楊久麗 孫素梅 劉書源 孫淑娟

（1山東大學(xué)附屬千佛山醫(yī)院，山東濟(jì)南 250014；2山東博士侖福瑞達(dá)制藥有限公司，250101；3山東大學(xué)藥學(xué)院，250012）

抗菌藥物對(duì)氟康唑動(dòng)態(tài)抗真菌作用及透過(guò)生物膜的影響

楊久麗1孫素梅2劉書源3孫淑娟1

（1山東大學(xué)附屬千佛山醫(yī)院，山東濟(jì)南 250014；2山東博士侖福瑞達(dá)制藥有限公司，250101；3山東大學(xué)藥學(xué)院，250012）

目的：測(cè)定試驗(yàn)用抗菌藥物與氟康唑聯(lián)合的動(dòng)態(tài)抗真菌作用，并評(píng)價(jià)試驗(yàn)用抗菌藥物對(duì)氟康唑透過(guò)生物膜的影響。方法：采用活菌計(jì)數(shù)法描繪聯(lián)合用藥對(duì)白色念珠菌的動(dòng)態(tài)殺菌曲線，以“三明治”透膜實(shí)驗(yàn)法評(píng)價(jià)試驗(yàn)用抗菌藥物對(duì)氟康唑透過(guò)生物膜的影響。結(jié)果：試驗(yàn)抗菌藥物對(duì)氟康唑有不同程度的增效作用，其中米諾環(huán)素和利福平對(duì)氟康唑透過(guò)耐藥白色念珠菌生物膜的作用及其對(duì)氟康唑動(dòng)態(tài)抗真菌的增效作用最強(qiáng)，氧氟沙星、阿奇霉素等次之。結(jié)論：試驗(yàn)用抗菌藥物能促進(jìn)氟康唑透過(guò)白色念珠菌生物膜，增強(qiáng)氟康唑的動(dòng)態(tài)抗真菌作用。

氟康唑；白色念珠菌；抗菌藥物；聯(lián)合抗真菌作用

近年來(lái)，隨著廣譜抗菌藥物、激素、免疫抑制劑的廣泛使用，器官移植和外科介入治療的不斷發(fā)展，惡性腫瘤、糖尿病以及獲得性免疫缺陷綜合征患者的不斷增多，使臨床深部真菌感染的發(fā)病率急劇上升[1]，尤其是念珠菌，在住院患者的感染中最為常見(jiàn)。而抗真菌藥物的廣泛、大量使用，又使臨床治療中真菌耐藥問(wèn)題日漸突出[2-3]，給臨床用藥選擇帶來(lái)了巨大的壓力。在加強(qiáng)新抗真菌藥物開發(fā)的同時(shí)，從現(xiàn)有的藥物中尋找可以增加白色念珠菌敏感性的藥物具有重要的意義。目前，聯(lián)合用藥作為解決耐藥真菌感染的主要方法之一，成為近年來(lái)的研究熱點(diǎn)，受到廣泛關(guān)注。本研究以多種方法評(píng)價(jià)米諾環(huán)素、磷霉素、大環(huán)內(nèi)脂類和氟喹諾酮等抗菌藥物與氟康唑的聯(lián)合抗真菌作用，應(yīng)用動(dòng)態(tài)殺菌曲線法測(cè)定一系列抗菌藥物與氟康唑?qū)Π咨钪榫捏w外抗真菌活性，并通過(guò)“三明治”實(shí)驗(yàn)觀察抗菌藥物對(duì)氟康唑透過(guò)耐藥白色念珠菌生物膜的影響，篩選出對(duì)氟康唑有增效作用的抗菌藥物以進(jìn)行更深入的研究。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)菌株質(zhì)控白色念珠菌ATCC10231，山東大學(xué)藥理教研室惠贈(zèng)；實(shí)驗(yàn)菌株CA10（FLC耐藥菌，MIC=512）與CA14（FLC敏感菌，MIC= 0.5）為山東省千佛山醫(yī)院臨床分離的白色念珠菌。

1.1.2 主要試劑氟康唑（fluconazole，F(xiàn)LC），山東誠(chéng)創(chuàng)醫(yī)藥科技發(fā)展有限公司；米諾環(huán)素（minocycline），山東磐信生物科技有限公司；利福平（rifampicin），山東綠源天然原料有限公司；阿奇霉素（azithromycin），石藥集團(tuán)歐意藥業(yè)；氧氟沙星（levofloxazin），廣州白云山制藥股份有限公司；磷霉素（fosfomycin），中國(guó)藥品生物制品鑒定所；二甲基亞砜（DMSO），中國(guó)堯舜進(jìn)出口公司；RPMI 1640原料藥粉，美國(guó)GIBCO公司；3-（N-嗎啉代）丙磺酸（MOPS），濟(jì)南朋遠(yuǎn)生物技術(shù)有限公司；TTC-沙保羅瓊脂，杭州天和微生物試劑有限公司。

1.2 方法

1.2.1 菌液制備-20℃下保存的白色念珠菌室溫下解凍，接種到TTC-沙保羅瓊脂培養(yǎng)基上，35℃培養(yǎng)24～48 h。取發(fā)育良好的單一菌落再次接種，35℃培養(yǎng)24 h，以保證菌株處于生長(zhǎng)期。選取若干單個(gè)較大菌落，磷酸鹽緩沖液（PBS）配制成菌懸液，經(jīng)渦旋器振蕩均勻后以中國(guó)細(xì)菌濁度標(biāo)準(zhǔn)管比濁，調(diào)整樣品管與標(biāo)準(zhǔn)管濁度一致，此時(shí)白色念珠菌的菌濃度約為4.5×106CFU/mL，系列稀釋即得到工作菌液，并以活菌計(jì)數(shù)進(jìn)行濃度驗(yàn)證。

1.2.2 RPMI 1640液體培養(yǎng)液配制[4]取RPMI 1640（含L-谷氨酰胺，不含碳酸氫鈉）粉末2.08 g，加入10%葡萄糖溶液40 mL（含糖終濃度2%）及MOPS粉6.906 g，加蒸餾水至約為200 mL，混合均勻后在22℃用1 mol/L的NaOH溶液調(diào)pH約為（7.0±0.1），臨用前用0.22 μm混合纖維膜過(guò)濾滅菌。

1.2.3 藥物溶液配制氟康唑用滅菌注射用水溶解，配成2 560 μg/mL的儲(chǔ)備液，過(guò)濾分裝；磷霉素用滅菌注射用水，阿奇霉素、米諾環(huán)素、氧氟沙星用二甲基亞砜溶解，分別配成6 400 μg/mL的儲(chǔ)備液，分裝。所有藥液于-20℃冰箱保存，備用。

1.2.4 試驗(yàn)用抗菌藥物與氟康唑聯(lián)合動(dòng)態(tài)抗真菌作用

將濃度為2 560 μg/mL的氟康唑和濃度均為6 400 μg/mL的各抗菌藥物儲(chǔ)備液以RPMI 1640液體培養(yǎng)基稀釋成10倍工作濃度。將初始濃度約為4.5×106CFU/mL的菌液以RPMI 1640稀釋為10倍工作菌液濃度，并通過(guò)活菌計(jì)數(shù)法進(jìn)行濃度驗(yàn)證。取上述制備的藥液500 μL加入到相應(yīng)試管內(nèi)，再加入RPMI 1640液體培養(yǎng)基至液體總體積為4.5 mL；此時(shí)取按上述方法制備的菌液500 μL加入到此4.5 mL含（或不含）藥物的培養(yǎng)基內(nèi)，震蕩混勻。本實(shí)驗(yàn)分為4組，即：生長(zhǎng)對(duì)照組（不加藥）、各抗菌藥物單用組、氟康唑單用組、各抗菌藥物與氟康唑聯(lián)合用藥組，共12個(gè)體系。每個(gè)體系總體積為5 mL，體系內(nèi)氟康唑、米諾環(huán)素、利福平、氧氟沙星、阿奇霉素和磷霉素的終濃度分別為4 μg/mL，8 μg/mL，8 μg/mL，0.5 μg/mL，0.5 μg/mL和8 μg/mL，體系內(nèi)菌液終濃度約為4.5×103CFU/mL。將制備完畢的體系于35℃靜置培養(yǎng)，于藥物作用的第0，6，12，24，48 h的時(shí)間點(diǎn)取樣測(cè)定。

在取樣時(shí)間點(diǎn)將各體系在蝸旋振蕩器上震蕩混勻，每個(gè)體系中分別取出100 μL的菌懸液，以滅菌注射用水進(jìn)行系列稀釋，取1 mL稀釋后的菌液與大約處于35～40℃的液態(tài)TTC-沙保羅瓊脂培養(yǎng)基混勻，室溫下水平放置使其凝固，35℃恒溫培養(yǎng)48小時(shí)，此時(shí)培養(yǎng)基內(nèi)的菌落清晰可辨，利于計(jì)數(shù)，每次取計(jì)數(shù)個(gè)數(shù)在30～500個(gè)范圍內(nèi)的兩個(gè)平板進(jìn)行計(jì)數(shù)，將計(jì)數(shù)結(jié)果乘以相應(yīng)的稀釋倍數(shù)，即可得體系中的菌液濃度（CFU/mL），取兩個(gè)平板的平均值記錄結(jié)果，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.5 生物膜制備將CA10菌株傳代后于YPD液體培養(yǎng)基35℃培養(yǎng)24小時(shí)，3 000 rpm離心5 min，PBS重懸，按照中國(guó)濁度標(biāo)準(zhǔn)比濁，使菌液的濃度為4.5×106CFU/mL，取此濃度的菌液200 μL加入1.8 mL的PBS中，使菌液濃度稀釋為4.5×105CFU/mL，備用。將提前滅好菌的載體膜放入TTC培養(yǎng)基中，取40 μL 4.5×105CFU/mL的菌液，小心滴入載體膜（13 mm的微孔濾膜），放入恒溫培養(yǎng)箱，35℃培養(yǎng)24 h。

1.2.6 藥物透膜實(shí)驗(yàn)將培養(yǎng)好的載體膜和生物膜系統(tǒng)取出，放入加藥YPD平板中，將靠近生物膜的一側(cè)放入面積大于生物膜的0.22 μm的混合纖維素酯微孔濾膜，然后將提前潤(rùn)濕的空白紙片放于濾膜上，形成“三明治”系統(tǒng)，見(jiàn)圖1。將制備好的平板放于恒溫培養(yǎng)箱35℃培養(yǎng)24小時(shí)。取出空白紙片，放入YPD CA14菌板中，35℃培養(yǎng)24小時(shí)，觀察，測(cè)量抑菌圈。

圖1 藥物透過(guò)白念珠菌生物膜系統(tǒng)示意

生物膜是在瓊脂培養(yǎng)基直徑為13 mm的微孔濾膜上形成的，然后覆蓋上直徑為10 mm的混合纖維素酯膜，最后將提前潤(rùn)濕的空白紙片至于最上端，整個(gè)系統(tǒng)在含有藥物的固體培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)。

2 結(jié)果

2.1 時(shí)間-殺菌作用測(cè)定結(jié)果

將各個(gè)時(shí)間點(diǎn)聯(lián)合抗真菌作用的結(jié)果連結(jié)成曲線，可觀察聯(lián)合用藥后的動(dòng)態(tài)作用效果，如圖2所示。在4.5×103CFU/mL的菌液中，12 h之前加藥組和對(duì)照組OD值的變化不大，12 h以后各組菌液的濃度開始出現(xiàn)差別，與對(duì)照組相比，各個(gè)含有氟康唑的抗菌藥物組開始生長(zhǎng)都幾乎延遲了12 h。與單用氟康唑相比較，聯(lián)合應(yīng)用利福平的效果最好；其次是聯(lián)用米諾環(huán)素組，在48 h內(nèi)的作用效果較好；而聯(lián)用氧氟沙星、阿奇霉素和磷霉素時(shí)，與氟康唑單用比增效不明顯。

圖2 菌落計(jì)數(shù)法測(cè)定CA10的時(shí)間-殺菌曲線

氟康唑、米諾環(huán)素、利福平、氧氟沙星、阿奇霉素和磷霉素的濃度分別為4 μg/mL，8 μg/mL，8 μg/mL，0.5 μg/mL，0.5 μg/mL和8 μg/mL。

2.2 實(shí)驗(yàn)用抗菌藥物對(duì)氟康唑透過(guò)生物膜的影響

實(shí)驗(yàn)抗菌藥物對(duì)氟康唑透過(guò)生物膜的影響以“三明治”實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)，抑菌圈的大小表示氟康唑透過(guò)生物膜量的多少。每個(gè)平板分別設(shè)有氟康唑單用組（a），兩個(gè)不同濃度的抗菌藥物與氟康唑聯(lián)用組（b，c）。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖3。從圖可見(jiàn)不同濃度的抗菌藥物與氟康唑聯(lián)用組均比氟康唑單用的抑菌圈要大，特別是利福平、米諾環(huán)素與氧氟沙星，說(shuō)明聯(lián)用的抗菌藥物能促進(jìn)氟康唑透過(guò)生物膜，從而增強(qiáng)氟康唑的作用效果。

圖3 氟康唑與抗菌藥物聯(lián)用透過(guò)耐藥菌生物膜產(chǎn)生的抑菌圈

在圖3中，a代表氟康唑單用，濃度為400μg/mL；b和c分別為不同濃度的抗菌藥物和氟康唑聯(lián)合應(yīng)用。聯(lián)合應(yīng)用的藥物濃度分別為米諾環(huán)素（1 μg/mL，2 μg/mL）；利福平（4 μg/mL，8 μg/mL）；氧氟沙星（0.062 5 μg/mL，0.25 μg/mL）；阿奇霉素（0.5 μg/mL，2 μg/mL）；磷霉素（1 μg/mL，8 μg/mL）。

3 討論和結(jié)論

3.1.聯(lián)合動(dòng)態(tài)抗真菌作用評(píng)價(jià)

面對(duì)臨床應(yīng)用抗真菌藥物較少且已出現(xiàn)的耐藥這一現(xiàn)象，大力研制新型的抗真菌藥物非常重要，而通過(guò)聯(lián)合用藥的手段來(lái)增加真菌對(duì)藥物的敏感性也是克服耐藥的一種較好的選擇。文獻(xiàn)報(bào)道，四環(huán)素類抗生素米諾環(huán)素自身僅具有微弱的抗白色念珠菌的作用[6-10]，MIC大多在128～512 μg/mL之間，而在體內(nèi)米諾環(huán)素卻遠(yuǎn)遠(yuǎn)達(dá)不到此濃度。另外，研究表明多西環(huán)素與氟康唑聯(lián)用時(shí)，能增加對(duì)白色念珠菌生物膜的效應(yīng)[11]。我們前期研究表明[12]米諾環(huán)素等抗菌藥物與氟康唑聯(lián)用，對(duì)耐藥白色念珠菌具有明顯的協(xié)同作用。目前聯(lián)合抗真菌作用的評(píng)價(jià)有多種方法，各種方法由于其數(shù)據(jù)獲取與結(jié)果分析方法的不同，其結(jié)論往往存在差異；加之不同的實(shí)驗(yàn)結(jié)果可揭示藥物不同方面的特征。為了評(píng)價(jià)氟康唑與多種抗菌藥物聯(lián)合應(yīng)用抗真菌活性的速度和程度隨時(shí)間的變化的情況，本次實(shí)驗(yàn)進(jìn)行了藥物的動(dòng)態(tài)抗真菌作用測(cè)定，即將一定濃度菌懸液暴露于各種濃度的藥物或藥物組合，于不同時(shí)間點(diǎn)取樣進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)，進(jìn)一步評(píng)價(jià)聯(lián)合用藥的作用結(jié)果。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，與氟康唑單用比較，聯(lián)合用藥組氟康唑與利福平聯(lián)合效果最好，起到直接殺菌作用；其次為米諾環(huán)素，在48 h內(nèi)聯(lián)合作用明顯；而聯(lián)用氧氟沙星、阿奇霉素和磷霉素，則結(jié)果無(wú)明顯差別。該結(jié)果與前期的棋盤法作用結(jié)果一致。

3.2 氟康唑透過(guò)生物膜實(shí)驗(yàn)

生物膜形成是導(dǎo)致真菌耐藥的一個(gè)重要因素，生物膜中的細(xì)胞比浮游菌耐藥性可強(qiáng)10～1 000倍[5]，因此，本實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)了抗菌藥物對(duì)氟康唑透過(guò)生物膜的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)論顯示，不同濃度的抗菌藥物與氟康唑聯(lián)用組均比氟康唑單用的抑菌圈要大，特別是利福平、米諾環(huán)素與氧氟沙星，說(shuō)明聯(lián)合用藥的抗真菌作用增強(qiáng)可能與克服了生物膜的物理屏障，促進(jìn)氟康唑透過(guò)生物膜有關(guān)。具體分子機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

[1]Kanfman CA，Vazquez JA，Sobel JD，et a1.Prospectivemuhicemer surveillance study of funguria in hospitalized patients.The National Institute for Allergy and Infectious Diseases（NIAID）Mycoses study Group[J].Clin Infer Dis，2000，30（1）：14-18.

[2]Denning DW，Muoz P.Advances in invasive fun infection and antifuntempy：Introduction[J].Cli Micmbiol Infect，2001（S2）：vi.

[3]周貴民，謝靈.國(guó)內(nèi)酵母菌感染和實(shí)驗(yàn)室診斷的現(xiàn)狀及建議[J].中華醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)雜志，1996，19（5）：301-303.

[4]Espinel-Ingroff A，Barchiesi F，Cuenca-Estrella M，et al.International and multicenter comparison of EUCAST and CLSI M27-A2 broth microdilution methods for testing susceptibilities of Candida spp.to fluconazole，itraconazole，posaconazole，and voriconazole[J].J Clin Microbiol，2005，43（8）：3884-3889.

[5]Mah TF，O’Toole GA.Mechanisims of biofilm resistance to antimicrobial agents[J].Trend Microbiol，2001，9（1）：34-39.

[6]Lew MA，Beckett KM，Levin MJ.Antifungal activity of four tetracycline analogues against Candida albicans in vitro：Potentiation by amphotericin B[J].J Infect Dis，1977，136（2）：263-270.

[7]Raad I，Darouiche R，Hachem R，et al.Antibiotics and preventionof microbial colonization of catheters[J].Antimicrob Agents Chemother，1995，39（11）：2397-2400.

[8]Schierholz JM，Pulverer G，Bach A，et al.In vitro activity of rifampin-minocyclin coating to Candida albicans[J].Crit Care Med，1999，27（8）：1691-1693.

[9]Wilson M，O’Connor B，Newman HN.Isolation and identification of bacteria from subgingival plaque，with low susceptibility to minocycline[J].J Periodontol，1991，28（1）：71-78.

[10]de Oliveira LF，Jorge AO，Dos Santos SS.In vitro minocycline activity on superinfecting microorganisms isolated from chronic periodontitis patients[J].Braz Oral Res，2006，20（3）：202-206.

[11]Miceli MH，Bernardo SM，Lee SA.In vitro analyses of the combination of high-dose doxycycline and antifungal agents against Candida albicans biofilms[J].Int J Antimicrob Agents，2009，34（4）：326-332.

[12]Shi W，Chen ZZ，Chen X，et al.The combination of minocycline and fluconazole causes synergistic growth inhibition：an in vitro interaction of antifungal and antibacterial agents[J].FEMS Yeast Res，2010，10（7）：885-893.

The Impact of Antibacterial Agents on Dynamic Antifungal Effects of Fluconazole and Biofilm Penetration

Yang Jiuli1，Sun Sumei2，Liu Shujuan3，Sun Shujuan1（1 Qianfoshan Hospital Affiliated to Shandong University，Shandong Jinan 250014，China；2 Shandong Bausch＆Lomb Freda Pharmaceutical Co.，Ltd.，250101；3 School of Pharmaceutical Sciences of Shandong University，250012）

Objective：To determine the combined dynamic antifungal effects of fluconazole and the tested antibacterial agents and evaluate the impact of the tested antibacterial agents on fluconazole penetration through biofilm. Methods：The dynamic killing curve was obtained based on the combined drugs against Candida albicans using viable bacterial counting method.The biofilm penetration test was evaluated by“sandwich”experimental method.Results：Synergistic effects on fluconazole were showed by using the tested antibacterial agents.The penetrating ability of fluconazole through biofilm by the drug resistant Candida albicans varied by different tested antibacterial drugs，of which minocycline and rifampicin shown strongest impact on it but also on the synergistic effects of dynamic antifungal action.Levofloxacin，azithromycin and others had a lower impact.Conclusion：The tested antibacterial agents can promote the fluconazole penetration of Candida albican’s biofilm and increase fluconazole’s dynamic antifungal effect.

Fluconazole；Candida albican；Antibacterial Agents；Combined Antifungal Effect

10.3969/j.issn.1672-5433.2014.04.002

2013-8-21）

山東省自然基金、攻關(guān)課題（ZR2011HL049，2013GSF11848）

楊久麗，女，主管藥師。研究方向：抗菌藥物合理應(yīng)用。

孫淑娟，女，博士，主任藥師，碩士生導(dǎo)師。研究方向：抗真菌耐藥方法與機(jī)制研究。通訊作者E-mail：sunshujuan888@163.com