陳小麗，鄭華章，涂玉佩，巫光宏*

（1.廣東海洋大學(xué) 水產(chǎn)學(xué)院，廣東 湛江 524088；2.華南農(nóng)業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，廣東 廣州 510642）

蛹蟲(chóng)草人工培養(yǎng)較為成功，其培養(yǎng)基中殘留有一定含量的多糖，將此多糖提取研究可提高培養(yǎng)基利用價(jià)值、節(jié)約資源。但是，大米、小麥等固體培養(yǎng)基中含有大量淀粉，而目前的多糖測(cè)定方法主要是通過(guò)定量總糖含量間接計(jì)算得到多糖含量[10-11]，大量淀粉會(huì)干擾對(duì)蛹蟲(chóng)草多糖的測(cè)定，無(wú)法準(zhǔn)確計(jì)算多糖含量，現(xiàn)有研究卻大多未考慮這一問(wèn)題[12-14]。為了準(zhǔn)確定量培養(yǎng)基中多糖含量，有必要先除去淀粉，再進(jìn)行多糖的提取和測(cè)定。但是，如何在除去淀粉的同時(shí)盡量降低蛹蟲(chóng)草多糖的損失率是一大難題。本研究探索了Ca（NO3）2法去除蛹蟲(chóng)草大米培養(yǎng)基中大量的淀粉，然后采用水提法提取蛹蟲(chóng)草多糖，為準(zhǔn)確定量蛹蟲(chóng)草培養(yǎng)基多糖含量提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

蛹蟲(chóng)草子實(shí)體大米培養(yǎng)基：深圳澎源生物科技有限公司。

硝酸鈣：廣東臺(tái)山粵僑試劑塑料有限公司；氯仿：天津市大茂化學(xué)試劑廠；正丁醇：廣東光華化學(xué)廠有限公司；濃硫酸、可溶性淀粉：廣州化學(xué)試劑廠。以上試劑為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

DK-S24電熱恒溫水浴鍋：上海森信實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；5810R高速冷凍離心機(jī)：德國(guó)EPPENDORF公司；TG16-WS高速離心機(jī)：長(zhǎng)沙湘智離心機(jī)儀器有限公司；UV-1100分光光度計(jì)：青島紫泉儀器有限公司；AB104-N電子天平：梅特勒-托利多集團(tuán)；60目試驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)篩：浙江上虞市華康化驗(yàn)儀器廠。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 淀粉含量的測(cè)定方法[15-16]

淀粉含量的測(cè)定采用碘顯色法：淀粉與I2能特異性結(jié)合形成藍(lán)色復(fù)合物，600 nm為碘與淀粉復(fù)合物的最大吸收波長(zhǎng)。碘-碘化鉀溶液（I2-KI）用量影響顯色深度，隨用量增大，顯色加深，但并不呈線性增加，加入100 μL 0.2%I2-KI時(shí)獲得較好的結(jié)果。采用Ca（NO3）2提取淀粉時(shí)，其濃度對(duì)顯色有較大影響，本試驗(yàn)需要對(duì)不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)的Ca（NO3）2去除淀粉進(jìn)行正交試驗(yàn)，因而分別作出不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)的Ca（NO3）2溶解淀粉對(duì)應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)曲線。

取梯度用量（0、0.25 mL、0.50 mL、1.00 mL、2.00 mL、3.00 mL、4.00 mL）的淀粉溶液（0.01%），補(bǔ)加純水至4 mL，加入0.2%的I2-KI 100 μL，測(cè)定OD600nm，以其為橫坐標(biāo)，淀粉含量（mg/mL）為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。將淀粉分別用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為50%、65%和80%的Ca（NO3）2溶解，同時(shí)用相應(yīng)質(zhì)量分?jǐn)?shù)的Ca（NO3）2溶液補(bǔ)加至4 mL，按上述方法分別作出淀粉標(biāo)準(zhǔn)曲線。樣品淀粉含量計(jì)算公式如下：

對(duì)于一個(gè)接受英國(guó)教育，但是又長(zhǎng)期生活、工作在印度，作品多取材自印度的作家來(lái)說(shuō)，吉卜林不僅書寫了印度，也書寫了印度與英國(guó)之間的敏感關(guān)系，更多的是在殖民帝國(guó)時(shí)期的英國(guó)與印度的雙重社會(huì)文化語(yǔ)境下，訴說(shuō)作為“英印人”的獨(dú)特的自我感受。

式中：X為標(biāo)準(zhǔn)曲線上查得的樣品淀粉質(zhì)量濃度，mg/mL；4為反應(yīng)體系總體積，mL；Vt為樣品總體積，mL；Vu為每支測(cè)定試管中加入的樣品體積，mL；M為樣品稀釋倍數(shù)。

1.3.2 淀粉去除條件優(yōu)化正交試驗(yàn)

稱取過(guò)60目篩的蛹蟲(chóng)草培養(yǎng)基粉末2.0 g，加60 mL 體積分?jǐn)?shù)為80%乙醇碾磨，離心，殘?jiān)?0 mL蒸餾水懸浮洗滌一次，離心，去上清。所得殘?jiān)凑辉O(shè)計(jì)參數(shù)用Ca（NO3）2溶液懸浮，沸水浴10 min，4 000 r/min離心10 min，上清液透析除Ca（NO3）2，測(cè)定淀粉質(zhì)量，淀粉去除率計(jì)算公式如下：

式中：C1、C2分別為去除淀粉前和去除淀粉后樣品中淀粉質(zhì)量，mg。

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，以淀粉去除率為考察指標(biāo)，選取影響淀粉去除率的3個(gè)因素進(jìn)行L9（34）正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)，淀粉去除條件優(yōu)化正交試驗(yàn)因素與水平見(jiàn)表1。

表1 淀粉去除條件優(yōu)化正交試驗(yàn)因素與水平Table 1 Factors and levels of orthogonal experiments for starch extraction condition optimization

在正交試驗(yàn)基礎(chǔ)上，按上述試驗(yàn)獲得的最優(yōu)方案追加淀粉去除試驗(yàn)，提取淀粉4次，分別用碘顯色法測(cè)定每次提取所得溶液中淀粉的含量。提取4次之后的殘?jiān)糜谔崛∠x(chóng)草多糖，并測(cè)定粗提液中的淀粉含量，合并得淀粉總含量，計(jì)算淀粉去除率。

1.3.3 蛹蟲(chóng)草多糖提取條件優(yōu)化正交試驗(yàn)[17]

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選取影響多糖提取率的4個(gè)因素進(jìn)行正交試驗(yàn)，因素與水平設(shè)計(jì)見(jiàn)表2。按1.3.2 最優(yōu)方案除去淀粉，所得殘?jiān)丛O(shè)計(jì)條件提取多糖，將提取液冷卻，10 000 r/min 離心10 min，上清液即為蛹蟲(chóng)草多糖粗提液。苯酚-硫酸法[10]測(cè)定多糖含量，以多糖得率為考察指標(biāo)，確定最佳提取方案。多糖含量及得率計(jì)算公式如下：

多糖含量（mg）=（Ct-Cr）×0.9

式中：Ct為標(biāo)準(zhǔn)曲線查得的樣品總糖含量，mg；Cr為標(biāo)準(zhǔn)曲線查得的樣品還原糖含量，mg；0.9為校正系數(shù)。

式中：Cp為多糖含量，mg；M為樣品稀釋倍數(shù)；W為樣品質(zhì)量，g；1 000為將mg轉(zhuǎn)換為g。

表2 多糖提取條件優(yōu)化正交試驗(yàn)因素與水平Table 2 Factors and levels of orthogonal experiment for polysaccharides extraction conditions optimization

1.3.4 Sevag法除蛋白質(zhì)[18]

取10 mL醇析后復(fù)溶的蟲(chóng)草多糖溶液，按1∶1、2∶1、3∶1體積比加入Sevag試劑（V氯仿/V正丁醇=2∶1），充分振蕩40 min，10 000 r/min離心10 min，取上清液，測(cè)定多糖含量和蛋白質(zhì)含量（考馬斯亮藍(lán)G250染色法），計(jì)算蛋白去除率和多糖損失率。

式中：Ca為脫蛋白前蛋白含量，mg/mL；Cb為脫蛋白后蛋白含量，mg/mL。

式中：Cp1為脫蛋白前多糖含量，mg/mL；Cp2為脫蛋白后多糖含量，mg/mL。

2 結(jié)果與分析

2.1 碘顯色法測(cè)定淀粉含量標(biāo)準(zhǔn)曲線

淀粉用純水、質(zhì)量分?jǐn)?shù)為50%、65%和80%的Ca（NO3）2溶液所作標(biāo)準(zhǔn)曲線線性回歸方程分別為Y=0.147X，Y=0.097X，Y=0.095X，Y=0.084X，相關(guān)系數(shù)R2均為0.999，表明4條標(biāo)準(zhǔn)曲線線性相關(guān)性都很高，可以分別用來(lái)計(jì)算相應(yīng)樣品中淀粉含量。

2.2 淀粉去除條件優(yōu)化正交試驗(yàn)結(jié)果

正交試驗(yàn)結(jié)果表明，影響淀粉去除率的主次順序?yàn)樘崛〈螖?shù)＞Ca（NO3）2質(zhì)量分?jǐn)?shù)＞料液比，直觀分析確定最佳組合為A3B1C3，即Ca（NO3）2質(zhì)量分?jǐn)?shù)80%，料液比1∶20（g∶mL），提取3次，淀粉的去除率為42.57%。方差分析（表4）表明，Ca（NO3）2質(zhì)量分?jǐn)?shù)和提取次數(shù)對(duì)淀粉去除率的影響顯著。

表3 淀粉去除條件優(yōu)化正交試驗(yàn)結(jié)果與分析Table 3 Results and analysis of orthogonal experiment for starch removal condition optimization

表4 淀粉去除正交試驗(yàn)結(jié)果方差分析Table 4 Variance analysis of the starch removal orthogonal result

2.3 多糖提取條件優(yōu)化正交試驗(yàn)結(jié)果

正交試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表5，極差分析表明，影響多糖提取率的主次順序?yàn)锳（提取溫度）＞C（提取時(shí)間）＞D（提取次數(shù)）＞B（料液比）；正交試驗(yàn)得出最優(yōu)組合為A3B1C3D2，即料液比為1∶30（g∶mL）、浸提溫度100 ℃、浸提3 h，提取2次，蛹蟲(chóng)草水溶性多糖的提取率最高，可達(dá)3.31%。由表6可知，方差分析表明各個(gè)因素在α=0.05水平上影響均不顯著。

表5 蛹蟲(chóng)草多糖提取條件優(yōu)化正交試驗(yàn)結(jié)果與分析Table 5 Results and analysis of orthogonal experiment for polysaccharides extraction conditions optimization

表6 多糖提取正交試驗(yàn)結(jié)果方差分析Table 6 Variance analysis of the polysaccharides extraction orthogonal result

2.4 Sevag法除蛋白質(zhì)

圖1 不同比例的多糖溶液與Sevag試劑的除蛋白結(jié)果Fig.1 Deproteinization results of different ratio of polysaccharides solution and Sevag regent

從圖1可知，隨著Sevag試劑用量的增加蛋白的去除率增大而多糖的損失率降低。多糖溶液與Sevag試劑的比例為1∶3（V/V）時(shí)，除蛋白1次蛋白的去除率為94.2%，多糖的損失率為20.95%。

3 結(jié)論

本研究采用Ca（NO3）2提取法去除蛹蟲(chóng)草培養(yǎng)基中的淀粉，采用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為80%Ca（NO3）2按料液比1∶20（g∶mL）在100 ℃條件下水浴10 min，重復(fù)3次，淀粉的去除率達(dá)42.57%。由于淀粉與蛹蟲(chóng)草多糖的一些共性，采用一般方法分離二者較難，而采用本法浸提時(shí)間短，淀粉去除率高，同時(shí)可避免蟲(chóng)草多糖的過(guò)多損失，具有較高實(shí)用價(jià)值。

在成功除掉大量淀粉的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步從培養(yǎng)基中提取蛹蟲(chóng)草多糖，正交試驗(yàn)表明，影響多糖提取率的主次順序?yàn)锳（提取溫度）＞C（提取時(shí)間）＞D（提取次數(shù)）＞B（料液比）；正交試驗(yàn)得出最優(yōu)試驗(yàn)組合為A3B1C3D2，即料液比為1∶30（g∶mL）、浸提溫度100 ℃、浸提3 h，提取2次，提取率可達(dá)3.31%，通過(guò)單因素試驗(yàn)確定最佳脫蛋白條件為多糖溶液與Sevag試劑按1∶3比例混合，除蛋白1次。此時(shí)，蛋白的去除率可達(dá)94.2%，而多糖損失率為20.95%，效果較好。

[1]SUNG G H,HYWEL-JONES N L,SUNG J M,et al.Phylogenetic classification ofCordycepsand the clavicipitaceous fungi[J].Stud Mycol,2007,57(1):5-59.

[2]DONG J Z,LEI C,AI X R,et al.Selenium enrichment onCordyceps militarislink and analysis on its main active components[J].Appl Biochem Biotech,2012,166(5):1215-1224.

[3]DAS S K,MASUDA M,SAKURAI A,et al.Medicinal uses of the mushroomCordyceps militaris:Current state and prospects[J].Fitoterapia,2010,81(8):961-968.

[4]LIN R,LIU H,WU S,et al.Production andin vitroantioxidant activity of exopolysacchar ide by a mutant,Cordyceps militarisSU5-08[J].Int J Biol Macromol,2012,51(1-2):153-157.

[5]WANG M,MENG X Y,YANG R L,et al.Cordyceps militarispolysaccharides can enhance the immunity and antioxidation activity in immunosuppressed mice[J].Carbohyd Polym,2012,89(2):461-466.

[6]CHU H,CHIEN J,DUH P.Protective effect ofCordyceps militarisagainst high glucose-induced oxidative stress in human umbilical vein endothelial cells[J].Food Chem,2011,129(3):871-876.

[7]LEE J S,HONG E K.Immunostimulating activity of the polysaccharides isolated fromCordyceps militaris[J].Int Immunopharmacol,2011,11(9):1226-1233.

[8]LEE J S,KWON J S,YUN J S,et al.Structural characterization of immunostimulating polysaccharide from cultured mycelia ofCordyceps militaris[J].Carbohyd Polym,2010,80(4):1011-1017.

[9]YU R M,YIN Y,YANG W,et al.Structural elucidation and biological activity of a novel polysaccharide by alkaline extraction from culturedCordyceps militaris[J].Carbohyd Polym,2009,75(1):166-171.

[10]董 群，鄭麗伊，方積年.改良的苯酚-硫酸法測(cè)定多糖和寡糖含量的研究[J].中國(guó)藥學(xué)雜志，1996，31（9）：550-552.

[11]張 琳，鄧貴華.蛹蟲(chóng)草子實(shí)體中多糖含量不同測(cè)定方法的比較[J].中藥材，2012（5）：733-736.

[12]江明珠，顏 輝，聞 燕，等.家蠶蛹蟲(chóng)草子實(shí)體及大米培養(yǎng)基多糖的提取和純化[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2010（18）：9538-9539.

[13]婁 虹，金莉莉，王洋洋，等.蛹蟲(chóng)草大米培養(yǎng)基中活性多糖的提取及免疫調(diào)節(jié)功能研究[J].特產(chǎn)研究，2006（4）：46-48.

[14]來(lái)永斌，王 琦，孫 月.蛹蟲(chóng)草多糖含量的測(cè)定與分析[J].中成藥，2001，23（7）：517-518.

[15]何其芳，李榮華，郭培國(guó)，等.煙葉中淀粉含量測(cè)定方法的比較[J].現(xiàn)代食品科技，2012，28（2）：229-232.

[16]徐昌杰，陳文峻，陳昆松，等.淀粉含量測(cè)定的一種簡(jiǎn)便方法——碘顯色法[J].生物技術(shù)，1998（2）：41-43.

[17]陳小麗，巫光宏，古青霞，等.正交法優(yōu)化蛹蟲(chóng)草子實(shí)體多糖的提取工藝[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2010，38（28）：15583-15585.

[18]陳小麗，巫光宏，古青霞，等.蛹蟲(chóng)草子實(shí)體多糖的分離純化[J].生物技術(shù)，2011，21（4）：70-74.