陳德志，陳巧輝，陳翠萌，王佳坤，甘惠貞

（中國人民解放軍第180醫(yī)院藥學(xué)科，福建 泉州 362000）

咪達唑侖、硝西泮、地西泮等為治療癲癇病常用藥物，但此類藥物的“治療窗”較窄，低于治療窗則療效較差，高于治療窗則會出現(xiàn)不良反應(yīng)，甚至死亡[1]，故需制訂合理的給藥方案，使血藥濃度控制在有效范圍內(nèi)。對此，筆者試圖建立了一種能夠同時測定咪達唑侖(MID)、硝西泮(NZP)、地西泮(DZP)3種藥物血藥濃度的方法，現(xiàn)報道如下。

1 儀器與試藥

高效液相色譜儀（美國Waters公司，包括510泵、7725i進樣器、996二極管陣列檢測器）；Empower數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)；XW－80型旋渦混合器(上海醫(yī)科大學(xué)儀器廠)；TGL－16G型臺式高速離心機(上海醫(yī)用分析儀器廠)；80－2型離心機（上海手術(shù)器械廠）；AE－240型電子天平(梅特勒－托利多儀器有限公司)；pHS－3C型pH計(上海雷磁儀器廠)；TG－328B型電光天平（上海醫(yī)用激光儀器廠）；SYZ－550型石英亞沸高純水蒸餾器（江蘇丹陽門石英玻璃廠）；GM－0．15Ⅱ型津騰隔膜真空泵（天津市騰達過濾器件廠）。咪達唑侖對照品（批號171250－200401），硝西泮對照品（批號 1217－9201），地西泮對照品（批號 171225－200302）；供試品均由中國藥品生物制品檢定所提供；甲醇為色譜純，其他試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2．1 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗

色譜柱：Symmetry shield RP18柱（250 mm × 4．6 mm，5．0 μm）；流動相：甲醇 － 磷酸鹽緩沖液（55 ∶45，v／v，pH ＝2．15）；流速：0．9 mL ／min；檢測波長：230 nm；柱溫：26 ℃ 。在此色譜條件下 3 種藥物 MID，NZP，DZP能夠達到基線分離，其保留時間分別為3．782，13．555，22．405 min。

2．2 生物樣品處理

取待測血漿樣品0．5 mL，加入磷酸鹽緩沖液(pH 7．5)400 μL、乙酸乙酯 3 mL和石油醚 100 μL，渦旋振蕩提取 3 min，轉(zhuǎn)速4 000 r／min離心 5 min，吸取有機相 2．5 mL，置 55℃水浴氮氣流吹干，殘渣用 100 μL 甲醇 － 水(50 ∶50，v／v)溶解，渦旋振蕩 5 min，轉(zhuǎn)速 10 000 r／min離心 5 min，取上清液 20 μL進樣。

2．3 最佳樣品處理條件

采用正交試驗的方法，選擇緩沖液 pH（因素 A）、提取溶劑（因素 B）、渦旋時間（因素 C）、水浴溫度（因素 D）為考察因素，根據(jù) L9(34)正交試驗表，考察不同因素的不同水平對提取效率的影響，按2．2項下方法及表1進行操作分析。

表1 正交試驗因素水平表

由正交試驗數(shù)據(jù)得最佳樣品處理條件：水浴溫度為55℃；提取溶劑為乙酸乙酯＋石油醚；緩沖液pH為7．5；渦旋時間為5 min，見表 2。

2．4 方法學(xué)考察

標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制：精密稱取 MID，NZP，DZP 約 1．0 mg，用適量甲醇溶解并定容至 10 mL，得供試品標(biāo)準(zhǔn)貯備液，置4℃冰箱保存。取空白血漿數(shù)份，分別精密加入適量 MID，NZP，DZP標(biāo)準(zhǔn)貯備液，均配制成質(zhì)量濃度分別為 20，50，100，500，1 000，2 000，4 000 ng／mL的供試品溶液。模擬含藥血漿樣品，按 2．2項下方法操作分析。以 MID，NZP，DZP血藥濃度（X）對相應(yīng)峰面積（Y）進行線性回歸，得標(biāo)準(zhǔn)曲線方程分別為 YM＝125 XM＋3 070（r＝0．999 6），YN＝123 XN＋8 440（r＝0．999 9），YD＝255 XD＋15 400（r＝0．999 7）。結(jié)果表明，MID，NZP，DZP 質(zhì)量濃度的線性范圍均為 20～4 000 ng／mL。

表2 正交試驗結(jié)果

回收率試驗：取空白血漿數(shù)份，分別配制成50，500，4000 ng／mL的模擬含藥血漿樣品各5份，按2．2項下方法操作測定，結(jié)果見表3。

表3 回收率及精密度試驗結(jié)果（n＝5）

精密度試驗：取空白血漿數(shù)份，分別配制成50，500，4000 ng／mL的模擬含藥血漿樣品各5份，按2．2項下方法操作。將配制好的每組樣品混合后，1日內(nèi)不同時間進樣5次測定日內(nèi)差。然后5 d內(nèi)每天進樣1次，測定日間差。結(jié)果見表3。

2．5 最低檢測濃度

當(dāng)信噪比（S／N）＝3時，本法最低檢測質(zhì)量濃度 NZP，DZP為 10 ng／mL，MID 為 20 ng／mL。

3 討論

近年來采用高效液相色譜法(HPLC)測定相關(guān)藥物的含量應(yīng)用較為廣泛，但現(xiàn)有報道的研究多是對某一種藥物的測定[2－3]。也有采用梯度洗脫，或采用2種流動相分別洗脫[1]同時測定多種藥物的HPLC法，而本法只采用單種流動相同時測定多種藥物，更為簡單、快速。

提取溶劑的選擇：多采用有機溶劑萃取法。采用乙醚提取，其容易揮發(fā)，對人體有害；采用二氯甲烷[4]提取時，提取層在下層，不易吸取；采用乙酸乙酯提取效果好，萃取NZP，DZP效率分別為二氯甲烷的 1．63，1．02 倍，為乙醚的 1．1，1．5 倍，且毒性小，操作簡便，因而選擇乙酸乙酯作提取溶劑。在正交試驗中，乙酸乙酯加入石油醚后可降低蛋白質(zhì)等雜質(zhì)峰的影響，且不影響萃取效率，測定結(jié)果準(zhǔn)確。

萃取時渦旋時間的選擇：試驗中發(fā)現(xiàn)，渦旋時間太長容易導(dǎo)致乳化。本研究中選擇渦旋5 min，不易出現(xiàn)乳化現(xiàn)象，且縮短了樣品預(yù)處理時間，回收率也能滿足研究的要求。

流動相的選擇：文獻中流動相有甲醇－乙腈－正己烷、磷酸鹽緩沖液－乙腈等，乙腈價格昂貴，且毒性較大。預(yù)試驗表明，以甲醇 － 磷酸鹽緩沖液（55 ∶45，v／v，pH 2．15）為流動相，可達到較好的分離效果且所有組分保留時間均在23 min內(nèi)；但磷酸鹽緩沖液可能影響色譜柱的壽命，因此流動相有待改進。

檢測波長的選擇：本試驗在190～600 nm波長范圍內(nèi)在線掃描，通過參考相關(guān)文獻，比較了 220，230[5]，240[6]，254 nm[7－8]等波長，鑒于咪達唑侖較其他幾種藥物靈敏度相對偏低，而在230 nm波長處吸收值較大，且該波長下內(nèi)源性干擾小，有利于藥物濃度較低時的檢出，因此選擇230 nm作為檢測波長。

本試驗對每個藥物標(biāo)準(zhǔn)曲線濃度范圍都設(shè)計了較高的濃度，大大超過了治療范圍的上限，目的是當(dāng)遇到可能誤服或意外超大劑量用藥的患者，能夠即時作出準(zhǔn)確的檢測。

本研究方法可同時測定3種藥物的血藥濃度，操作簡便，為醫(yī)院常規(guī)監(jiān)測提供了有效手段。

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