鄺穎頤，黃經(jīng)光，彭榮珍，盧俊嫻，陳文靜，蘇雪芳

(1.暨南大學(xué)醫(yī)學(xué)院第六附屬醫(yī)院，廣東 江門 529000；2.江門中醫(yī)藥學(xué)校，廣東 江門 529000)

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三七總皂苷對(duì)血脂異?；颊邇?nèi)皮祖細(xì)胞數(shù)量的影響

鄺穎頤1*，黃經(jīng)光1，彭榮珍2，盧俊嫻1，陳文靜1，蘇雪芳1

(1.暨南大學(xué)醫(yī)學(xué)院第六附屬醫(yī)院，廣東 江門 529000；2.江門中醫(yī)藥學(xué)校，廣東 江門 529000)

目的：觀察三七總皂苷對(duì)血脂異常患者內(nèi)皮祖細(xì)胞(endothelial progenitor cells, EPCs)數(shù)量的影響。方法：將64例血脂異常患者隨機(jī)分為治療組與對(duì)照組各32例，對(duì)照組采取常規(guī)治療，治療組在對(duì)照組基礎(chǔ)上加用血栓通注射液治療，療程為10天。療程結(jié)束后抽取患者外周全血20mL進(jìn)行EPCs培養(yǎng)，運(yùn)用貼壁選擇法，采用流式細(xì)胞術(shù)觀察三七總皂苷對(duì)EPCs數(shù)量的影響。 結(jié)果：三七總皂苷能提高血脂異常患者外周全血EPCs數(shù)量，與對(duì)照組比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。 結(jié)論：三七總皂苷可顯著改善血脂異常患者EPCs的數(shù)量，并通過該途徑保護(hù)心腦血管。

血栓通注射液；血脂異常；內(nèi)皮祖細(xì)胞

血脂異常是導(dǎo)致冠心病、腦血管意外、動(dòng)脈粥樣硬化等重要危險(xiǎn)因素。內(nèi)皮祖細(xì)胞(endothelial progenitor cells, EPCs)是指特異性歸巢于血管新生、血管損傷部位，機(jī)體中存在可分化成內(nèi)皮細(xì)胞的干/祖細(xì)胞，該細(xì)胞具有防治血管成形術(shù)后再狹窄、預(yù)防早期動(dòng)脈粥樣硬化、修復(fù)體內(nèi)血管內(nèi)膜的損傷等作用。相關(guān)研究[1]報(bào)道，血脂異?；颊咄庵苎袃?nèi)皮祖細(xì)胞出現(xiàn)功能受損，且數(shù)量減少。因此，研究有效藥物增加外周血功能EPCs數(shù)量，成為防治冠心病、腦血管意外、動(dòng)脈粥樣硬化等疾病的重要方法。血栓通注射液是由中藥三七經(jīng)提取精制的中成藥注射液，主要成分為三七總皂苷。據(jù)研究[2]表明，三七總皂苷具有改善腦循環(huán)、防治心肌缺血再灌注損傷、抗血栓、抗動(dòng)脈粥樣硬化及降脂肪等作用，但目前研究僅局限于動(dòng)物整體水平和離體器官等研究，尚未深入到分子、細(xì)胞水平，缺乏循證醫(yī)學(xué)支持。觀察血栓通注射液對(duì)血脂異常患者內(nèi)皮祖細(xì)胞功能和數(shù)量的影響，從細(xì)胞水平進(jìn)一步明確血栓通注射液的作用機(jī)制。

1 資料與方法

1.1 納入標(biāo)準(zhǔn)

血脂異?；颊咴\斷標(biāo)準(zhǔn)參照2007年中國成人血脂異常防治指南制定聯(lián)合委員會(huì)制定的《中國成人血脂異常防治指南》。[3]

1.2 排除標(biāo)準(zhǔn)

不符合納入標(biāo)準(zhǔn)者；伴有嚴(yán)重并發(fā)癥；合并患有嚴(yán)重循環(huán)系統(tǒng)、呼吸系統(tǒng)、消化系統(tǒng)等疾??；合并有惡性腫瘤、感染、外科手術(shù)、視網(wǎng)膜病變、外傷等影響內(nèi)皮祖細(xì)胞疾?。凰幬镞^敏及過敏體質(zhì)者；依從性差，不配合治療者。

1.3 一般資料

選取2012年1月—2014年1月我院收治的64例血脂異?；颊咦鳛檠芯繉?duì)象，按住院時(shí)間隨機(jī)分為治療組與對(duì)照組各32例。其中治療組男18例，女14例，年齡41～71歲，平均年齡(55±9)歲，病程11個(gè)月至3年；對(duì)照組男15例，女17例，年齡42～69歲，平均年齡(53±7)歲，病程1～4年。兩組患者的性別、年齡、病程等資料比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性。

1.4 方法

1.4.1 藥物與材料 血栓通注射液(0.25g，廣西梧州制藥(集團(tuán))股份有限公司，批號(hào)13110714)，DiI-ac-LDL(Molecular probe公司)，PBS、Hanks液、ECSG、M199、胰酶、胎牛血清(均購自GIBCO公司)，F(xiàn)ITC-AC133及PE-VEGFR-2(Bender systemTM)，PE-CD34(Caltag Laboratories)，MTT(華美生物工程公司)，VIII因子免疫組化相關(guān)抗原試劑盒(武漢博士德生物工程公司)，VEGF(Peprotech EC公司)，纖維連接蛋白(Roche公司)。

1.4.2 治療方法 對(duì)照組予以常規(guī)治療，治療組在對(duì)照組基礎(chǔ)上給予血栓通注射液450mg，溶于5%葡萄糖注射液或0.9%生理鹽水靜脈滴注，1次/d，療程為10天。療程結(jié)束分別抽取兩組患者空腹全血20mL，對(duì)血中EPCs進(jìn)行培養(yǎng)并分析。

1.4.3 EPCs培養(yǎng) 纖維連接蛋白預(yù)先包被24孔培養(yǎng)皿，取全血20mL分離單個(gè)核細(xì)胞。方法：采用密度梯度離心法，以5×106個(gè)/mL種于培養(yǎng)皿，將1mL含鏈霉素(100U/mL)、青霉素(100U/mL)及胎牛血清(20%)的M199加入每個(gè)培養(yǎng)皿，置培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)環(huán)境為飽和濕度、5%CO2和37℃。3天后添加培養(yǎng)液，洗去未貼壁細(xì)胞，繼續(xù)培養(yǎng)待用[4]。

1.4.4 EPCs鑒定 吸取0.25%的胰酶適量消化培養(yǎng)后的EPCs，并制成單個(gè)細(xì)胞懸液(1×106個(gè)/mL)，加入10μL(1mg/mL)熒光標(biāo)記的AC133、VEGFR-2、VE-Cadherin或CD34，采用流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞中AC133、VEGFR-2、VE-Cadherin、CD34的表達(dá)水平。以2.4μg/mL終濃度加入培養(yǎng)皿DiI-ac-LDL避光與細(xì)胞孵育4h，熒光顯微鏡下觀察洗去培養(yǎng)液后的細(xì)胞熒光指標(biāo)；以同批培養(yǎng)細(xì)胞作為空白對(duì)照組，但不加DiI-ac-LDL，驗(yàn)證培養(yǎng)細(xì)胞吞噬DiI-ac-LDL能力，采用GSC7901(胃癌細(xì)胞株)予陰性對(duì)照。檢測免疫組化法培養(yǎng)細(xì)胞Ⅷ因子相關(guān)抗原的，采用GSC7901予陰性對(duì)照[5]。

1.4.5 EPCs數(shù)量檢測

取各組1/10分離的單個(gè)核細(xì)胞，制成單個(gè)細(xì)胞懸液(1×106個(gè)/mL)，加入熒光標(biāo)記的AC133、CD34各10μL(1mg/mL)，通過流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞AC133、CD34的表達(dá)，運(yùn)用Quest軟件分析計(jì)算雙陽性細(xì)胞。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 EPCs鑒定

洗去碎片及未貼壁細(xì)胞，培養(yǎng)3天后，可見典型細(xì)胞集落：向外擴(kuò)散，外周為紡錘形細(xì)胞，層層疊疊；中間為大量圓形細(xì)胞，略高于培養(yǎng)平面，呈白色半透明，見圖1。流式細(xì)胞儀分析顯示6天后細(xì)胞AC133、VEGFR-2、VE-Cadherin和CD34表達(dá)。熒光顯微鏡檢：多數(shù)細(xì)胞隨培養(yǎng)時(shí)間延長可吞噬DiI-ac-LDL，激發(fā)灰色熒光，見圖2；陰性對(duì)照和空白對(duì)照均無熒光。免疫組化示培養(yǎng)2天后Ⅷ因子相關(guān)抗原為陽性，呈棕色胞漿，陰性對(duì)照和空白對(duì)照均不顯棕色。

圖1 細(xì)胞集落(×100)

圖2 細(xì)胞吞噬DiI-ac-LDL(×200)

2.2 血栓通注射液對(duì)全血EPCs數(shù)量的影響

與對(duì)照組相比，血栓通注射液能夠增加EPCs數(shù)量，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

表1 血栓通注射液對(duì)全血EPCs數(shù)量的影響 個(gè)/mL)

注：與對(duì)照組比較，*P<0.05。

3 討論

血脂異?；颊哐逯衞x-LDL過高可誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞的氧化損傷甚至凋亡，從而導(dǎo)致內(nèi)皮功能障礙。因此血脂異常為冠心病、腦血管意外、動(dòng)脈粥樣硬化等心腦血管疾病的重要致病因素。相關(guān)研究報(bào)道[6]，損傷內(nèi)皮的再內(nèi)皮化可有效減少新內(nèi)膜厚度和平滑肌細(xì)胞增殖，而再內(nèi)皮化過程需EPCs的參與。

EPCs作為內(nèi)皮細(xì)胞的同一譜系，其功能和數(shù)量同樣受到血脂異常的影響，主要作用機(jī)制為：ox-LDL影響EPCs的動(dòng)員及分化；ox-LDL參與EPCs的凋亡過程；ox-LDL直接損傷EPCs。提示通過治療手段提高血脂異?；颊咄庵苎蠩PCs數(shù)量，能有效降低血脂異?；颊甙l(fā)生冠心病、腦血管意外、動(dòng)脈粥樣硬化等并發(fā)癥概率。

血栓通注射液為傳統(tǒng)中藥材三七經(jīng)提取工藝精制而成的中成藥注射液，主要成分為三七總皂苷。現(xiàn)代藥理研究表明血栓通注射液作用機(jī)制可能通過減少骨髓基質(zhì)細(xì)胞RANKL表達(dá)，增加OPG表達(dá)[7]。實(shí)驗(yàn)研究證明，三七總皂苷可顯著提高血脂異?；颊咄庵苎蠩PCs數(shù)量，從細(xì)胞水平上為三七總皂苷作用心腦血管途徑提供了新的理論依據(jù)，具有極大意義。

[1] 季亢挺，張懷勤，李海鷹，等.高膽固醇血癥患者外周血內(nèi)皮細(xì)胞的變化及丹參的保護(hù)作用[J].中華中醫(yī)藥學(xué)刊,2007,25(6):1173-1175.

[2] 陳劍梅，郭潔文.三七總皂苷對(duì)心腦血管作用的藥理研究新進(jìn)展[J].今日藥學(xué),2011,21(7):389-392.

[3] 中國成人血脂異常防治指南制訂聯(lián)合委員會(huì).中國成人血脂異常防治指南[J].中華心血管病雜志,2007,35(5):390-419.

[4] 季亢挺，張懷勤，唐積肥，等，丹參對(duì)高膽固醇血癥患者內(nèi)皮祖細(xì)胞數(shù)量及功能的影響[J].中國中藥雜志,2007,32(12):1214-1217.

[5] WERNER N, JUNK S, LAUFS U, et al. Intravenous transfusion of endothelial progenitor cells reduces neointima formation after vascular injury[J]. Circulation Res,2003,93(2):e17.

[6] GRIESE D P, EHSAN A, MELO L G, et al.Isolation and transplan-tation of autologous crculating endothelial cells into denuded vessels and prosthetic grafts：implications for cell-based vascular therapy[J]. Circulation,2003,108(21):2710.

[7] 王云國，劉東昕，王虎，等.三七總皂甙對(duì)大鼠骨髓基質(zhì)細(xì)胞OPG/RANKL表達(dá)比的影響[J].今日藥學(xué),2012,22(8):456-459.

(責(zé)任編輯：李嵐春)

2014-05-08

鄺穎頤，女，廣東省江門市暨南大學(xué)醫(yī)學(xué)院第六附屬醫(yī)院主管藥師，研究方向?yàn)榕R床藥學(xué)。

R589.2

A

1673-2197(2014)16-0090-02