薛朝金，陶 凱

（1．貴州省畢節(jié)市食品藥品檢驗(yàn)所，貴州 畢節(jié) 551700； 2．貴陽(yáng)中醫(yī)學(xué)院，貴州 貴陽(yáng) 550002）

胖血藤為蓼科植物毛血藤 Polygonum cynanchodiis Hemsl．的干燥根，別名有蕎麥蔓、毛血藤、云扣蓮、蕎葉細(xì)辛，廣泛分布于湖北、四川、貴州等省，生長(zhǎng)于河岸或山溝草叢中[1]。該藥材已收載于2003年版《貴州省中藥材、民族藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)》，具有斂肺止咳、行氣健胃、祛風(fēng)除濕的功效，主要用于肺癆咳嗽、痰中帶血、白日咳、胃脘脹悶疼痛、風(fēng)濕痹痛[2]。該質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)只規(guī)定了來(lái)源、性狀、性味歸經(jīng)、功能主治、用法用量及貯藏。該藥材為貴州省少數(shù)民族用藥，其分布廣、藥用價(jià)值高，目前未發(fā)現(xiàn)有對(duì)胖血藤含量測(cè)定方法研究的報(bào)道。為保證藥材質(zhì)量和療效，筆者建立了其含量測(cè)定方法，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 儀器與試藥

高效液相色譜儀（Waters 1525二元高壓梯度泵，2487 Dual λ absorbance Detector，柱溫箱，Breeze色譜工作站；島津 LC－20AD二元高壓梯度泵，SPD－M20D二級(jí)管陣列檢測(cè)器）；AB265－S型電子天平（瑞士 Mettle Toledo公司）。大黃素對(duì)照品（批號(hào)為110756－200110）、大黃素甲醚(批號(hào)為 110758－200610)，均購(gòu)自中國(guó)藥品生物制品檢定所；甲醇為色譜純（美國(guó)天地公司），水為自制超純水，其他試劑均為分析純。試驗(yàn)所用的3批胖血藤藥材經(jīng)畢節(jié)市食品藥品檢驗(yàn)所汪勛副教授鑒定為蓼科植物毛血藤Polygonum cynanchodiis Hemsl．的干燥根。

2 方法與結(jié)果

2．1 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

色譜柱：Diamonsil C18柱（250 mm ×4．6 mm，5 μm）；流動(dòng)相：甲醇 －0．1% 磷酸（80 ∶20）；流速：1．0 mL ／min；柱溫：30 ℃ ；檢測(cè)波長(zhǎng)：254 nm；進(jìn)樣量：20 μL。在此色譜條件下，大黃素、大黃素甲醚與其他組分分離度良好，色譜圖見(jiàn)圖1。

2．2 溶液制備

圖1 高效液相色譜圖

精密稱取大黃素對(duì)照品10 mg，加甲醇稀釋至25 mL，精密稱取大黃素甲醚對(duì)照品13 mg加甲醇稀釋至100 mL，即得對(duì)照品貯備液，備用。精密稱取樣品0．5 g，置具塞錐形瓶中，精密加甲醇50 mL，精密稱定質(zhì)量，于水浴上加熱回流 1 h，放冷，加甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，用0．45 μm的濾膜濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得供試品溶液。

2．3 方法學(xué)考察

線性關(guān)系考察：取對(duì)照品貯備液適量，分別制成含大黃素5，10，20，40，80 μg ／mL，含大黃素甲醚 1．562 5，3．125，6．25，9．375，12．5 μg ／mL 的混合溶液，精密吸取 20 μL，注入高效液相色譜儀，按擬訂色譜條件分別測(cè)定峰面積。以對(duì)照品進(jìn)樣量（X，μg）為橫坐標(biāo)、峰面積(Y)為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得大黃素回歸方程Y＝4×106X＋11 534(r＝0．999 9)，大黃素甲醚回歸方程 Y＝3×106X － 1 340．2(r＝0．999 7)。結(jié)果表明，大黃素、大黃素甲醚進(jìn)樣量分別在 0．100 0 ～1．600 0 μg和 0．031 25 ～0．250 0 μg范圍內(nèi)與峰面積呈良好線性關(guān)系。

精密度試驗(yàn)：精密吸取質(zhì)量濃度為20 μg／mL的大黃素和質(zhì)量濃度為6．25 μg／mL的大黃素甲醚混合對(duì)照品溶液，按擬訂色譜條件，連續(xù)進(jìn)樣6次測(cè)定峰面積。結(jié)果大黃素對(duì)照品峰面積的RSD為0．55%，大黃素甲醚對(duì)照品峰面積的 RSD為1．40%，表明儀器精密度良好。

重復(fù)性試驗(yàn)：取同一批次的胖血藤藥材6份，每份0．5 g，精密稱定，按2．2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按擬訂色譜條件測(cè)定。結(jié)果胖血藤中大黃素和大黃素甲醚的大黃素平均含量分別為0．24%和 0．059%，RSD 分別為 1．17%和 1．35%，表明方法重現(xiàn)性良好。

穩(wěn)定性試驗(yàn)：取同一供試品溶液，精密吸取20 μL，分別在0，2，4，8，12，24 h 時(shí)進(jìn)樣測(cè)定。結(jié)果大黃素峰面積的 RSD 為 0．78% ，大黃素甲醚峰面積的 RSD為1．56%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

檢測(cè)限與定量限確定：采用信噪比法，把已知質(zhì)量濃度的供試品測(cè)出的信號(hào)與空白樣品測(cè)出的信號(hào)進(jìn)行比較。以信噪比為3∶1時(shí)為檢測(cè)限，計(jì)算得大黃素的檢測(cè)限為2．4 ng，大黃素甲醚的檢測(cè)限為3．25 ng；以信噪比為10∶1時(shí)為定量限,計(jì)算得大黃素的定量限為8 ng，大黃素甲醚的定量限為14．625 ng。

加樣回收試驗(yàn)：取已知含量（大黃素 0．24%，大黃素甲醚0．062%）的胖血藤粉末（過(guò) 4號(hào)篩）約0．25 g共6份，精密稱定，置錐形瓶中分別精密加入大黃素對(duì)照品溶液 15 mL（40 μg／mL）、大黃素甲醚對(duì)照品溶液 15 mL（12．5 μg ／mL）和甲醇 20 mL，稱定質(zhì)量，水浴回流 1 h，放冷，用微孔濾膜（0．45 μm）濾過(guò)，取續(xù)濾液，按擬訂色譜條件測(cè)定含量，計(jì)算回收率。結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 大黃素與大黃素甲醚加樣回收試驗(yàn)結(jié)果(n＝6)

2．4 樣品含量測(cè)定

按2．2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按擬訂色譜條件測(cè)定3批樣品中的大黃素和大黃素甲醚的含量。結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 不同批次胖血藤藥材大黃素和大黃素甲醚含量測(cè)定結(jié)果

3 討論

被測(cè)成分：根據(jù)植物的親緣關(guān)系，相同科屬的植物可能含有相同化學(xué)成分的特點(diǎn)，初步推斷胖血藤可能含大黃素等蒽醌類(lèi)化合物。因此先采用薄層色譜法[3]對(duì)其進(jìn)行薄層分析，結(jié)果在與大黃素、大黃素甲醚對(duì)照品相同位置顯相同顏色的斑點(diǎn)，初步證實(shí)胖血藤藥材中含有大黃素和大黃素甲醚。采用高效液相色譜－二極管陣列檢測(cè)器檢測(cè)，結(jié)果在與大黃素、大黃素甲醚對(duì)照品相同保留時(shí)間處有相對(duì)應(yīng)的色譜峰，并且相對(duì)應(yīng)的色譜峰的紫外－可見(jiàn)光譜圖一致，確定胖血藤藥材中含有大黃素及大黃素甲醚。

檢測(cè)波長(zhǎng)：大黃素及大黃素甲醚（甲醇溶解）在222，254，310 nm波長(zhǎng)處有最大吸收。當(dāng)選用222 nm為檢測(cè)波長(zhǎng)時(shí)，其他成分的吸收大，使得大黃素和大黃素甲醚峰的顯示相對(duì)較小而不明顯；而選擇310 nm為檢測(cè)波長(zhǎng)時(shí)基線不穩(wěn)定，有干擾；選擇254 nm為檢測(cè)波長(zhǎng)時(shí)，基線穩(wěn)定，分離效果較好。因此選擇254 nm作為其檢測(cè)波長(zhǎng)。

流動(dòng)相：曾經(jīng)用水和甲醇為流動(dòng)相，結(jié)果峰形太差，無(wú)法進(jìn)行積分計(jì)算。然后改用甲醇 － 0．1% 磷酸（80 ∶20）[3]為流動(dòng)相，基線穩(wěn)定，色譜峰峰形較好，分離度滿足要求，因此確定流動(dòng)相用甲醇 － 0．1% 磷酸(80 ∶20)。

提取條件：分別比較了不同提取溶劑（甲醇、乙醇），不同提取方法（加熱回流提取和超聲提取），不同提取時(shí)間（0．5，1，1．5 h），最后確定采用甲醇加熱回流提取1 h，胖血藤中大黃素和大黃素甲醚的含量達(dá)到最大。

參考文獻(xiàn)：

[1]全國(guó)中草藥匯編編寫(xiě)組．全國(guó)中草藥匯編(下冊(cè))[M]．北京:人民衛(wèi)生出版社，1978:146．

[2]貴州省藥品監(jiān)督管理局．貴州省中藥材、民族藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)[M]．貴陽(yáng):貴州科學(xué)技術(shù)出版社，2003:288．

[3]國(guó)家藥典委員會(huì)．中華人民共和國(guó)藥典（一部）[M]．北京：中國(guó)醫(yī)藥科技出版社，2010:22．