鄭 雯，孫 琳，宋 詼*

（中國科學(xué)院 天津工業(yè)生物技術(shù)研究所，天津 300308）

細(xì)菌素（bacteriocins）是某些細(xì)菌產(chǎn)生的具有抗菌活性的多肽、蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)復(fù)合物[1]。與化學(xué)防腐劑相比具有安全無毒副作用、在人體內(nèi)能被蛋白酶分解無殘留、可以同時增加食品風(fēng)味等優(yōu)點，因此細(xì)菌素作為高效安全的生物防腐劑使用得到了廣泛地關(guān)注[2-5]。已有研究表明乳酸菌是產(chǎn)細(xì)菌素的一類主要菌群，同時由于乳酸菌的生物安全性，其所產(chǎn)的細(xì)菌素已作為飼料、食品及醫(yī)藥領(lǐng)域中現(xiàn)在使用的防腐劑和抗生素的替代物進(jìn)行了大量研究[6-9]。而乳酸菌代謝產(chǎn)生細(xì)菌素的能力和產(chǎn)量，除了受菌株自身特性的影響，還受發(fā)酵條件的影響，如發(fā)酵pH 值[8]、培養(yǎng)基成分、發(fā)酵溫度[9]以及接種量[10]等。常規(guī)的多因子試驗設(shè)計方法每次改變一個因子，這種方法不僅要求試驗的次數(shù)多，而且可能導(dǎo)致不可靠的甚至是錯誤的結(jié)論，尤其是對具有交互作用的多因子試驗[11]。響應(yīng)面方法（response surface methodology，RSM）是統(tǒng)計技術(shù)的合稱，其包括試驗設(shè)計、建模、因子效應(yīng)評估以及尋求因子最佳操作條件。隨著計算方法和設(shè)備的完善和普及，近些年來響應(yīng)面方法已成功地應(yīng)用于生物技術(shù)的許多方面[12-14]，但用于優(yōu)化細(xì)菌素發(fā)酵培養(yǎng)基方面尚報道較少。本研究通過以乳酸菌常用，并且細(xì)菌素產(chǎn)量較高的乳酸細(xì)菌培養(yǎng)基（de Man Rogosa Sharpe medium，MRS medium）為基礎(chǔ)，利用響應(yīng)面方法對影響細(xì)菌素產(chǎn)量的培養(yǎng)基各組份進(jìn)行評價，并對主要影響因子進(jìn)行優(yōu)化并得到較好的結(jié)果，同時對菌株在優(yōu)化培養(yǎng)基中的動力學(xué)進(jìn)行了分析，為上罐發(fā)酵提供了依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

供試菌：從自制奶酪中篩選得到的一株高產(chǎn)細(xì)菌素的植物乳桿菌，保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏登記號CGMCC.5297；指示菌：單核細(xì)胞增多性李斯特菌CVCC1595，天津大學(xué)食品系贈送；各種化學(xué)及糖（醇）類藥品均為分析純：國產(chǎn)或美國Sigma公司、瑞士Fluka公司；0.2 μm無菌濾膜：北京天為時代科技有限公司；利福平：中國香港GENE公司，貨號19-1059；改良MRS液體培養(yǎng)基（蛋白胨10.0 g/L，牛肉膏8.0 g/L，酵母粉4.0 g/L，葡萄糖20.0 g/L，吐溫-80 1.0 g/L，K2HPO42.0 g/L，乙酸鈉5.0 g/L，檸檬酸三銨2.0 g/L，MgSO4·7H2O 0.2 g/L，MnSO4·4H2O 0.05 g/L，pH 6.8，用于乳酸菌發(fā)酵）：青島海博生物有限公司；溶菌肉湯（lysogeny broth，LB）培養(yǎng)基（胰蛋白胨10.0 g/L，酵母粉5.0 g/L，NaCl 10.0 g/L，pH7.0，用于指示菌培養(yǎng)）：北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司；腦心浸液培養(yǎng)基（brian heart infusion，BHI）（牛腦200.0 g/L，牛心浸出汁250.0 g/L，蛋白胨10.0 g/L 葡萄糖2.0 g/L，NaCl 5.0 g/L，pH 6.8～7.2，用于指示菌活化）：北京索來寶科技有限公司；李斯特菌顯色平板（蛋白胨和酵母浸出物20.0 g/L，NaCl 5.0 g/L，色素17.5 g/L，瓊脂15.0 g/L，pH7.0，用于指示菌計數(shù)）：青島海博生物有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

SW-CJ-IFD超凈臺：蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；BSDYF2400恒溫?fù)u床：上海博訊實業(yè)品有限公司；ELX800酶標(biāo)儀：美國Bio-Tek公司；655001酶標(biāo)板：德國GreinerBio-OneGmbH公司；UVmini-1240紫外分光光度計：島津儀器（蘇州）有限公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品處理方法

將活化過夜的單增李斯特菌按2%接種至BHI 培養(yǎng)液中，37 ℃培養(yǎng)24 h至穩(wěn)定期，備用。將植物乳桿菌接種至改良MRS液體培養(yǎng)基，30 ℃培養(yǎng)48 h至穩(wěn)定期，離心取上清，調(diào)節(jié)pH值為6，無菌濾膜過濾備用。

1.3.2 細(xì)菌素抑菌能力的測定

抑菌圈試驗選用牛津杯雙層平板打孔法[15]，指示菌選用單核細(xì)胞增多性李斯特菌CVCC1595。

測定效價標(biāo)準(zhǔn)方程[16-18]：準(zhǔn)確稱取Nisin標(biāo)準(zhǔn)樣品配制成25 IU/mL、50 IU/mL、75 IU/mL、100 IU/mL 4個濃度梯度的標(biāo)準(zhǔn)溶液。在打孔的指示平板上每孔中加入不同濃度的Nisin標(biāo)準(zhǔn)樣各80 μL，每兩個相對的孔中加入同樣濃度的Nisin標(biāo)準(zhǔn)液，以消除平板厚度不均引起的誤差。30 ℃培養(yǎng)24 h后測量抑菌圈直徑，以抑菌圈直徑為縱坐標(biāo)，Nisin濃度對數(shù)值為橫坐標(biāo)作標(biāo)準(zhǔn)曲線，接著通過標(biāo)準(zhǔn)曲線計算得出菌株產(chǎn)生細(xì)菌素的效價。

細(xì)菌素抑菌效力的詳細(xì)測定：由于牛津杯法測定細(xì)菌素效價的靈敏性和準(zhǔn)確性有限，無法比較兩個樣品間的微小區(qū)別。因此為保證響應(yīng)面準(zhǔn)確性，在進(jìn)行響應(yīng)面試驗時，對細(xì)菌素抑菌能力的測定選取了更為準(zhǔn)確的與指示菌共培養(yǎng)的方法[19-20]。用接種環(huán)挑取單核細(xì)胞增多性李斯特菌CVCC1595單菌落于5 mL BHI培養(yǎng)基中，37 ℃過夜培養(yǎng)。按1%接種量接于新鮮LB培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)至穩(wěn)定期。用新鮮LB培養(yǎng)基稀釋至菌數(shù)約為106CFU/mL。然后每試管分裝2.75 mL。植物乳桿菌發(fā)酵上清過濾除菌后用無菌MRS稀釋至24倍，調(diào)節(jié)pH至6.0。加250 μL稀釋后的無菌上清到2.75 mL菌數(shù)為106CFU/mL的單核細(xì)胞增多性李斯特菌中。37 ℃培養(yǎng)4 h，測量單核細(xì)胞增多性李斯特菌OD600nm。

1.3.3 響應(yīng)面法優(yōu)化植物乳桿菌產(chǎn)細(xì)菌素的發(fā)酵條件優(yōu)化

Plackett-Burman 試驗設(shè)計：在單因素試驗的基礎(chǔ)上[21]，選取牛肉蛋白胨、牛肉膏、酵母粉、葡萄糖、K2HPO4、CH3COONa、MgSO4·7H2O、MnSO4·H2O分別作為Plackett-Burman試驗的8個因子X1、X2、…X8，選取N=24的Plackett-Burman 試驗設(shè)計，每個因子選取2 個水平（+1，-1），并加上6 個中心點，以細(xì)菌素對李氏桿菌的抑制能力（李氏桿菌OD600nm值）為響應(yīng)值Y。利用SAS 軟件對試驗結(jié)果進(jìn)行分析，得出各因素的T值和可信度水平。一般選擇可信度＞90%的因素作為重要因素進(jìn)行下一步試驗。

最陡爬坡試驗：應(yīng)用SAS 統(tǒng)計分析軟件，對Plackett-Burman 試驗設(shè)計中的結(jié)果代入T檢驗程序，比較試驗點處的平均響應(yīng)值與中心點水平的平均響應(yīng)值間的差異顯著性，以確定響應(yīng)面中心點。

響應(yīng)面試驗設(shè)計：根據(jù)響應(yīng)面的中心組合設(shè)計（central composite design，CCD）原理，以細(xì)菌素對李氏桿菌的抑制能力（李氏桿菌OD600nm值）為響應(yīng)值，對Plackett-Burman設(shè)計試驗中篩選出的顯著因素采用Design-Expert（Version 7.0.0）進(jìn)行中心組合設(shè)計，各因素水平取值見表2，其他因素取值則根據(jù)正效應(yīng)因素取較高值、負(fù)效應(yīng)因素取較低值，設(shè)計3因素3水平共20個試驗點的響應(yīng)面分析試驗。所有試驗點重復(fù)3次，取平均值。

1.3.4 模型的驗證

通過響應(yīng)面法獲得了植物乳桿菌代謝產(chǎn)細(xì)菌素的優(yōu)化發(fā)酵條件，在優(yōu)化條件下進(jìn)行發(fā)酵試驗，通過比較預(yù)測值和試驗值來驗證模型的有效性。

1.3.5 植物乳桿菌CGMCC.5297所產(chǎn)細(xì)菌素應(yīng)用的初步評價

將最優(yōu)培養(yǎng)條件下的植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）CGMCC.5297培養(yǎng)物離心取上清，過濾除菌，調(diào)節(jié)pH值為6.0。在自制酸奶中接種活化培養(yǎng)好的李氏桿菌至菌數(shù)約為106CFU/mL，每試管中分裝2.75 mL。各加入250 μL無菌上清或250 μL 無菌MRS培養(yǎng)基為對照。每管重復(fù)3次，于4 ℃培養(yǎng)。每天取出3管進(jìn)行計數(shù)，分別將酸奶稀釋103、104、105倍，每稀釋梯度涂5個李斯特菌顯色培養(yǎng)基平板。李氏桿菌會在平板上顯示透明圈。

2 結(jié)果與分析

2.1 Plackett-Burman 試驗

通過Plackett-Burman 試驗設(shè)計評價的8 個因子中，葡萄糖、牛肉膏、酵母粉的濃度對細(xì)菌素產(chǎn)量存在顯著影響，并進(jìn)行下一步最陡爬坡試驗。而其他5個因素對細(xì)菌素產(chǎn)量沒有顯著影響，因此在后續(xù)的試驗中取值確定為Plackettburman試驗設(shè)計的高點取值。

2.2 最陡爬坡試驗

對Plackett-Burman 試驗設(shè)計中的結(jié)果代入T檢驗程序，比較中心點水平的平均響應(yīng)值與試驗點處的平均響應(yīng)值間的差異顯著性，所得結(jié)果如表1 所示。由表1 顯示的檢驗結(jié)果可知，方差齊性檢驗的結(jié)果Pr＜0.05，說明中心點與試驗點方差非齊性；由此得出T 檢驗的結(jié)果Pr ＜0.05，說明曲面夠曲，中心點與試驗點間存在顯著差異，即Plackett-Burman 試驗設(shè)計中選取的中心點已經(jīng)接近最大的響應(yīng)區(qū)域內(nèi)，不需要通過最陡爬坡試驗進(jìn)一步靠近最優(yōu)點。

表1 T檢驗結(jié)果Table 1 Result of T test

2.3 響應(yīng)面試驗及模型的建立

響應(yīng)面試驗設(shè)計及結(jié)果見表2。對上述回歸模型進(jìn)行方差分析，結(jié)果見表3。利用Design Expert 7.0.0軟件對表2數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸擬合，獲得的響應(yīng)值細(xì)菌素對李氏桿菌的抑制能力（李氏桿菌OD600nm值）為對編碼自變量A（酵母粉）、B（牛肉膏）和C（葡萄糖）的二次多項式回歸模型方程為Y=1.550 86-0.112 76A-0.026 9B-0.041 9C+3 412AB+34 500AC-41 562BC+5 432A2+1 415B2+42 264C2。結(jié)果表明：模型的P=0.015＜0.05，表明回歸方程的F檢驗顯著，所擬合的二次回歸方程適合。失擬系數(shù)P=0.057 3＞0.05，說明失擬相對誤差不顯著，回歸模型的決定系數(shù)為0.973 4，說明該模型能夠解釋97.34%的變化，該模型擬合程度良好，試驗誤差小。因此，可用此模型對植物乳桿菌發(fā)酵產(chǎn)細(xì)菌素的條件進(jìn)行預(yù)測和分析?；貧w方程中各變量對響應(yīng)值影響的顯著性由F檢驗來判定，概率P值越小，則相應(yīng)變量的顯著程度越高。由回歸方程系數(shù)顯著性檢驗可知：模型一次項均不顯著；交互項AC、BC均處于顯著水平，AB不顯著；二次項A2、C2顯著。

利用Design Expert 軟件對表2 數(shù)據(jù)進(jìn)行二次多元回歸擬合，所得到的二次回歸方程的響應(yīng)面及等高線見圖1。由圖1可知，葡萄糖和酵母粉，葡萄糖和牛肉膏分別對細(xì)菌素產(chǎn)量的交互影響顯著，酵母粉和牛肉膏對細(xì)菌素產(chǎn)量的交互影響不顯著。通過方程可知，二次項的系數(shù)均為正值，其所表征的拋物面開口向上，具有極小值點。利用Design Expert 軟件，進(jìn)行分析計算，可得合成細(xì)菌素的最佳培養(yǎng)條件為：酵母粉5.09 g/L，牛肉膏10.85 g/L，葡萄糖55.34 g/L。在此條件下細(xì)菌素的效價預(yù)測值為37 ℃培養(yǎng)4 h后，單核細(xì)胞增多性李斯特菌OD600nm值為0.001 716。

表2 中心組合響應(yīng)面設(shè)計及試驗結(jié)果Table 2 Response surface central composite design and corresponding response

表3 回歸模型方差分析Table 3 Variance analysis for regression equation

圖1 各因素交互作用對植物乳桿菌CGMCC.5297所產(chǎn)細(xì)菌素抑菌活性影響的響應(yīng)面Fig.1 Response surface and contour plot for the effect of interaction among each factors on antibacterial activity

2.4 回歸模型的驗證

為了進(jìn)一步驗證預(yù)測值，利用優(yōu)化后確定的培養(yǎng)條件進(jìn)行3 次重復(fù)搖瓶試驗，發(fā)酵液上清經(jīng)過濾除菌調(diào)節(jié)pH值后，進(jìn)行抑菌能力的測定，4 h后，單核細(xì)胞增多性李斯特菌OD600nm值為0.001 73，與預(yù)測值擬合率達(dá)99.15%，表明預(yù)測值和實際值有良好的擬合性，優(yōu)化模型可靠。同時，優(yōu)化后的細(xì)菌素效價為4 499 IU/mL，比優(yōu)化前（3 214.59 IU/mL）提高了1.4倍，說明本試驗所確定的優(yōu)化方案的設(shè)計合理有效，所獲得的培養(yǎng)條件能夠明顯提高細(xì)菌素的產(chǎn)量。

2.5 植物乳桿菌CGMCC.5297所產(chǎn)細(xì)菌素應(yīng)用的初步探索

對植物乳桿菌CGMCC.5297所產(chǎn)細(xì)菌素在應(yīng)用方面進(jìn)行了初步試驗。在自制酸奶中接種單核細(xì)胞增多性李斯特菌后，加入優(yōu)化后的細(xì)菌素發(fā)酵上清與僅加入無菌MRS培養(yǎng)基對照的每日李斯特菌計數(shù)差別見圖2。

圖2 植物乳桿菌CGMCC No 5297所產(chǎn)細(xì)菌素對酸奶保鮮效果的研究Fig.2 Bacteriocin production from L.plantarum CGMCC No 5297 used in yoghourt

由圖2可知，植物乳桿菌CGMCC.5297所產(chǎn)的細(xì)菌素可以有效抑制單核細(xì)胞李斯特菌在酸奶中的繁殖，在1～2 d，酸奶中的單核細(xì)胞李斯特菌幾乎沒有生長，僅到了第3天才有所生長，但也比對照組生長少一半以上，說明植物乳桿菌CGMCC.5297所產(chǎn)的細(xì)菌素具有良好的食品保鮮能力，有很大的應(yīng)用價值。

3 結(jié)論

用響應(yīng)面法確定植物乳桿菌CGMCC.5297代謝產(chǎn)細(xì)菌素的最佳培養(yǎng)條件為酵母粉5.09 g/L，牛肉膏10.85 g/L，葡萄糖55.34 g/L。在此條件下，細(xì)菌素與單核細(xì)胞增多性李斯特菌共培養(yǎng)后，單核細(xì)胞增多性李斯特菌OD600nm值為0.001 73；細(xì)菌素效價為4 499 IU/mL，提高了1.4倍。

對植物乳桿菌CGMCC.5297所產(chǎn)細(xì)菌素在食品保鮮防腐方面的應(yīng)用作了初步探索，證實植物乳桿菌CGMCC.5297所產(chǎn)的細(xì)菌素可以有效抑制單核細(xì)胞李斯特菌在酸奶中的繁殖，具有良好的應(yīng)用前景。

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