武俊紫，牛世偉，李 燕*

(1.昆明理工大學 生命科學與技術學院，云南 昆明 650504；2.云南省第一人民醫(yī)院 干部保健科，云南 昆明 650036)

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艾塞那肽對非酒精性脂肪肝病大鼠總蛋白及總膽紅素改善作用研究

武俊紫1,2，牛世偉2，李 燕2*

(1.昆明理工大學 生命科學與技術學院，云南 昆明 650504；2.云南省第一人民醫(yī)院 干部保健科，云南 昆明 650036)

目的：探討艾塞那肽對高脂誘導非酒精性脂肪肝病大鼠(Non-alcoholic fatty liver disease，NAFLD)肝臟切片HE染色、肝臟占大鼠體重百分比、大鼠體重、總膽紅素(TBIL)以及總蛋白(TP)的影響。方法：將100只大鼠隨機分為空白對照組(CON)、模型對照組(HFD)和艾塞那肽低、中、高(ELD、EMD、EHD)劑量治療組，每組各20只。HFD、ELD、EMD和EHD組均采用灌胃法建立SD大鼠NAFLD模型，12周造模成功后，ELD、EMD和EHD治療組分別給予艾塞那肽1μg、2μg和4μg，每天治療1次；HFD組給予生理鹽水輔助治療，CON組不加以任何干預。分別于治療第4周、第8周后處死大鼠各半，觀察相關指標改善情況。結果：治療后ELD、EMD和EHD組大鼠肝臟切片HE染色無任何脂滴浸潤現(xiàn)象，大鼠肝臟占體重百分比呈現(xiàn)出明顯的下降(P<0.05)，大鼠的體重、總膽紅素和總蛋白含量也明顯改善。結論：艾塞那肽可明顯降低非酒精性脂肪肝病大鼠肝臟脂肪含量，總膽紅素和總蛋白含量也均得到明顯改善。

艾塞那肽；非酒精性脂肪肝；大鼠；總蛋白；總膽紅素

肝臟為人體內(nèi)最重要的代謝器官之一[1]，主要負責糖、脂肪、蛋白質(zhì)及維生素等物質(zhì)代謝，同時還擔負著解毒、膽汁分泌、免疫及凝血等生理生化功能。由于生活習慣或基因的影響，腹部脂肪沉積，造成脂肪在肝臟細胞內(nèi)過量堆積，從而導致非酒精性脂肪肝病(Non-alcoholic fatty liver disease，NAFLD)[2]。艾塞那肽為胰高血糖素類似物，在體內(nèi)可明顯提高胰島素含量，且無血糖依賴性[3]。根據(jù)非酒精性脂肪肝模型大鼠試驗，測定艾塞那肽對大鼠總蛋白和總膽汁酸的干預作用，探討艾塞那肽對非酒精性脂肪肝病的治療效果。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗分組 雄性SD大鼠100只，體重為160～180g。在適應性喂養(yǎng)2周后隨機分為空白對照組(CON)、模型對照組(HFD)及艾塞那肽低、中、高(ELD、EMD、EHD)劑量治療組，每組各20只。SD大鼠、基礎飼料及飼養(yǎng)墊料均由昆明醫(yī)科大學動物實驗部提供。

1.1.2 高脂溶液配制 高脂溶液的化學成分為97%豬油、2%膽固醇與1%膽酸鈉，大鼠灌胃量為每100g大鼠體重灌1mL高脂溶液，每天早上灌胃1次。

1.1.3 藥品與試劑 膽固醇(北京鼎國生物技術公司)；膽酸鈉(上海金穗生物公司)；豬油；艾塞那肽；總膽紅素、直接膽紅素和間接膽紅素(酶法)、總蛋白、白蛋白和球蛋白(酶法)試劑盒，均購自南京建成生物工程研究所。

1.2 方法

1.2.1 非酒精性脂肪肝模型的建立 空白對照組全程只喂食普通飼料，模型對照組與艾塞那肽組給予高脂溶液灌胃12周，促使NAFLD模型的形成。造模成功后， 艾塞那肽低、中、高劑量治療組分別給予艾塞那肽1μg、2μg和4μg治療，分別于治療第4周和第8周處死大鼠各半，測定相應指標。

1.2.2 血清采集 大鼠稱重后采用腹腔內(nèi)注射3%水合氯醛2mL麻醉；麻醉后，大鼠四肢及頭部固定在解剖臺，無菌操作暴露腹腔，于心臟迅速取血；血液分裝于1.5mL的離心管內(nèi)離心(5000r/s)，分離取上清液于-86℃保存，取出肝臟稱重后放入超低溫冰箱儲存。

1.3 統(tǒng)計學處理

2 結果

2.1 肝臟切片HE染色

CON組無任何脂滴浸潤現(xiàn)象，HFD組有不同程度的細胞變性及脂肪空泡，4周時治療組脂肪空泡明顯減少；8周時治療組脂肪空泡進一步減少，且EMD和EHD組看不到任何脂肪空泡。具體見圖1。

2.1 大鼠肝臟比例對比

對各組大鼠處死前其肝臟重量與大鼠體重進行比較，其中以模型對照組所占比例最高，空白對照組比例最低。治療4周后，艾塞那肽低、中劑量組相比于模型組有一定的降低(P>0.05)，艾塞那肽高劑量組與模型對照組比較差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；治療8周后，艾塞那肽治療組與模型組相比均明顯下降，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。詳見表1。

圖1 肝臟切片HE染色

表1 處死大鼠時大鼠肝臟所占比例對比

注：與模型組相比，*P<0.05。

2.2 治療前后大鼠體重比較

治療開始時各組大鼠體重均無明顯差異，從第2周開始空白組和模型組大鼠體重增長，艾塞那肽低劑量組與模型組相比有一定的降低(P>0.05)；從第6周開始中劑量組與模型組相比，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；從第4周開始高劑量組和模型組相比，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

表2 治療前后各組大鼠體重對比

注：與模型組相比，*P<0.05。

2.3 大鼠血清膽堿酯酶、膽紅素比較

治療4周后，艾塞那肽治療組血清中總膽紅素、直接膽紅素以及間接膽紅素均得到了改善，幾乎恢復正常水平(P<0.01)，詳見表3。從第4周開始，血清總膽紅素、直接膽紅素以及間接膽紅素呈下降趨勢，治療8周后與空白對照組比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。詳見表4。

表3 治療4周大鼠膽堿酯酶、膽紅素的各組比較

注：與模型組相比，*P<0.01。

2.4 大鼠血清總膽汁酸、總蛋白、白蛋白及球蛋白比較

艾塞那肽治療4周后治療組與模型組相比，血清總蛋白、白蛋白及球蛋白有一定的降低，詳見表5。 治療8周后，治療組艾塞那肽血清總蛋白、白蛋白以及球蛋基本維持第4周水平，比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05),詳見表6。

表4 治療8周大鼠膽堿酯酶、膽紅素的各組比較

注：與模型組相比，*P<0.05。

表5 治療4周大鼠總膽汁酸、總蛋白、白蛋白及球蛋白比較

注：與模型組相比，*P<0.05。

表6 治療8周大鼠總膽汁酸、總蛋白、白蛋白及球蛋白比較

注：與模型組相比，*P<0.05。

3 結論

目前隨著肥胖、糖尿病及其它相關代謝綜合征在全球的流行，NAFLD已成為我國乃至世界最為流行的慢性肝病之一[4]。一般而言，NAFLD大多數(shù)患者沒有典型癥狀，但如果任由其繼續(xù)發(fā)展，可能會出現(xiàn)疲乏、食欲不振、腹脹、噯氣、肝區(qū)脹滿等癥狀[5]，甚至發(fā)展為失代償期肝硬化、肝細胞癌等[6]。近些年NAFLD的相關研究廣受醫(yī)學界的重視，但至今為止仍未發(fā)現(xiàn)治療NAFLD的特效藥物，因此尋找有效的NAFLD治療藥物乃當前醫(yī)學界研究的熱點。

有文獻報道，高脂飼料喂養(yǎng)的NAFLD模型大鼠體重顯著高于普通飼料所喂養(yǎng)的大鼠[7]，但可能存在個別現(xiàn)象影響造模效果，因此實驗大鼠造模采用高脂溶液灌胃方法，模型組大鼠體重明顯低于空白組，可能是由于艾塞那肽具有明顯的脂質(zhì)代謝作用。本實驗采用高脂飲食灌胃SD大鼠成功建立NAFLD模型，模型組肝臟重量與大鼠體重百分比第8周時高達(3.0%±0.2%)，超過空白組的(2.5%±0.2%)，表明脂肪顆粒已經(jīng)大量附著在肝細胞。采用艾塞那肽治療后，8周后其肝臟切片可達到正常水平，肝臟所占大鼠體重百分比與模型組比較差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，表明艾塞那肽可明顯減少NAFLD肝臟中沉積的脂肪顆粒，起到保護肝臟的作用。

總膽紅素是用來診斷肝臟或膽道是否發(fā)生異常的一個重要指標[8]。血清膽紅素的升高，表明肝細胞處理、膽紅素的排泄發(fā)生障礙。總膽紅素由直接膽紅素和間接膽紅素構成，間接膽紅素經(jīng)肝臟代謝又可變?yōu)橹苯幽懠t素，隨膽汁排入膽道，最后經(jīng)大便排出。肝細胞受損后，直接膽紅素不能排入腸道，導致體內(nèi)直接膽紅素偏高[9]。本研究發(fā)現(xiàn)，模型組大鼠血清總膽紅素、間接膽紅素及直接膽紅素與空白對照組相比明顯升高，艾塞那肽治療第4周時改變明顯(P<0.05)，提示艾塞那肽具有改善肝臟代謝功能，有助于膽紅素代謝恢復正常；但治療第8周后血清總膽紅素呈明顯的下降趨勢，且低于空白對照組?？偟鞍资怯砂椎鞍缀颓虻鞍捉M成，慢性肝病及一些慢性感染類疾病會造成總蛋白略微偏高。本研究結果證明非酒精性脂肪肝病發(fā)生時，血清總蛋白、白蛋白及球蛋白均有略微升高，經(jīng)艾塞那肽治療后，可得到改善。

綜上所述，艾塞那肽可明顯降低非酒精性脂肪肝病大鼠肝臟脂肪含量，對總膽紅素和總蛋白均具有明顯的改善作用。

[1] BRIOHNY W，SMITH, LEON A，ADAMS. Non-alcoholic fatty liver disease[J].Critical Reviews in Clinical Laboratory Sciences,2011,8(3):97-113.

[2] SUBRAMANYAM D, SUBBAIAH KV, RAJENDRA W, et al.Serum selenium concentration and antioxidant activity in cervical cancer patients before and after treatment[J].Exp Oncol. 2013,5(2):97-100.

[3] LM，ALBA, K LINDOR.Non-alcoholic fatty liver disease[J].Alimentary Pharmacology & Therapeutics，2003,7(8):977-986.

[5] TARANTINO G, FINELLI C.What about non-alcoholic fatty liver disease as a new criterion to define metabolic syndrome[J].World J Gastroenterol,2013,19(22):3375-3384.

[6] ANIL ARORA,PRAVEEN SHARMA.Non-invasive Diagnosis of Fibrosis in Non-alcoholic Fatty Liver Disease[J].Journal of Clinical and Experimental Hepatology,2012,2(2):145-155.

[7] ARON M, LEROYER AS, MAJD Z,et al.PPARα activation differently affects microparticle content in atherosclerotic lesions and liver of a mouse model of atherosclerosis and NASH.[J].Atherosclerosis,2011,18(1):69-76.

[8] KWAK MS, KIM D, CHUNG GE, et al.Serum bilirubin levels are inversely associated with nonalcoholic fatty liver disease[J].Clin Mol Hepatol,2012,18(4):383-390.

[9] JANG BK.Elevated serum bilirubin levels are inversely associated with nonalcoholic fatty liver disease[J].Clin Mol Hepatol，2012，18(4):357-359.

(責任編輯：李嵐春)

Research Exenatide to Total Protein and Total Bilirubin of Nonalcoholic Fatty Liver Disease in Rats

Wu junzi1,2,Huang Hong2, Liu Hua2,Li Yan2*

(1.College of Life Science and Technology , Kunming University of Science and Technology,Kunming Yunnan 650504;2. Cadre Health Care of The First People's Hospital of Yunnan Province, Kunming Yunnan 650031)

Objective:Discuss exenatide on fat-induced non-alcoholic fatty liver disease(NAFLD) in rats, rat body weight, total bilirubin (TBIL) and total protein (TP).Methods:Rats were divided into control group (CON), model group (HFD), and exenatide low, medium and high (ELD, EMD and EHD) dose group, HFD group and the treatment group with exenatide NAFLD model established gavage SD rats, 12 weeks after successful modeling, ELD, EMD and EHD groups were given exenatide 1μg, 2μg and 4μg once daily, HFD group received its saline adjuvant therapy, CON group did not impose any interference, after 4 and 8 weeks the rats were sacrificed and female, observed improvement related indicators.Results:Rat liver after treatment exenatide HE staining ELD, EMD and EHD groups treatment groups do not see any infiltration of lipid droplets, the percentage of rat liver showing a significant decrease in body weight(P<0.05), another exenatide may also be significantly improve rat body weight, total bilirubin and total protein content.Conclusion:Exenatide for non-alcoholic fatty liver disease in rat liver fat content, total bilirubin and total protein with significant improvement.

Exenatide; Nonalcoholic Fatty Liver Disease; Rat; TP；TBIL

2014-04-22

云南省科技廳-昆明醫(yī)科大學聯(lián)合專項基金項目(2011FB225)

武俊紫(1986-)，男，昆明理工大學生命科學與技術學院碩士研究生，研究方向為脂肪肝、糖尿病等代謝性疾病。

李燕(1961-)，女，教授，云南省第一人民醫(yī)院干部保健科主任醫(yī)師，研究方向為老年病、神經(jīng)相關以及代謝性疾病。E-mail: liyanken@126.com。

R977.6;R575.5

A

1673-2197(2014)16-0006-03