黃丹丹，周海媚，李 謠，杜木英，2*

（1.西南大學(xué) 食品科學(xué)學(xué)院，重慶 400716；2.西南大學(xué) 食品科學(xué)學(xué)院國(guó)家食品科學(xué)與工程實(shí)驗(yàn)教學(xué)示范中心，重慶 400716）

苦蕎營(yíng)養(yǎng)價(jià)值極高，含有豐富的蛋白質(zhì)、脂肪、維生素和礦物質(zhì)等，更主要的是含有豐富的黃酮類和多酚類化合物，具有很好的抗氧化活性[1-9]。紅曲霉的應(yīng)用在我國(guó)有悠久的歷史，長(zhǎng)期以來(lái)被廣泛應(yīng)用于食品著色、釀酒及制醋上。紅曲霉代謝產(chǎn)生的抑菌物質(zhì)、酶類、Monacolin K和麥角固醇等多種生理活性物質(zhì)，具有降低血清膽固醇、抑菌、防癌等保健功效[10-14]，而且紅曲味甘、性溫，可消食活血、健脾燥胃。

本研究利用前期實(shí)驗(yàn)結(jié)果，以苦蕎和糯米為主要原料，經(jīng)紅曲、酵母發(fā)酵研制成苦蕎紅曲保健酒，為研究其抗氧化功能，測(cè)定了苦蕎紅曲保健酒中總黃酮、總酚的含量，研究了其體外抗氧化能力，并與普通市售黃酒、VC、水溶性維生素E（Trolox）進(jìn)行對(duì)比，同時(shí)分析了總黃酮、總酚含量與抗氧化能力之間的相關(guān)性，以期為苦蕎紅曲保健酒的開(kāi)發(fā)與深加工提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

苦蕎紅曲保健酒：西南大學(xué)食品科學(xué)學(xué)院實(shí)驗(yàn)室自制；黃酒：市售紹興會(huì)稽山五年陳釀黃酒；1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）、2,2-聯(lián)氮-二（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）二銨鹽（2,2'-azinobis-（3-ethylbenzthiazoline-6-sulphonate），ABTS）、2,4,6-三 吡 啶基三嗪（2,4,6-tripyridyl-triazine，TPTZ）、Trolox 均為分析純：美國(guó)Sigma公司；蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品、沒(méi)食子酸：中國(guó)藥品生物制品檢定所；福林酚：北京索萊寶科技有限公司；VC、濃鹽酸、氫氧化鈉、亞硝酸鈉、硝酸鋁、硫酸亞鐵、三氯化鐵、冰乙酸、乙酸鈉、無(wú)水乙醇、過(guò)硫酸鉀、碳酸鈉均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

FA1004A型分析天平：上海精天電子儀器有限公司；HHS型電熱恒溫水浴鍋：上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；PHS-3C型pH計(jì)：上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司；UV-1240型紫外分光光度計(jì)：日本島津公司。

1.3 方法

1.3.1 苦蕎紅曲保健酒的制備

苦蕎和糯米原料配比為1∶1.5，糯米蒸熟攤涼后與苦蕎混勻，按質(zhì)量分?jǐn)?shù)添加0.6%甜酒曲，于28 ℃糖化2 d后，再添加1‰酵母和12%的紅曲，于28 ℃發(fā)酵6 d。經(jīng)壓榨、煎酒后即得苦蕎紅曲保健酒。

1.3.2 總黃酮的測(cè)定[15]

（1）樣品的制備[16]

移取10 mL混合均勻的樣液到100 mL燒杯中，以0.1 mol/L NaOH調(diào)pH值至中性，再多加2滴，移入100 mL容量瓶中，用水定容至刻度，搖勻，備用。

（2）蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

準(zhǔn)確稱取在105 ℃干燥至質(zhì)量恒定的蘆丁20 mg置于100 mL容量瓶中，用體積分?jǐn)?shù)30%乙醇定容至刻度，搖勻。即得蘆丁質(zhì)量濃度0.2 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)品溶液。分別取上述蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液0、1 mL、2 mL、3 mL、4 mL、5 mL于10 mL具塞比色管中，加入0.3 mL 5%亞硝酸鈉溶液，靜置6 min，加入0.3 mL 10%硝酸鋁溶液，靜置6 min，加入2 mL 4%氫氧化鈉溶液，混勻后，加入體積分?jǐn)?shù)30%乙醇至刻度，放置15 min后于510 nm波長(zhǎng)處測(cè)吸光度值。以吸光度值為縱坐標(biāo)，蘆丁質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)繪制蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到線性回歸方程：y=10.611x+0.003 1（R2=0.999 8）。

（3）樣液測(cè)定

取2 mL樣液2等份，分別置于10 mL具塞比色管中，加入0.3 mL 5%亞硝酸鈉溶液，靜置6 min，加入0.3 mL 10%硝酸鋁溶液，靜置6 min，加入2 mL 4%氫氧化鈉溶液，混勻后，加入體積分?jǐn)?shù)30%乙醇至刻度，放置15 min后于510 nm波長(zhǎng)處測(cè)吸光度值（以不加硝酸鋁作為空白）。

1.3.3 總酚的測(cè)定[17]

（1）沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：稱取0.500 g沒(méi)食子酸用水定容于100 mL容量瓶中，制得5 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)酚溶液，分別吸取0、0.3 mL、0.6 mL、0.9 mL、1.2 mL、1.5 mL標(biāo)準(zhǔn)酚溶液于100 mL容量瓶中，用水定容，則酚質(zhì)量濃度依次為0 μg/mL、15 μg/mL、30 μg/mL、45 μg/mL、60 μg/mL、75 μg/mL。分別從其中吸取1 mL標(biāo)準(zhǔn)溶液，加4 mL水補(bǔ)至5 mL，再加入0.5 mL福林酚，充分搖勻30 s后，加入1 mL 7.5%碳酸鈉溶液，45 ℃條件下反應(yīng)15 min后，在765 nm波長(zhǎng)處測(cè)吸光度值，以沒(méi)食子酸質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，吸光度值為縱坐標(biāo)繪制沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到線性回歸方程：y=0.079 6x+0.007 8（R2=0.999 0）。

（2）樣液測(cè)定：實(shí)驗(yàn)組加樣液0.05 mL、4.95 mL去離子水，空白組為5 mL水，向各管中加入0.5 mL福林酚，充分搖勻，30 s后加入1 mL 7.5%碳酸鈉溶液，45 ℃反應(yīng)15 min，在765 nm波長(zhǎng)處測(cè)吸光度值。

1.3.4 抗氧化活性的測(cè)定

（1）DPPH自由基清除率的測(cè)定[18]：稱取0.007 9 g DPPH標(biāo)準(zhǔn)品，用無(wú)水乙醇溶解后定容至100 mL容量瓶中，配制得0.2 mmol/L DPPH溶液，同時(shí)配制不同濃度梯度的樣液（無(wú)水乙醇稀釋）。吸取0.1 mL樣品溶液，加入3.9 mL DPPH溶液，暗處避光30 min后于517 nm波長(zhǎng)處測(cè)吸光度值A(chǔ)1，用無(wú)水乙醇作參比。同時(shí)測(cè)定0.1 mL 無(wú)水乙醇與3.9 mL DPPH溶液混合后的吸光度值A(chǔ)2，以及0.1 mL樣品溶液與3.9 mL無(wú)水乙醇混合后的吸光度值A(chǔ)3，按以下公式計(jì)算DPPH自由基清除率，同時(shí)用紹興黃酒、0.4 mg/mL VC和0.8 mg/mL Trolox作對(duì)比。

（2）ABTS自由基清除率的測(cè)定[19]：將等量的7 mmol/L ABTS溶液與2.45 mmol/L過(guò)硫酸鉀水溶液混合避光放置12～16 h。用無(wú)水乙醇將該溶液稀釋至其在波長(zhǎng)為734 nm處吸光度為0.7±0.02，得到ABTS自由基工作液（現(xiàn)配現(xiàn)用），同時(shí)制備不同濃度梯度的樣液（乙醇稀釋）。吸取0.15 mL樣品溶液，加入2.85 mL ABTS自由基工作液，暗處避光10 min后734 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度值A(chǔ)1，以無(wú)水乙醇為參比。同時(shí)測(cè)定0.15 mL無(wú)水乙醇與2.85 mL ABTS自由基工作液混合后的吸光度值A(chǔ)2，ABTS自由基清除率計(jì)算公式如下，同時(shí)用紹興黃酒、0.4mg/mL VC和0.8 mg/mL Trolox作對(duì)比。

（3）FRAP值的測(cè)定[20]：將300 mmol/L 醋酸鈉緩沖溶液（pH 3.6）、10 mmol/LTPTZ鹽酸溶液（鹽酸濃度40 mmol/L）、20 mmol/L FeCl3溶液按照10∶1∶1（V/V）混合制得FRAP工作液（現(xiàn)配現(xiàn)用）。

FeSO4標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：配制不同濃度的FeSO4溶液（0、0.1 mmol/L、0.2 mmol/L、0.4 mmol/L、0.6 mmol/L、0.8 mmol/L、1.0 mmol/L），吸取0.1 mL不同濃度FeSO4溶液，加入2.9 mL FRAP工作液，混勻，于37 ℃恒溫水浴10 min后在593 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度值，以蒸餾水為參比。以吸光度值為縱坐標(biāo)，F(xiàn)eSO4溶液濃度為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到線性回歸方程：y=0.754 2x+0.076 8（R2=0.999 6）。

樣品的測(cè)定：配制不同濃度梯度的樣液，吸取0.1 mL不同濃度樣品溶液，加入2.9 mL FRAP工作液中，混勻，于37 ℃恒溫水浴10 min后在593 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度值，以蒸餾水為參比。樣品抗氧化能力以FeSO4濃度（即FRAP值）表示，同時(shí)用紹興黃酒、0.4mg/mL VC和0.8 mg/mL Trolox作對(duì)比。

1.3.5 數(shù)據(jù)處理

所有的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)都是3次實(shí)驗(yàn)的平均值，應(yīng)用Excel和SPSS 18.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，用Origin 8.6軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 總黃酮和總酚含量的測(cè)定結(jié)果

通過(guò)比色法測(cè)得苦蕎紅曲保健酒的吸光度值，由標(biāo)準(zhǔn)曲線相關(guān)方程得到總黃酮和總酚含量分別為1 011.02 μg/mL、1 569.80 μg/mL；市售黃酒的總黃酮和總酚含量為78.06 μg/mL、778.87 μg/mL。

2.2 DPPH自由基清除能力的測(cè)定

DPPH自由基是一種很穩(wěn)定的自由基，在乙醇溶劑中呈紫色，在517 nm波長(zhǎng)處有最大吸收峰，當(dāng)有自由基清除劑存在時(shí)，DPPH自由基的單電子被配對(duì)使其吸收逐漸消失，顏色變淺，且褪色程度與其接受的電子數(shù)成化學(xué)計(jì)量關(guān)系。因此，可以根據(jù)反應(yīng)液在最大吸收波長(zhǎng)處吸光度的大小來(lái)評(píng)價(jià)被測(cè)樣品抗氧化能力的強(qiáng)弱，吸光度值越小，被測(cè)樣品的抗氧化能力越強(qiáng)[21]。結(jié)果見(jiàn)圖1。

圖1 各樣品對(duì)DPPH自由基的清除作用Fig.1 Scavenging effect of each sample on DPPH free radicals

從圖1可以看出，苦蕎紅曲酒、紹興黃酒、VC和Trolox對(duì)DPPH自由基均具有一定的清除能力，且苦蕎紅曲酒對(duì)DPPH自由基的清除能力明顯高于Trolox、VC和紹興黃酒。各樣品對(duì)DPPH自由基的清除能力隨著用量的增加而上升，其中苦蕎紅曲酒和Trolox對(duì)DPPH自由基的清除能力隨用量變化的增效明顯，而VC和紹興黃酒的各濃度梯度之間DPPH自由基清除率差異不顯著。樣品用量在40～70 μL之間變化時(shí)，除了紹興黃酒，其他3種樣品對(duì)DPPH自由基清除率與用量之間呈現(xiàn)較好的線性關(guān)系，結(jié)果表明苦蕎紅曲酒對(duì)DPPH自由基有較好的清除能力。

2.3 ABTS自由基清除能力的測(cè)定

ABTS經(jīng)活性氧氧化后生成穩(wěn)定的藍(lán)綠色陽(yáng)離子自由基ABTS+，當(dāng)加入的被測(cè)物質(zhì)含有抗氧化成分時(shí)，該物質(zhì)會(huì)與ABTS+發(fā)生反應(yīng)使反應(yīng)體系褪色，顏色變淺，在其最大吸收光波長(zhǎng)734 nm下測(cè)定其吸光度值變化。根據(jù)吸光度值的大小判定被測(cè)樣品抗氧化能力的強(qiáng)弱，吸光度值越小，被測(cè)樣品抗氧化能力越強(qiáng)[22]，結(jié)果見(jiàn)圖2。

圖2 各樣品對(duì)ABTS自由基的清除作用Fig.2 Scavenging effect of each sample on ABTS free radicals

從圖2可以看出，苦蕎紅曲酒、紹興黃酒、VC和Trolox對(duì)ABTS自由基均具有一定的清除能力，且苦蕎紅曲酒對(duì)ABTS自由基的清除能力明顯高于Trolox、VC和紹興黃酒。各樣品對(duì)ABTS自由基的清除能力隨著用量的增加而上升，其中苦蕎紅曲酒、Trolox和VC對(duì)ABTS自由基的清除能力隨用量變化的增效明顯，而紹興黃酒的各濃度梯度之間ABTS自由基清除率差異不顯著，結(jié)果表明苦蕎紅曲酒對(duì)ABTS自由基有很好的清除能力。

2.4 Fe3+還原能力的測(cè)定

FRAP法是基于氧化還原反應(yīng)，在酸性pH值下，F(xiàn)e3+與TPTZ形成復(fù)合物（Fe3+-TPTZ），在被測(cè)物的還原物質(zhì)作用下，復(fù)合物被還原為Fe2+而呈藍(lán)色，在593 nm波長(zhǎng)處達(dá)到最大吸收，還原物質(zhì)的含量與吸光度值的變化呈比例關(guān)系。因此，可用來(lái)判定物質(zhì)的抗氧化能力，在593 nm波長(zhǎng)處檢測(cè)吸光度值，吸光度值越大，F(xiàn)RAP值也就越大，被測(cè)樣品抗氧化能力越強(qiáng)[23]。結(jié)果見(jiàn)圖3。

圖3 各樣品對(duì)Fe3+的還原能力Fig.3 Reducing power of each sample on Fe3+

從圖3可以看出，苦蕎紅曲酒、紹興黃酒、VC和Trolox對(duì)Fe3+均具有一定的還原能力，說(shuō)明4種被測(cè)物都含有一定的還原性物質(zhì)。且苦蕎紅曲酒對(duì)Fe3+的還原能力明顯高于Trolox、VC和紹興黃酒。各樣品對(duì)Fe3+的還原能力隨著用量的增加而上升，其中苦蕎紅曲酒對(duì)Fe3+的還原能力隨用量變化的增效明顯。而Trolox、VC和紹興黃酒的各濃度梯度之間對(duì)Fe3+的還原能力差異不顯著。

2.5 總黃酮含量、總酚含量與抗氧化能力之間的關(guān)系

根據(jù)圖1～圖3測(cè)定結(jié)果，采用SPSS數(shù)據(jù)分析軟件，將苦蕎紅曲酒樣品的總黃酮含量和總酚含量與其抗氧化能力作相關(guān)性分析，結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 樣品總黃酮、總酚含量與抗氧化相關(guān)性Table 1 Correlation between antioxidant activity and total flavonoids or total polyphenols

由表1可知，樣品中的總黃酮、總酚含量對(duì)DPPH自由基、ABTS自由基的清除率和對(duì)Fe3+的還原能力呈極顯著相關(guān)（P＜0.01），說(shuō)明黃酮類物質(zhì)、酚類物質(zhì)對(duì)樣品抗氧化能力有顯著影響。

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)測(cè)定了苦蕎紅曲保健酒中總黃酮和總酚的含量，并且對(duì)比了苦蕎紅曲保健酒、市售黃酒、VC、Trolox對(duì)DPPH自由基、ABTS自由基的清除能力和對(duì)Fe3+的還原能力。結(jié)果表明，隨著被測(cè)樣液用量的增加，其抗氧化能力也在不斷增強(qiáng)。對(duì)相關(guān)性的分析表明，苦蕎紅曲保健酒黃酮及總酚含量與其對(duì)DPPH自由基、ABTS自由基的清除能力和對(duì)Fe3+的還原能力之間存在極顯著差異。

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