王鳳寬 杜 舟 王傳海 李湘秦 吳 勇

（深圳市公安局刑事科學技術研究所 廣東 深圳 518040）

葡萄皮DNA檢驗

王鳳寬 杜 舟 王傳海 李湘秦 吳 勇

（深圳市公安局刑事科學技術研究所 廣東 深圳 518040）

葡萄皮作為較少見生物物證的一種，在犯罪現(xiàn)場時有發(fā)現(xiàn)并提取，由于葡萄皮上附有的人口腔脫落細胞DNA含量較低并存在多種PCR擴增抑制因素，熒光STR檢測成功率較低。對在入室盜竊案現(xiàn)場發(fā)現(xiàn)的葡萄皮用骨骼裂解液裂解提取，并用QIAquickRPCR Purification Kit硅膠膜過柱法富集純化DNA，獲得理想STR分型結果并通過DNA數(shù)據(jù)庫比中嫌疑人，從而通過對葡萄皮DNA的成功檢驗在案件偵破、訴訟中發(fā)揮重要作用。

葡萄皮 STR QIAquickRPCR Purification Kit硅膠膜過柱法

1 案例資料

1.1 簡要案情

2012年9月26日，居住在深圳市光明新區(qū)光明街道辦事處新陂頭村籃球場旁出租屋的廣西人覃××報案稱，當日18時30分許下班回到住處發(fā)現(xiàn)被盜，現(xiàn)場勘查了解覃××家中冰箱內的一串葡萄不見了，室內地上有散在的懷疑為嫌疑人吃葡萄后丟棄的紫色葡萄皮，技術人員收集提取葡萄皮送檢。

1.2 DNA提取及檢驗

取干凈剪刀、鑷子，將完整一個吃剩的葡萄皮剪碎，裝入1.5ml Eppendorf管，加入260ul骨骼裂解液（Bone Incubation Buffer，美國Promega公司），30ul 20mg/ml蛋白酶K，10ul 1M DTT，震蕩10sec充分混勻，56℃消化1h，期間震蕩1-2次，每次10sec。瞬時離心，取 3ul用 AmpFLSTRRIdentifilerRPlus試劑盒（AB公司，美國）直接擴增，余消化液和載體通過吊籃式離心去除載體轉移收集消化液至新的1.5ml Eppendorf管中備用。

用德國QIAGEN公司QIAquickRPCR Purification Kit純化試劑盒進行純化濃縮。

加入5倍體積的Buffer PB（Binding buffer） 至含消化液的1.5mlEppendorf管中，震蕩混勻；取一個新的帶有2ml收集管（2ml collection tube）的純化柱（QIAquickRSpin Column），吸取700ul混合液至純化柱，8000rmp離心1min，丟棄已濾過的液體（管不換）；重復此操作直到混合液全部濾過；吸取700ul已配無水乙醇的Buffer PE（Wash buffer）至純化柱，13000rmp、1min離心洗滌1次，丟棄收集管中已濾過的液體；吸取80%乙醇700ul至純化柱，13000rmp、1min離心洗滌1次，丟棄收集管中已濾過的液體；再以13000rmp離心3min，甩干殘余液體后把純化柱放置于新的1.5ml Eppendorf管上，打開純化柱蓋子室溫揮發(fā)2min；將已在65℃預熱的Buffer EB（Elution buffer） 30ul直接加入到純化柱的硅膠膜，65℃孵育2min，13000rmp離心2min，收集于1.5ml Eppendorf管，取3ul用AmpFLSTRRIdentifilerRPlus試劑盒擴增（AB公司，美國），3130xl型遺傳分析儀（AB公司，美國）電泳，GeneMapperID V3.2分析判型。

1.3 數(shù)據(jù)庫比對和結果判定未純化濃縮前的樣品直接擴增未檢出STR分型。用QIAquickRPCR Purification Kit純化試劑盒純化濃縮后樣品檢出STR分型。

分型結果錄入全國DNA數(shù)據(jù)庫后與2011年12月9日光明新區(qū)公明街道塘尾面前嶺1排8棟的潘××被盜竊案的現(xiàn)場煙頭通過DNA串并案，并比中廣西壯族自治區(qū)河池市羅城仫佬族自治縣東門鎮(zhèn)的前科人員吳×福。

2 討論

由于葡萄皮本身面積太小，為吸附性載體，上面附有的少量口腔上皮脫落細胞不宜用棉簽、紗布等擦拭轉移，直接消化應為較好選擇。葡萄皮的主要成分為纖維素、果膠質、鐵等，葡萄皮呈紫色是因為葡萄皮含有花青素。經骨骼裂解液的消化裂解后，葡萄皮成為糊狀，釋放出有機酸等物質抑制PCR反應，消化液顏色變?yōu)榱俗仙?，需要濃縮富集DNA。直接取裂解后的3ul DNA溶液用AmpFLSTRRIdentifilerRPlus試劑盒擴增未檢出結果，說明葡萄皮含有的色素、經骨骼裂解液消化裂解后產生的有機酸及其他成分對擴增有抑制作用。故選擇合適的純化濃縮方法成為葡萄皮上DNA檢驗能否成功的關鍵因素。

德國QIAGEN公司的QIAquickRPCR Purification Kit純化試劑盒原用于純化片段大小在100bp-10kb之間的PCR擴增產物，最大處理量為10ug以便于后期測序。通過法醫(yī)DNA檢驗測試，該純化試劑盒在PCR擴增前對疑難微量檢材、陳舊骨骼牙齒樣本等的擴增前純化濃縮也取得了很好的效果，由于該純化試劑盒完全手工操作，不需要大型昂貴儀器設備，在全國公安法醫(yī)DNA實驗室應用廣泛。通過方便的結合-洗滌-洗脫步驟可快速純化目標DNA片段，先將已消化裂解的DNA樣本加入5倍體積的Buffer PB、混勻，以增強濾過時目標DNA與純化柱硅膠膜的充分完全結合，通過離心初步去除DNA樣本中的雜質、抑制劑，再通過Buffer PE（試劑瓶中55ml的Buffer PE使用前預先加入220ml的無水乙醇并混勻后方可使用）、80%乙醇洗滌去除附在硅膠膜上的少量殘余雜質、抑制劑，此時硅膠膜上只結合有純凈的目標DNA，然后再通過已在65℃預熱的30ul Buffer EB從硅膠膜柱上充分完全洗脫下來擴增備用。

葡萄皮作為非傳統(tǒng)生物物證在犯罪現(xiàn)場由于體量小較少有被發(fā)現(xiàn)和提取，而且因為STR檢出成功率較低，國內外報道不多，本文由于現(xiàn)場勘查時及時發(fā)現(xiàn)并提取送檢，采用了純化濃縮DNA效果較好的QIAquickRPCR Purification Kit硅膠膜過柱法處理檢材，得到正確STR分型結果，并通過DNA數(shù)據(jù)庫串并案件和直接比中犯罪嫌疑人，發(fā)揮了重要作用。

2012.9.26深圳市光明新區(qū)新陂頭村入室盜竊案葡萄皮STR分型結果

[1] 凃政，劉志芳，陳松，等.牙齒的DNA提取及STR分型研究[J].刑事技術，2007，（5）.

[2]百度百科[EB/OL].http://baike.baidu.com/view/ 1624883.htm，2013-6-20.

[3]郭麗萍，劉建興，李楨，等.復合擴增云南明朝古尸DNA分析[J].昆明醫(yī)學院學報，2009，（3）.

（責任編輯：于 萍）

D919

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2013-11-22

王鳳寬（1975-），男，河南臺前人，深圳市公安局刑事科學技術研究所副主任法醫(yī)師，碩士，主要從事法醫(yī)學研究。