhizosphere by sequencing of cloned PCR-amplified genes encoding 18S rRNA and temperature gradient gel electrophoresis [J]. Applied and Environmental Microbiology, 1999,65(6):2614-2621.

[23] 王 英,滕齊輝,崔中利,等.免耕水稻土壤中細(xì)菌多樣性及其空間分布的研究 [J]. 土壤學(xué)報(bào), 2007,44(1):137-143.

[24] Chen A, Imachi H, Sekiguchi Y, et al. Archaeal community compositions at different depths of a municipal solid waste landfill in Taiwan as revealed by 16S rDNA cloning analyses [J]. Biotechnology Letter, 2003,(25):719-724.

[25] Amann R I, Ludwig W, Schleifer K H. Phylogenetic identification and in situ detection of individual microbial cells without cultivation [J]. Microbial. Rev., 1995,59:143-169.

[26] Kemp P F, Aller J Y. Bacterial diversity in aquatic and other environments: what 16S rDNA libraries can tell us [J]. FEMS Microbiology Ecology, 2004,47:161-177.

[27] Stackebrandt E, Goebel B M. Taxonomic note: a place for DNA-DNA reassociation and 16S rRNA sequence analysis in the present species definition in bacteriology [J]. International Journal of Systematic and evolutionary Microbiology, 1994,44(4): 846-849.

[28] 梁宗敏,杜 睿,杜鵬瑞,等.北京大氣降水中細(xì)菌氣溶膠的多樣性研究 [J]. 中國環(huán)境科學(xué), 2014,34(2):317-323.

[29] Despres V R, Nowoisky J F, Klose M, et al. Characterization of primary biogenic aerosol particles in urban, rural, and high-alpine air by DNA sequence and restriction fragment analysis of ribosomal RNA genes [J]. Biogeosciences, 2007,4:1127-1141.

[30] Maron P A, Lejon D P H, Carvalho E, et al. Assessing genetic structure and diversity of airborne bacterial communities by DNA fingerprinting and 16S rDNA clone library [J]. Atmos. Environ., 2005,39:3687—3695.

[31] Amato P, Parazols M, Sancelme M, et al. Microorganisms isolated from the water phase of tropospheric clouds at the Puy de D?me: major groups and growth abilities at low temperatures [J]. FEMS Microbiol. Ecol., 2007,59:242—254.

[32] Christner B C, Mosley-Thompson E, Thompson L G, et al. Bacterial recovery from ancient glacial ice [J]. Environmental Microbiology, 2003,5:433-436.

[33] Li X, Rui J, Mao Y, et al. Dynamics of the bacterial community structure in the rhizosphere of a maize cultivar [J]. Soil Biology and Biochemistry, 2014,68:392-401.

[34] Ofek M, Hadar Y, Minz D. Ecology of root colonizing Massilia (Oxalo-bacteraceae) [J]. PLoS One, 2012,7:e40117.

[35] Hrynkiewicz K, Baum C, Leinweber P. Density, metabolic activity, and identity of cultivable rhizosphere bacteria on Saliχ viminalis in disturbed arable and landfill soils [J]. J. Plant Nutr. Soil Sci., 2010,173:747—756.

[36] Weinert N, Meincke R, Gottwald C, et al. Effects of genetically modified potatoes with increased zeaxanthin content on the abundance and diversity of rhizobacteria with in vitro antagonistic activity do not exceed natural variability among cultivars [J]. Plant Soil, 2010,326: 437—452.

[37] Brooks D D, Chan R, Starks E R, et al. Ectomycorrhizal hyphae structure components of the soil bacterial community for decreased phosphate production [J]. FEMS Microbiol. Ecol., 2011, 76:245-255.

[38] Gro¨nemeyer J L, Burbano C S, Hurek T, et al. Isolation and characterization of root-associated bacteria from agricultural crops in Kavango region of Namibia [J]. Plant Soil, 2012,356: 67-82.

[39] Pisa G, Magnani G S, Weber H, et al. Diversity of16S rRNA genes from bacteria of sugarcane rhizosphere soil [J]. Braz. J Med. BiolRes., 2011,44:1215—1221.

[40] Ulrich K, Ulrich A, Ewald D. Diversity of endophytic bacterial communities in poplar grown under field conditions [J]. FEMS Microbiol. Ecol., 2008,63:169—180.

[41] Kuffner M, De Maria S, Puschenreiter M, et al. Culturable bacteria from Zn- and Cd- accumulating Saliχ Caprea with differential effects on plant growth and heave metal availability [J]. J. Appl. Mibrobiol., 2010,108:1471—1484.

[42] Dohrmann A B, Tebbe C C. Effect of elevated tropospheric ozone on the structure of bacterial communities inhabiting the rhizosphere of herbaceous plants native to Germany [J]. Appl. Environ. Microbiol., 2005,71:7750—7758.

[43] Green S J, Michel F C, Hadar Y, et al. Contrasting patterns of seed and root colonization by bacteria from the genus Chrysobacterium and from the family Oxalobacteraceae [J]. ISME J., 2007,1:291—299.

[44] Abou-Shanab RAI, van Berkum P, Angel J S. Heavy metal resistance and genotypic analysis of metal resistance genes in Gram-positive and Gram-negative bacteria present in Ni-rich serpentine soil and in the rhizosphere of Alyssum murale [J]. Chemospehre, 2007,68:360—367.

[45] Abou-Shanab R A I, van Berkum P, Angle J S, et al. Characterization of Ni-resistant bacteria in the rhizosphere of the hyperaccumulator Alyssum murale by 16S rRNA gene sequence analysis [J]. World J. Microbiol. Biotechnol., 2010,26:101—108.

[46] An S, Coutea C, Luo F, et al. Bacterial Diversity of Surface Sand Samples from the Gobi and Taklamaken Deserts [J]. Microb. Ecol., 2013,66:850-860.

[47] Zhang W, Wang H, Zhang R, et al. Bacterial communities in PAH contaminated soils at an electronic-waste processing center in China [J]. Ecotoxicology, 2010,19:96-104.

[48] Ferrari B C, Binnerup S J, Gillings M. Microcolony cultivation ona soil substrate membrane system selects for previously uncultured soil bacteria [J]. Appl. Environ. Microbiol., 2005,71: 8714-8720.

[49] Nagy M L, Pe’rez A, Garcia-Pichel F. The prokaryotic diversity ofbiological soil crusts in the Sonoran Desert (Organ Pipe Cactus NationalMonument, AZ) [J]. FEMS Microbiol. Ecol., 2005,54: 233-245.

[50] Foti M J, Sorokin D Y, Zacharova E E, et al. Bacterial diversity and activity along a salinity gradient in soda lakes of the Kulunda Steppe (Altai, Russia) [J]. Extremophiles, 2008:12:133-145.

[51] Cheng W, Zhang J, Wang Z, et al. Bacterial communities in sediments of a drinking water reservoir [J]. Ann. Microbiol., 2014,64:875-878.

[52] Bru-Adan V, We′ry N, Moletta-Denat M, et al. Diversity of Bacteria and Fungi in Aerosols During Screening in a Green Waste Composting Plant [J]. Curr. Microbiol., 2009,59:326-335.

[53] Blatny J M, Ho J, Skogan G., et al. Airborne Legionella bacteria from pulp waste treatment plant: aerosol particles characterized as aggregates and their potential hazard [J]. Aerobiologia, 2011, 27:147-162.

[54] Gallego V, Sa′ nchez-Porro C, Garc′ a MT, et al. Massilia aurea sp.nov., isolated from drinking water [J]. Int. J. Syst. Evol. Microbiol., 2006,56:2449-2453.

[55] Fahlgren C, Bratbak G, Sandaa R A, et al. Diversity of airborne bacteria in samples collected using different devices for aerosol collection [J]. Aerobiologia, 2010,27:107-120.

[56] 陶天申,楊瑞馥,東秀珠.原核生物系統(tǒng)學(xué) [M]. 北京:化學(xué)工業(yè)出版社, 2007.

[57] 張 帆,周永力.白葉枯病菌(Xanthomonas oryzae pv. oryzae)與水稻抗病基因識別的分子機(jī)理[J].中國水稻科學(xué), 2013,27(3): 305-311.

[58] 宋志文,孫 群,徐愛玲,等.人工濕地中指示與病原微生物動(dòng)態(tài)分布及相關(guān)性分析 [J]. 生態(tài)學(xué)雜志, 2013,32(1):91-97.

致謝：本實(shí)驗(yàn)的現(xiàn)場采樣工作由藏云生工程師等協(xié)助完成,在此表示感謝.

Community structure of airborne microbes in spring in a constructed wetland system for sewage treatment.

WU Deng-deng, SONG Zhi-wen*, WANG Lin, XU Ai-ling, XIA Yan (College of Environmental and Municipal Engineering,Qingdao Technological University, Qingdao 266033, China). China Environmental Science, 2014,34(12)：3164～3174

constructed wetland；airborne bacteria；airborne fungi；community structure；genomic library

X172

A

1000-6923(2014)12-3164-11

吳等等(1988-),女,甘肅省慶陽人,青島理工大學(xué)碩士研究生,主要從事環(huán)境微生物方面研究.發(fā)表論文5篇.

2014-03-20

國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(31170509)

* 責(zé)任作者, 教授, songzhiwen@qtech.edu.cn