楊一群，陳 洋，杜文芳，侯斌斌，畢旺來(lái)，李 睿，2*

（1.武漢輕工大學(xué) 生物與制藥工程學(xué)院，湖北 武漢 430023；2.農(nóng)產(chǎn)品加工湖北省協(xié)同創(chuàng)新中心，湖北 武漢 430023）

很多腸出血性大腸桿菌都能引起人出現(xiàn)出血性腹瀉。美國(guó)俄勒岡和密執(zhí)安州在1982年發(fā)生了一些出血性腸炎的爆發(fā)流行病例，并從其中一個(gè)患者糞便中分離出腸出血性大腸桿菌O157∶H7[1]。O157菌株致病機(jī)理非常復(fù)雜，stx基因、LEE毒力島編碼intimin的eae基因和大質(zhì)粒上編碼溶血素的hly基因等都是其重要毒力因子[2]。O157主要毒力因子是位于噬菌體基因上的stx1、stx2基因，這兩種基因分別編碼志賀毒素Stx1、Stx2[3]。目前腸出血性大腸桿菌包括了多種血清型大腸桿菌，如O157、O26、O111等，但O157∶H7血清型仍是引起人類(lèi)出血性結(jié)腸炎的主要致病菌，其還可以引起人患溶血性尿毒綜合征等食物中毒并發(fā)癥，嚴(yán)重者發(fā)生急性腎衰竭而死亡[4]。腸出血性大腸桿菌O157∶H7可以通過(guò)3種方式進(jìn)行傳播：食源性傳播、水源性傳播及接觸傳播。其中食源性傳播最為普遍，主要是以牛肉、豬肉等動(dòng)物性食物為主要載體進(jìn)行傳播[5]。美國(guó)、加拿大、日本、英國(guó)等國(guó)曾多次爆發(fā)O157∶H7感染疫情[6]。因此腸出血性O(shè)157∶H7的檢驗(yàn)檢疫一直是世界各地食品安全的重要研究?jī)?nèi)容[7]。

目前國(guó)標(biāo)法檢測(cè)O157∶H7有常規(guī)平板培養(yǎng)法、免疫磁珠捕獲法、聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）法[8]。平板培養(yǎng)法經(jīng)過(guò)逐級(jí)選擇性平板培養(yǎng)，陽(yáng)性菌落做血清學(xué)實(shí)驗(yàn)和生化實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，步驟較多較費(fèi)時(shí)；免疫磁珠捕獲法與常規(guī)平板培養(yǎng)法步驟類(lèi)似，操作復(fù)雜，費(fèi)時(shí)；PCR雖然快速靈敏，但是假陽(yáng)性高，只能作為檢測(cè)O157∶H7的初級(jí)手段使用，不能從樣本中分離篩選出O157∶H7菌株，陽(yáng)性樣本往往還需要進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。

采用以上3種方法，并優(yōu)化技術(shù)路線，對(duì)武漢市售食品樣品進(jìn)行O157∶H7快速檢測(cè)和分離篩選，并鑒定篩選出的O157∶H7疑似菌株，以評(píng)估采用的篩選方法的可靠性。本研究結(jié)果對(duì)今后進(jìn)行食品中O157∶H7快速檢測(cè)和篩選鑒定，提高檢測(cè)準(zhǔn)確性，具有積極意義。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料

O157∶H7陽(yáng)性對(duì)照菌株（EC150）：日本九州大學(xué)贈(zèng)送；5株O157∶H7疑似菌株：分別從武漢市售牛肉和豬肉樣品中分離得到。

1.1.2 試劑

DNA 分子量標(biāo)準(zhǔn)物、TaqPCR 試劑盒（DR001B）、VT1/VT2檢測(cè)試劑盒（RR105A）：日本Takara公司；Gold-View核酸染料：賽百盛基因技術(shù)有限公司；大腸桿菌O157免疫磁珠分離試劑盒：天津生物芯片技術(shù)有限責(zé)任公司；O157、H7診斷血清：寧波天潤(rùn)生物藥業(yè)有限公司；改良山梨糖醇麥康凱瓊脂（modified sorbitol macconkey agar，CT-SMAC）、改良O157顯色培養(yǎng)基、新生霉素、腦心浸液培養(yǎng)基（brian heart infusion，BHI）培養(yǎng)基：武漢法斯特生物檢驗(yàn)技術(shù)有限公司；TIANGEN 細(xì)菌基因組提取試劑盒：武漢華順生物技術(shù)有限公司；引物委托武漢鼎國(guó)生物技術(shù)有限公司合成。

1.2 儀器與設(shè)備

HMB-400B拍擊式均質(zhì)器：天津市恒奧科技發(fā)展有限公司；GBox-HR-E-M凝膠圖像系統(tǒng)：英國(guó)Syngene公司；臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)：德國(guó)eppendorf公司；DYY-10C電泳儀：北京六一儀器廠；Tgradient PCR儀：德國(guó)Biometra公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品處理

在2013年5～9月期間，在武漢市22個(gè)菜市場(chǎng)、大型超市分批采集樣品117份。食品樣品采集后放入無(wú)菌均質(zhì)袋，冰袋冷藏運(yùn)回。當(dāng)天即進(jìn)行富集培養(yǎng)。無(wú)菌操作，稱(chēng)取12.5 g樣品，同112.5 mL滅菌TSB培養(yǎng)液一起放入均質(zhì)袋中，在拍擊式均質(zhì)器中均質(zhì)90 s，將均質(zhì)后的培養(yǎng)液轉(zhuǎn)入三角瓶中，37 ℃培養(yǎng)22 h。取菌液1 mL于EP管中，加入甘油凍存。

1.3.2 食品中O157∶H7快速檢測(cè)和分離篩選流程圖

食品中樣品O157∶H7快速檢測(cè)及分離篩選工藝流程見(jiàn)圖1。

1.3.3 混合菌液DNA提取

取培養(yǎng)后的菌液1 mL于EP管中，12 000 r/min離心3 min并去掉上清液。按TIANGEN 細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒說(shuō)明操作，提取細(xì)菌基因組DNA。提取后的DNA溶解在50 μL TE緩沖液中。取5 μL DNA于1%的瓊脂糖凝膠電泳，檢測(cè)細(xì)菌DNA是否提取完好。將提取完好的細(xì)菌DNA于-20 ℃冰箱中保存。

圖1 食品樣品大腸桿菌O157：H7快速檢測(cè)和分離篩選技術(shù)流程圖Fig.1 Flow chart of screening and separation of E.coli O157∶H7 in food samples

1.3.4 PCR擴(kuò)增rfbO157、stx基因

VT1/VT2檢測(cè)試劑盒用來(lái)擴(kuò)增stx1和stx2基因。stx1預(yù)期產(chǎn)物大小為349 bp；stx2預(yù)期產(chǎn)物大小為404 bp。rfbO157引物及預(yù)期產(chǎn)物大小見(jiàn)表1。

表1 PCR引物序列及產(chǎn)物大小Table 1 PCR primer sequence and length of the PCR amplification products

stx基因擴(kuò)增體系及條件如下：

檢測(cè)體系：10×buffer 2.5 μL；2.5 mmol/L dNTP 2 μL；10 μmol/L引物 各0.5 μL；TaqDNA 聚合酶0.15 μL；模板1 μL DNA；dddH2O 18.85 μL。反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性1 min，55 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，共35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。陰性對(duì)照用無(wú)菌水。

rfbO157基因擴(kuò)增體系及條件如下：

檢測(cè)體系：10×buffer 2.5 μL；2.5 mmol/L dNTP 2 μL；10 μmol/L引物 各0.5 μL；TaqDNA 聚合酶0.15 μL；模板1 μL DNA；dddH2O 18.35 μL。反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃變性1 min，59 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，共30個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。陰性對(duì)照用無(wú)菌水。

1.3.5 分離O157菌株

將stx以及rfbO157PCR檢測(cè)結(jié)果均為陽(yáng)性的菌液，復(fù)蘇。用添加有新生霉素的EC增菌培養(yǎng)液，41 ℃下重新富集培養(yǎng)22 h。取20 μL O157免疫磁珠加入離心管，并加入1 mL增菌液混合，按免疫磁珠試劑盒說(shuō)明書(shū)操作，將離心管放在磁珠分選儀上進(jìn)行免疫磁珠捕獲。吸取所有含免疫磁珠的洗脫液在O157改良顯色平板上，涂布一半平板，另一半平板做劃線培養(yǎng)。于37 ℃培養(yǎng)20 h。挑取紅色陽(yáng)性單菌落轉(zhuǎn)接CT-SMAC平板，37 ℃培養(yǎng)12 h。將無(wú)色陽(yáng)性菌落用O157診斷血清進(jìn)行玻片血清凝集實(shí)驗(yàn)。同時(shí)挑取該無(wú)色菌落于PCR管中做菌落PCR。

1.3.6 O157抗原血清學(xué)鑒定

分別取1滴O157診斷血清和1滴生理鹽水滴在載玻片左右兩邊，分別用滅菌牙簽挑取適量菌泥在O157診斷血清和生理鹽水中涂布開(kāi)，晃動(dòng)載玻片，在1 min內(nèi)觀察菌體是否出現(xiàn)凝集現(xiàn)象。若生理鹽水未出現(xiàn)菌體凝集反應(yīng)而診斷血清出現(xiàn)凝集反應(yīng)，則檢測(cè)的樣品為陽(yáng)性。陽(yáng)性對(duì)照組采用參考菌株EC150。

1.3.7 菌落PCR鑒定stx基因

VT1/VT2檢測(cè)試劑盒用來(lái)擴(kuò)增stx1和stx2基因。用滅菌牙簽在CT-SMAC平板上沾取適量菌體于PCR管中，加入PCR反應(yīng)液。菌落PCR反應(yīng)體系為：10×buffer 1 μL；2.5 mmol/L dNTP 0.8 μL；10 μmol/L引物 各0.2 μL；TaqDNA 聚合酶0.08 μL；無(wú)菌雙蒸水7.72 μL。PCR擴(kuò)增程序：94 ℃預(yù)變性8 min；94 ℃變性30 s，55 ℃30 s，72 ℃30 s，共30個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。陰性對(duì)照為無(wú)菌水。

1.3.8 H7鞭毛抗原血清學(xué)鑒定

方法參考文獻(xiàn)[9]。將待鑒定的O157∶H7疑似菌株，采用穿刺接種法接種于4%強(qiáng)營(yíng)養(yǎng)軟瓊脂中，37 ℃培養(yǎng)過(guò)夜后再轉(zhuǎn)接于4%強(qiáng)營(yíng)養(yǎng)軟瓊脂，重復(fù)穿刺接種培養(yǎng)4次。將鞭毛誘導(dǎo)好的細(xì)菌轉(zhuǎn)接于BHI液體培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)過(guò)夜，等量加入含1%甲醛的生理鹽水，制成待檢樣。取2支干凈小試管，分別加入0.5 mL待檢樣品和生理鹽水，滴加3滴H7診斷血清，50 ℃水浴加熱1 h。如生理鹽水無(wú)凝集，而血清出現(xiàn)絮狀沉淀，則待檢樣品為陽(yáng)性。

1.3.9 純菌DNA模板的制備

將待檢菌株接種于5 mL LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃，培養(yǎng)16 h。取1 mL菌液于離心管中，按1.3.2方法制備DNA。

1.3.10 PCR檢測(cè)fliCH7基因

PCR反應(yīng)體系為：10×buffer 2.5 μL；2.5 mmol/L dNTP 2 μL；0.2 μmol/L引物 各0.5 μL；TaqDNA 聚合酶0.15 μL；模板1 μL DNA；dddH2O：18.35 μL。PCR擴(kuò)增程序：94 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃變性1 min，59 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，共30個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。陰性對(duì)照用無(wú)菌水。引物參考文獻(xiàn)[10]合成。

2 結(jié)果與分析

2.1 食品中O157∶H7疑似菌株的檢測(cè)、分離和篩選

采用圖1所示流程，對(duì)117份食品樣品進(jìn)行了PCR擴(kuò)增，經(jīng)檢驗(yàn)，117份樣品中有55份樣品rfbO157基因PCR檢測(cè)結(jié)果顯示陽(yáng)性，但其中有20份樣品stx基因檢測(cè)結(jié)果為陰性，stx和rfbO157基因同時(shí)檢出為陽(yáng)性的樣品有35份。

從這35份樣品中挑選部分樣品，經(jīng)過(guò)免疫磁珠分離、顯色培養(yǎng)基培養(yǎng)、O157診斷血清玻片凝集反應(yīng)鑒定等步驟，分離篩選出4株O157∶H7疑似菌株，但有一份樣品經(jīng)過(guò)免疫磁珠捕獲后在O157顯色培養(yǎng)基上培養(yǎng)時(shí)，菌落為紅色，在CT-SMAC平板上菌落為無(wú)色，呈現(xiàn)出典型的O157陽(yáng)性菌落特征。但用O157單價(jià)血清做玻片凝集實(shí)驗(yàn)時(shí)，挑選的單菌落均無(wú)法與O157診斷血清產(chǎn)生凝集反應(yīng)，始終無(wú)法從該陽(yáng)性樣品中分離到陽(yáng)性單菌落。該份樣品改用菌落PCR法篩選單菌，篩出1株O157∶H7疑似菌株，命名為EC5.11。EC5.11菌落PCR檢測(cè)結(jié)果電泳圖樣如圖2所示。

圖2 stx基因菌落PCR擴(kuò)增產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳圖Fig.2 Agarose gel electrophoresis of colony PCR amplification products of stx gene

由圖2可知，5種O157∶H7疑似菌株均攜帶stx基因。

2.2 O157∶H7疑似菌株的鑒定

將5株O157∶H7疑似菌株重新分離純化后，按1.3.8方法進(jìn)行H7鞭毛誘導(dǎo)恢復(fù)。然后進(jìn)行H7抗原血清學(xué)鑒定。5株菌中僅有1株菌EC9.101有較明顯的凝集反應(yīng)。5株菌都能與O157抗原發(fā)生凝集反應(yīng)，但凝集反應(yīng)程度不同，EC5.11僅能與O157診斷血清產(chǎn)生微弱凝集反應(yīng)。用PCR方法對(duì)5株菌的rfbO157及fliCH7基因進(jìn)行檢測(cè)。PCR檢測(cè)結(jié)果電泳圖分別如圖3、圖4所示。

圖3 rfbO157基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳圖Fig.3 Agarose gel electrophoresis of PCR amplification products of rfbO157gene

由圖3可知，5株菌rfbO157檢測(cè)結(jié)果均為陽(yáng)性，表明5株菌O抗原為O157血清型。

圖4 fliCH7基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳圖Fig.4 Agarose gel electrophoresis of PCR amplificatio products of fliCH7gene

由圖4可知，4株菌fliCH7為陽(yáng)性。經(jīng)過(guò)PCR和血清學(xué)實(shí)驗(yàn)最終確定出，5株疑似菌株有4株為O157∶H7型，菌株EC9.102為O157血清型，H抗原血清型待定。

3 結(jié)論

本研究發(fā)現(xiàn)，EC5.11在O157改良平板和CT-SMAC平板上生長(zhǎng)時(shí)，均呈現(xiàn)典型的O157陽(yáng)性菌落特征，但無(wú)法與O157診斷血清發(fā)生良好凝集反應(yīng)。反之，很多細(xì)菌如赫氏埃希菌因與O157具有類(lèi)似抗原，也能與O157診斷血清產(chǎn)生強(qiáng)凝集反應(yīng)[11-12]。因此血清學(xué)方法是一種可靠性比較差的篩選方法，單一采用血清學(xué)鑒定的方法分離和鑒定O157：H7非常不可靠。

很多O157菌株不攜帶stx基因，這些菌株不能產(chǎn)生志賀毒素，對(duì)人類(lèi)健康影響較少[13]。本次研究有20份樣品檢出rfbO157基因陽(yáng)性，但stx基因檢測(cè)結(jié)果為陰性。我國(guó)公布的行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)致病菌PCR檢測(cè)法僅單一擴(kuò)增O157標(biāo)志基因rfbO157，并不能說(shuō)明食品中污染的O157是否具有致病力[14]。因此對(duì)食品中O157污染狀況進(jìn)行檢測(cè)評(píng)估時(shí)，建議采用三重PCR先進(jìn)行初篩，同時(shí)檢測(cè)O157抗原標(biāo)志基因比如rfbO157、志賀毒素編碼基因stx1和stx2。此方法較之行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)方法，可以對(duì)食品中O157的毒力狀況進(jìn)行較全面的判定。

國(guó)標(biāo)法在O157∶H7分離篩選流程中，先后采用了CT-SMAC、O157改良顯色培養(yǎng)基、TSI培養(yǎng)基、MUG-LST肉湯等進(jìn)行選擇性培養(yǎng)和初步生化鑒定，陽(yáng)性菌落再進(jìn)行血清學(xué)實(shí)驗(yàn)。在實(shí)際篩選工作中發(fā)現(xiàn)，TSI、MUG-LST針對(duì)O157∶H7特異性并不強(qiáng)，因此篩選流程中去除了這兩種培養(yǎng)基。經(jīng)過(guò)免疫磁珠捕獲、O157改良顯色培養(yǎng)基和CT-SMAC選擇性培養(yǎng)后，將陽(yáng)性菌落同時(shí)做血清學(xué)鑒定和菌落PCR，可以在減少工作量同時(shí)提高PCR陽(yáng)性樣本中O157菌株的分離率，避免漏篩。

在進(jìn)行H7鞭毛抗原血清學(xué)鑒定時(shí)，有4株菌表現(xiàn)為陰性，但在PCR鑒定fliCH7時(shí)，這4株菌中有3株都為H7鞭毛抗原陽(yáng)性。很可能是在進(jìn)行菌體鞭毛誘導(dǎo)時(shí)，鞭毛生長(zhǎng)不充分或根本沒(méi)有長(zhǎng)出鞭毛。很多類(lèi)似研究也證實(shí)O157∶H7疑似菌株采用血清學(xué)鑒定和PCR鑒定時(shí)，結(jié)果差異較大[15]。因此血清學(xué)鑒定的結(jié)果不可以作為實(shí)驗(yàn)最終結(jié)果，只能作為參考。PCR鑒定更靈敏，特異性更強(qiáng)，適合在菌株篩選和鑒定中作為主要方法使用。

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