魏曉霞 李鵬 孫紅 莊捷

（1福建省立醫(yī)院藥學(xué)部，福建福州 350001；2福建醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院天然藥物學(xué)系，350004）

靈芝三萜酸組分高效液相色譜指紋圖譜初探

魏曉霞1李鵬2孫紅1莊捷1

（1福建省立醫(yī)院藥學(xué)部，福建福州 350001；2福建醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院天然藥物學(xué)系，350004）

目的：建立靈芝三萜酸組分（GLA）的指紋圖譜，為其質(zhì)量控制提供依據(jù)。方法：使用植物組織破碎法提取GLA，利用高效液相色譜法建立GLA的指紋圖譜。結(jié)果：GLA高效液相色譜指紋圖譜中有8個峰為其主要特征，其α值分別為0.68，0.73，0.90，0.95，1.00，1.12，1.36，1.46。結(jié)論：所建立的RP-HPLC指紋圖譜分析方法可為GLA的質(zhì)量控制提供理論依據(jù)。

靈芝三萜酸；指紋圖譜；高效液相色譜法

靈芝(Ganoderma lucidum[Leys.ex Fr.]Karst）為多孔菌科（polyproraceae）、靈芝屬（Ganoderma）真菌植物赤芝（Ganoderma lucidum[Leys.ex Fr.] Karst）或紫芝（Ganoderma japonicum[Fr.]Lloyd）的干燥子實體[1]。靈芝性溫、味甘，多分布于閩、貴、云、冀、蘇、吉、浙等省，在我國已有悠久的藥用歷史，始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，具有補中益氣、扶正固本、滋補強壯之功效，是一種珍貴的中藥材[2]。三萜類化合物是靈芝主要成分之一。其中靈芝三萜酸組分（GLA）是靈芝三萜中的一大類成分，具有多種藥理活性，前期研究發(fā)現(xiàn)其具有一定抗腫瘤[3]和保肝作用[4]，本實驗利用反相高效液相色譜（RP-HPLC）技術(shù)，建立GLA的高效液相色譜指紋圖譜，為GLA的質(zhì)量控制提供實驗依據(jù)。

1 儀器與藥品

1.1 藥材

靈芝子實體精粉，3批次（批號GC-L3-20120821、GC-L3-20120922、GC-L3-20121010），由福建仙芝樓生物科技有限公司提供。

1.2 試劑

乙腈、甲醇為色譜純（國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；無水乙醇、乙酸乙酯、石油醚、冰乙酸均為分析純（國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；碳酸氫鈉為化學(xué)純（國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）。

1.3 儀器

AB204-E電子分析天平（Mettler Toledo公司）；JHBE-50型閃式提取器（北京金鼐科技發(fā)展有限公司）；HH-4型數(shù)顯恒溫水浴鍋（國華電器有限公司）；RE-52A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器（上海亞榮生化儀器廠）；Agilent 1100高效液相色譜儀（美國Agilent公司），配二極管陣列檢測器，自動進(jìn)樣器；處理軟件（Agilent化學(xué)工作站）。

2 方法

2.1 供試品制備

將靈芝子實體精粉經(jīng)無水乙醇閃式提取、抽濾與減壓蒸餾后，無水乙醇提取浸膏拌硅藻土后，以石油醚索氏提取除雜后再用乙酸乙酯提取，乙酸乙酯提取液用飽和NaHCO3溶液萃取，NaHCO3層酸化后再用乙酸乙酯萃取，減壓濃縮真空干燥即得GLA[5]。共制備3批次來源于靈芝子實體精粉的GLA樣品備用。參照《中華人民共和國藥典》RP-HPLC的有關(guān)規(guī)定[6]，精確稱取GLA樣品，用乙腈配成10 mg/mL供試品，0.45 μm微孔濾膜過濾，RP-HPLC進(jìn)樣量5 μL。

2.2 色譜條件

依利特C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；填料Hypersil ODS 25 μm（柱號E1720569)；流動相甲醇-水（含2%乙酸），梯度洗脫條件見表1；檢測波長252 nm；進(jìn)樣量5 μL；流速0.8 mL/min；柱溫35℃。

表1 線性梯度洗脫條件（體積百分比%）

2.3 HPLC分析

取3批次供試品溶液5 μL，注入高效液相色譜儀，自動積分記錄色譜圖（圖1、圖2、圖3）和各色譜峰的保留時間，以面積歸一化法計算各色譜峰的相對峰面積。

圖1 GLA的RP-HPLC圖（批次GC-L3-20120821）

圖2 GLA的RP-HPLC圖(批次：GC-L3-20120922)

圖3 GLA的RP-HPLC圖(批次：GC-L3-20121010)

2.4 相對保留值指紋圖譜的確定

選擇一個保留時間居中且在各樣品中均存在的色譜峰作為參照物，指定它的相對保留時間（relative retention time）α=1，并分別求出樣品中各組分的相對保留值為：

式中tR（i）為各組分的出峰時間，tR（s）為參照峰的出峰時間。

以某一樣品的色譜峰總面積為分母，各樣品中每個色譜峰面積為分子，求得該色譜峰的相對峰面積（ratio of peak area，RA），將它標(biāo)在其α值項下，最后將各樣品的α按由小到大的次序依次排列成行。每個樣品色譜峰的相對保留值α和相對峰面積RA構(gòu)成了其HPLC的指紋特征。

2.5 方法學(xué)考察

2.5.1 精密度試驗取同一GLA樣品，按2.1制備供試品，連續(xù)進(jìn)樣5次，考察主要色譜峰的α和RA的一致性。相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)是試驗可信度的一種考察標(biāo)準(zhǔn)，根據(jù)檢測數(shù)據(jù)，計算各自的RSD。

2.5.2 穩(wěn)定性試驗取同一GLA樣品，按2.1制備供試品，分別在0 h，4 h，8 h，12 h和16 h檢測指紋圖譜，考察主要色譜峰的α和RA的一致性，并計算各自的RSD。

2.5.3 重現(xiàn)性試驗取同一批號GLA樣品5份，按2.1制備供試品，考察主要色譜峰的α和RA的一致性，并計算各自的RSD。

3 結(jié)果

3.1 GLA色譜圖

按2.3進(jìn)行HPLC分析，得到3批次GLA高效液相色譜圖，見圖1、圖2、圖3。

3.2 指紋峰的標(biāo)定

采用α標(biāo)定指紋峰，以5號色譜峰作為參照峰，計算各待測峰的α及RA。結(jié)果見表2，表3。3批次GLA供試品中含量較高的峰集中在0.90～1.11區(qū)域，α值為0.90（峰3），0.95（峰4），1.00（峰5），1.12（峰6）處有4個較強峰；0.68（峰1），0.73（峰2），1.36（峰7），1.46（峰8）處有4個中等強峰。這8個色譜峰的RA均占總峰面積的3.3%以上，說明這8個峰的含量較高，可能是GLA組分中的主要成分。

表2 GLA指紋圖譜共有峰相對保留時間（α）

表3 GLA指紋圖譜共有峰相對峰面積（RA）

3.3 儀器精密度

分別取同一供試品溶液5 μL，連續(xù)進(jìn)樣5次，色譜峰均自動積分。比較不同色譜圖中主要色譜峰的α和RA。結(jié)果表明，所標(biāo)定色譜峰的α和RA基本一致，RSD均小于3%，符合指紋圖譜的檢測要求[7]。說明儀器系統(tǒng)精密度良好。見表4。

表4 GLA的精密度實驗數(shù)據(jù)

3.4 穩(wěn)定性試驗

分別取同一供試品溶液5 μL，每隔4 h進(jìn)樣一次，16 h內(nèi)連續(xù)進(jìn)樣5次，色譜峰均自動積分。比較不同色譜圖中主要色譜峰的α和RA。結(jié)果表明，所標(biāo)定色譜峰的α和RA基本一致，RSD均小于3%，符合指紋圖譜的檢測要求[6]。說明GLA樣品性能比較穩(wěn)定。見表5。

3.5 重現(xiàn)性試驗

取同一批號靈芝子實體精粉，按2.1項下方法制備5份供試品溶液。每份樣品進(jìn)樣5 μL，色譜峰均自動積分。結(jié)果表明，所標(biāo)定色譜峰的α和RA基本一致，RSD均小于3%，符合指紋圖譜的檢測要求。所考察的共有色譜峰的重現(xiàn)性良好。見表6。

表5 穩(wěn)定性實驗數(shù)據(jù)

表6 GLA重現(xiàn)性實驗數(shù)據(jù)

4 討論

中藥的藥效是所含有的多種化學(xué)成分通過多靶點、多環(huán)節(jié)發(fā)揮綜合作用的結(jié)果，GLA的藥效是多種靈芝三萜酸類成分共同起作用的結(jié)果。僅分析測定一種或某幾種靈芝三萜酸來評價其質(zhì)量是不全面的，本文建立的GLA高效液相色譜指紋圖譜是GLA中三萜酸類成分整體的綜合表達(dá)，更能全面評價GLA的質(zhì)量。因此，GLA的RP-HPLC指紋圖譜是控制GLA質(zhì)量的有效手段，具有一定必要性和先進(jìn)性。本文所建立的方法得到的色譜指紋圖譜多數(shù)峰未達(dá)到基線分離，因此不適用于GLA的定量控制，但可以作為GLA質(zhì)量控制中的定性控制方法。通過測定一種或某幾種靈芝三萜酸來作為GLA質(zhì)量的定量控制方法，再結(jié)合本文建立的GLA質(zhì)量的定性控制方法，可以全面控制GLA質(zhì)量。3批次GLA樣品的指紋圖譜，各主要色譜峰的α分別為0.68，0.73，0.90，0.95，1.00，1.12，1.36，1.46。這8個色譜峰為3批次供試品的共有指紋峰，是鑒別GLA樣品的必要條件之一。

[1]國家藥典委員會.中華人民共和國藥典（2010年版）一部[S].北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2010：174.

[2]江蘇新醫(yī)學(xué)院.中藥大辭典[M].上海：上?？茖W(xué)技術(shù)出版社，1985：1180-1182.

[3]魏曉霞，李鵬，許建華，等.靈芝三萜組分GLA體內(nèi)外抗腫瘤作用的研究[J].福建醫(yī)科大學(xué)學(xué)報，2010，44（6）：417-418.

[4]李鵬，魏曉霞，南婷婷，等.靈芝三萜酸對小鼠急性肝損傷的保護(hù)作用[J].中國醫(yī)院藥學(xué)雜志，2013，33（23）：4-8.

[5]徐任生，陳仲良.中草藥有效成分提取與分離[M].2版.上海科學(xué)技術(shù)出版社：218-223.

[6]潘君漢.淺談中藥指紋圖譜的意義[J].中國藥業(yè)，2008，17（6）：13-14.

[7]國家食品藥品監(jiān)督管理局.關(guān)于印發(fā)《中藥注射劑指紋圖譜研究的技術(shù)要求（暫行）》的通知[J].中國藥品標(biāo)準(zhǔn)，2000，1（4）：3.

Preliminary Study on HPLC Fingerprint of Triterpene acids Components from Ganoderma Lucidum

Wei Xiaoxia1，Li Peng2，Sun Hong1，Zhuang Jie1（1 Pharmacy Department of Fujian Provincial Hospital，F(xiàn)ujian Fuzhou 350001，China;2 Department of Natural Medicines of Pharmaceutical College of Medical University，350004）

Objective:To set up the fingerprint of triterpene acids components of ganoderma lucidum（GLA）and to provide a basis for its quality control. Methods:To extract the triterpene acids components of ganoderma lucidum by plant tissue crushing method and to establish the fingerprint of GLA by HPLC.Results:There were 8 characteristic peaks in HPLC fingerprint of GLA，their alpha values were 0.68，0.73，0.90，0.95，1.00，1.12，1.36 and 1.46 respectively.Conclusion: The established RP-HPLC fingerprint can provide a theoretical basis for the quality control of GLA.

Ganoderma lucidum；Triterpene acids；Fingerprint；HPLC

10.3969/j.issn.1672-5433.2014.04.006

2014-02-08）

國家自然科學(xué)青年基金（81202560）；福建省教育廳科技計劃項目（JA11107）；2011年福建省高校產(chǎn)學(xué)合作科技重大項目（2011Y4003）

魏曉霞，女，碩士。研究方向：腫瘤藥理。通訊作者E-mail：xxwei0321@163.com