王洪水

(馬應龍藥業(yè)集團股份有限公司，湖北 武漢 430064)

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益氣通便顆粒微生物限度檢查法研究

王洪水

(馬應龍藥業(yè)集團股份有限公司，湖北 武漢 430064)

目的：建立益氣通便顆粒微生物限度檢驗方法。方法：按《中國藥典》2010版附錄微生物限度檢查法的驗證試驗指導原則，采用培養(yǎng)基稀釋法和常規(guī)法對三個批號的益氣通便顆粒進行微生物限度測定。結(jié)果：各菌種的回收率均大于70%，在控制菌常規(guī)法驗證中實驗組檢出試驗菌；通過方法學驗證表明，細菌、霉菌及酵母菌檢查可采用培養(yǎng)基稀釋法檢驗，控制菌可采用常規(guī)法進行檢驗。結(jié)論：建立的益氣通便顆粒微生物限度檢驗方法準確可靠、可行性強，能有效地對其進行微生物限度的測定。

益氣通便顆粒；常規(guī)法；培養(yǎng)基稀釋法；方法驗證

益氣通便顆粒為口服給藥制劑，由何首烏、枳殼、升麻、火麻仁、白術(shù)、炙黃芪、肉蓯蓉等七味中藥組成，具有益氣養(yǎng)陰、潤腸通便之功效。用于中老年氣陰兩虛、氣機升降失常、腸道失運引起的便秘，癥見大便干結(jié)，或大便稀軟難解，肛門墜脹，努掙無力，便后疲憊，舌淡胖而少津，或舌紅少苔，脈虛無力，或細澀無力。為了有效地對益氣通便顆粒進行微生物限度測定，準確檢出樣品中存活的微生物數(shù)量及致病菌種類[1-3],特研究了其微生物限度的檢查方法并進行了方法驗證。

1 實驗儀器、試藥

1.1 實驗菌種

白色念珠菌CMCC(F)98001、金黃色葡萄球菌CMCC(B)26003、枯草芽孢桿菌CMCC(B)63501、黑曲霉CMCC(F)98003、大腸埃希菌CMCC(B)44102由中國食品藥品檢定研究院提供。

1.2 樣品

益氣通便顆粒(馬應龍藥業(yè)有限公司，批號：120601、131001、131101)。

1.3 培養(yǎng)基

玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基(BR 021011)、MUG培養(yǎng)基、營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基(BR)、曙紅亞甲藍瓊脂培養(yǎng)基(EMB)(伊紅美藍瓊脂培養(yǎng)基)、營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基(BR)、改良馬丁培養(yǎng)基(BR)、膽鹽乳糖培養(yǎng)基(BL)、pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液(OWD-M0151)以及0.9%無菌氯化鈉溶液等。

1.4 儀器

天平、培養(yǎng)箱、冰箱、微波爐、高壓滅菌鍋等。

2 方法與結(jié)果

2.1 菌液制備

①取經(jīng)35℃培養(yǎng)24h的大腸埃希菌、枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌的營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)物1mL，加適量0.9%無菌NaCl溶液制成細菌數(shù)為50～100cfu/mL的菌液，做活菌計數(shù)備用。②取經(jīng)25℃培養(yǎng)24h以改良馬丁培養(yǎng)基培養(yǎng)的白色念珠菌液體培養(yǎng)物1mL，加適量0.9%無菌NaCl溶液制成細菌數(shù)為50～100cfu/mL的菌液，做活菌計數(shù)備用。③將黑曲霉的新鮮培養(yǎng)物接種到斜面改良馬丁瓊脂培養(yǎng)基上，經(jīng)25℃培養(yǎng)1周，加5mL0.9%無菌NaCl溶液洗下斜面的霉菌孢子，然后吸取洗下的孢子液用適量0.9%無菌NaCl溶液制成細菌數(shù)為50～100cfu/mL的菌液，備用。

2.2 供試液的制備方法

取樣品10g研碎，加入適量pH7.0的無菌NaCl-蛋白胨緩沖液使溶解并稀釋至100mL，制成1∶10的供試液備用；取以上供試液1mL注皿。常規(guī)法，取1∶10的供試液1mL注皿；培養(yǎng)基稀釋法，取1∶10的供試液1mL注入5個平皿中。

2.3 回收率試驗

菌液組：取上述各菌液1mL分別注入平皿中，立即注入瓊脂，待凝固后，細菌35℃培養(yǎng)72h，白色念珠菌、黑曲霉25℃培養(yǎng)120h；平行制備2個平皿，測定各菌株的實驗菌數(shù)。

試驗組：取上述供試液和不同菌液各1mL分別注入同一平皿中，平行制備2個平皿。立即注入瓊脂，待凝固后，細菌35℃培養(yǎng)72h，白色念珠菌、黑曲霉25℃培養(yǎng)120h；平行制備2個平皿，測定各菌株的實驗菌數(shù)。

供試品對照組：取上述供試液1mL注入平皿中，立即注入瓊脂，待凝固后，細菌35℃培養(yǎng)72h，白色念珠菌、黑曲霉25℃培養(yǎng)120h；平行制備2個平皿，測定供試品本底菌數(shù)。

稀釋劑對照組：取pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液1mL和上述不同菌液1mL，分別注入同一平皿中，立即注入瓊脂，待凝固后，細菌35℃培養(yǎng)72h，白色念珠菌、黑曲霉25℃培養(yǎng)120h；平行制備2個平皿，考察稀釋劑對試驗有無干擾。該對照組各試驗菌的回收菌應不低于70%。

2.4 驗證方法

2.4.1 常規(guī)法 取3個批號的益氣通便顆粒，按常規(guī)法測定每一株菌的實驗菌數(shù)，并分別計算各試驗菌的回收率。結(jié)果表明，大腸埃希菌、枯草芽孢桿菌和白色念珠菌和黑曲霉回收率均大于70%，而金黃色葡萄球菌回收率小于70%[4]，表明益氣通便顆粒對細菌的生長有一定的抑制作用。對霉菌和酵母菌的生長無抑制作用，可采用常規(guī)法進行霉菌和酵母菌測定，采用常規(guī)法進行細菌數(shù)測定檢驗不可行。pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液作為稀釋劑對照組回收率超過70%，表明稀釋劑無抑菌作用，對實驗應無干擾。結(jié)果見表1。

表1 細菌、霉菌及酵母菌的計數(shù)方法常規(guī)法驗證結(jié)果的回收率 (cfu/mL)

2.4.2 培養(yǎng)基稀釋法 根據(jù)常規(guī)法預試驗結(jié)果顯示，益氣通便顆粒對細菌有一定的抑制作用，采用培養(yǎng)基稀釋法(0.2mL/皿)進行進一步試驗[5-6]。結(jié)果表明，金黃色葡萄球菌采用培養(yǎng)基稀釋法回收率為75%，大于70%，表明經(jīng)采用培養(yǎng)基稀釋法(0.2mL/皿)能有效消除益氣通便顆粒對細菌的抑制作用，采用培養(yǎng)基稀釋法(0.2mL/皿)進行細菌計數(shù)測定應可行。結(jié)果見表2。

表2 細菌、霉菌及酵母菌的計數(shù)方法培養(yǎng)基稀釋法驗證結(jié)果的回收率 (cfu/mL)

根據(jù)上述實驗，初步確定益氣通便顆粒細菌計數(shù)方法為培養(yǎng)基稀釋法(0.2mL/皿)，霉菌和酵母菌計數(shù)方法為常規(guī)法。

2.4.3 控制菌檢查方法的驗證[7]試驗組：分別取上述供試液10mL、大腸埃希菌1mL接種到同一100mL的膽鹽乳糖培養(yǎng)基中，移至35℃培養(yǎng)24h左右，取以上培養(yǎng)物0.2mL接種到5mLMUG培養(yǎng)基上，于366nm紫外燈下分別在5h、24h觀察熒光；然后進行靛基質(zhì)試驗。另取培養(yǎng)物接種于曙紅亞甲藍瓊脂培養(yǎng)基上，至35℃培養(yǎng)18～24h，觀察菌落形態(tài)。試驗結(jié)果見表3。

陰性對照組：取上述制好備用的金黃色葡萄球菌1mL接種到100mL的膽鹽乳糖培養(yǎng)基中，方法同試驗組進行檢查。

表3 控制菌的驗證結(jié)果

結(jié)果表明按常規(guī)法檢查，益氣通便顆粒對大腸埃希菌的生長無抑制作用，可采用常規(guī)法進行控制菌的檢查。

根據(jù)上述實驗結(jié)果，益氣通便顆粒微生物限度檢查方法可為：

微生物限度：照微生物限度檢查法(中國藥典2010版一部附錄ⅩⅢC)取本品10g，加pH7.0無菌氯化鈉—蛋白胨緩沖液稀釋至100mL，混勻，作為1∶10的供試液。

細菌數(shù)：取1∶10的供試液1mL注入5個平皿中，平行制備10個平皿，按平皿法測定。

霉菌和酵母菌數(shù)：取1∶10的供試液1mL注入1平皿中，平行制備2平皿，按平皿法測定。

大腸埃希菌:取1∶10的供試液10mL加入100mL膽酸乳糖培養(yǎng)基中，低度法檢查。

細菌數(shù)每1g不得超過1 000cfu，霉菌和酵母菌數(shù)每1g不得超過100cfu，大腸埃希菌每1g不得檢出。

3 討論

益氣通便顆粒對細菌有一定的抑制作用，采用常規(guī)法不能有效消除益氣通便顆粒對細菌的抑制作用，需進一步采用培養(yǎng)基稀釋法進行驗證；通過方法學驗證，本品的細菌、霉菌及酵母菌檢查可采用培養(yǎng)基稀釋法檢驗，控制菌可采用常規(guī)法進行檢驗；另本品對大腸埃希菌無抑菌作用，故控制菌可采用常規(guī)法進行檢驗。通過以上微生物限度檢驗方法的研究，建立了合理可行的檢驗方法，為微生物限度檢測方法的建立提供了有利的依據(jù)。

[1] 國家藥典委員會.中華人民共和國藥典(一部)[S].北京：中國醫(yī)藥科技出版社,2010：附錄ⅧC79-88.

[2] 中國食品藥品檢定研究院．中國藥品檢驗標準操作規(guī)范[M].北京：北京中醫(yī)藥科技出版社,2005:362-403.

[3] 蔣小云，張先文，陶俊鈺．感冒退熱顆粒微生物限度檢查方法學驗證[J]．安徽醫(yī)藥，2008,12(2)：123-125．

[4] 闞秀燕,李妍.4 種中成藥微生物限度檢查法中細菌霉菌(酵母菌)計數(shù)的方法驗證[J].中華中醫(yī)藥學刊,2007(11):14-16.

[5] 劉雅清．板車消炎顆粒微生物限度檢查法的驗證[J]．中國實用醫(yī)藥，2011，6(4)，267-268 ．

[6] 詹云麗.對影響微生物限度檢查結(jié)果若干因素的探討[J].中國藥師,2003,6(6):21-23.

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(責任編輯：李嵐春)

Study on the Method of Microbial Limit Test of Yiqitongbian Grain

Wang Hongshui

(Wuhan Mayinglong Pharmaceutical Group Stock Co.,LTD，Hubei 430064)

Objective:To establish the method of microbial limit test of Yiqitongbian grain.Methods:According to theChinaPharmacopoeia2010 Edition appendix of microbial limit test method test guideline,use the culture medium dilution method and the routine method to determine the microbial limits of Yiqitongbian grain.Results:The recovery of the strain rate was more than 70%,the experimental group were verified by test bacteria in the control bacterium of conventional method;by method validation indicated that bacteria,mil-dew and yeast inspection,medium dilution can be used to control bacteria,mildew and yeast′s inspection of bacteria test,the routine method can be used to check Controling bacteria.Conclusion:The established Yiqitongbian grain of microbial limit test method is accurate,reliable,feasible,and can carry out the measurement of microbial limit for its effective.

Yiqitongbian Grain; The Routine Method; Culture Medium Dilution Method; Method Validation

2014-01-21

王洪水(1971-)，男，湖北馬應龍藥業(yè)集團股份有限公司工程師、執(zhí)業(yè)藥師，研究方向為中藥提取。

R284

A

1673-2197(2014)08-0037-02