趙穎，張濤，王守山，李彬，浦國斌，榮海博，俞麗娟

（公安部第一研究所，北京102200）

1 引言

人類基因組DNA有3×109bp，其中10%是串聯(lián)重復序列，稱為衛(wèi)星DNA。按重復片段的長短，又可分為大衛(wèi)星、中衛(wèi)星、小衛(wèi)星和微衛(wèi)星序列。其中重復片段為2～7bp組成的稱為微衛(wèi)星，又稱為短串聯(lián)重復序列（Short Tandem Repeat，簡稱STR）[1]，不同人體基因組衛(wèi)星DNA重復單位的數(shù)目是可變的，因此形成極其復雜的等位基因片段長度多態(tài)性[2～4]。隨著分子生物學、分子遺傳學和生物化學的迅猛發(fā)展，DNA分析在現(xiàn)代生命科學領域有著越來越重要的作用，由于它是從生物的分子-基因水平揭露生物的特性，所以具有極高的鑒定能力和廣泛的應用。自1985年英國遺傳學家Alee Jeffreys建立了DNA指紋技術以來，DNA技術已經(jīng)成為個人識別和血緣鑒定的最有效方法，在司法鑒定領域有著舉足輕重的地位。DNA分型技術歷經(jīng)了單位點DNA指紋（SLP）技術、以PCR為基礎的可變數(shù)目串聯(lián)重復序列（VNTR）與STR、小衛(wèi)星變異序列（MVR）、Y-染色體單倍型測定、單核苷多態(tài)性（SNP）及線粒體DNA（mtDNA）序列測定、基因芯片技術等[5]，分子生物學逐漸滲透到法庭科學領域。刑事案件偵破、親子鑒定、災難身份識別等越來越依賴于DNA分析技術。目前最常用于法醫(yī)DNA檢驗的遺傳標記為STR遺傳標記，這主要是由于STR分型技術原理成熟穩(wěn)定，相關的技術資源豐富，世界各國數(shù)據(jù)庫建設均以STR分型數(shù)據(jù)為基礎。可以預見，STR分型技術在今后相當長的時間內(nèi)仍是法醫(yī)DNA檢驗的主導技術[6]。

用于STR分型檢測的DNA序列分析儀及配套技術的研究不僅是多學科的交叉于綜合（涉及分析化學、分子遺傳學、生物化學、光學、電子與計算機學等），更是一項高科技產(chǎn)業(yè)，是目前乃至未來生命科學領域中的一個核心分析儀器。目前DNA分析儀主要是采用激光誘導熒光[7～9]（Laser Induced Fluorescence，LIF）方法檢測毛細管電泳（Caplillary Electrophoresis，CE）。利用激光誘導熒光檢測器可使毛細管電泳法的靈敏度大為增加[10]，因此，是目前應用最為廣泛的檢測方法。國內(nèi)之前一直沒有相應的產(chǎn)品問世，這種狀況在很大程度上限制了國內(nèi)DNA序列分析技術的推廣應用和持續(xù)發(fā)展，針對于此類分析儀的產(chǎn)品性能評價也沒有一個很好的方法。

本文針對此類產(chǎn)品的特點設計了一系列實驗方法對自主研制的GA118-16A遺傳分析儀的各項性能指標進行初步評價研究。實驗結(jié)果表明，實驗方法可行，儀器性能良好，重復性好，靈敏度高，分辨力達到單堿基分辨，滿足STR分型的要求。

2 材料與方法

2.1 檢測系統(tǒng)的模型與基本原理

GA118-16A遺傳分析儀是基于激光誘導熒光毛細管電泳檢測的DNA片段分析系統(tǒng)，如圖1所示。激光器發(fā)出的激發(fā)光經(jīng)過一系列二分鏡、反射鏡和相應的濾光片照射到毛細管中，毛細管內(nèi)徑中的熒光物質(zhì)受激發(fā)出熒光由CCD及分光系統(tǒng)收集，最后經(jīng)過A/D轉(zhuǎn)換器由計算機采集。

圖1GA118-16A遺傳分析儀示意圖

2.2 DNA樣品與化學試劑

標準DNA樣品：Gene Scan-500 LIZ（片段長度包括：50，75，100，139，150，160，200，250，300，340，350，400，450，490，500，AB公司）；主要化學試劑有：POP-4凝膠（AB公司），Hi-Di甲酰胺（AB公司），緩沖液（AB公司）。

2.3 實驗方法

2.3.1遷移速度檢測

將標準DNA樣品配制成一定濃度的電泳上樣樣品，一定電泳場強下預電泳3min，采用緩沖液平衡凝膠的過程能夠使膠均勻，在以后電泳中不會產(chǎn)生傳導率變化；采用電動進樣，精確控制進樣時間和進樣壓力，消除進樣量的偏差；毛細管溫度從進樣端至檢測端保持在60℃。依次改變電泳電壓：8、9、10、11、12、13、14、15KV。計算50～500 bp范圍內(nèi)的各個片段的遷移速度與電泳電壓的關系。

2.3.2靈敏度檢測

用標準DNA樣品作為標準不斷稀釋，配制成一系列濃度梯度的樣品，在固定電泳電壓和電泳溫度等條件下，進行電泳實驗，記錄相應的信噪比，并計算相應的樣品濃度。

2.3.3重復性檢測

將標準DNA樣品配制成一定濃度的電泳上樣樣品，相同電泳條件下平行測定數(shù)次，比較每次出峰情況。

2.3.4分辨力檢測

以PMD-18質(zhì)粒為模板自設計引物，分別合成498-504bp的DNA片段，按一定比例適當混合后進行上樣電泳，分析檢測結(jié)果。

3 結(jié)果與討論

3.1 遷移速度

遷移速度指帶電粒子在單位時間內(nèi)移動的距離。在同一電場同一介質(zhì)中的粒子，如帶電荷數(shù)不同或粒子大小不同，則各自電泳速度不同，因而電泳能使各粒子分開。遷移速度為：

式中，Q和γ分別是粒子的所帶電荷數(shù)和有效半徑，η是溶劑粘度，E為電泳時的電場強度。而電場強度為：

式中，V是電泳時的電壓，L是電泳通道總長度。所以得出：

從式中可以看出，粒子在電場中運動的遷移速度，除了與電泳電壓有關，還受到粒子所帶電荷數(shù)和有效半徑，以及溶劑粘度的影響，所以實驗中采取同一標準DNA樣品，同樣的電泳介質(zhì)以及相同的泳道長度以消除其他因素的影響。通過實驗測得不同長度片段的遷移速度與電場強度的關系如圖2所示，相對平均標準偏差為2%。

從圖2可清楚看出遷移速度與電場強度成比較好的線性關系，此外，也可清楚看出當電場強度大于280V/cm（電泳電壓大于13KV）時可完成500bp長度片段的電泳，并進行有效分離。

圖2不同長度片段遷移速度與電場強度的關系

3.2 靈敏度

DNA分析儀的探測靈敏度通常是指在信噪比大于3的情況下，DNA分析儀所能檢測到的毛細管內(nèi)染料的最低熒光濃度。

式中，D為檢出限（即靈敏度），HN為噪聲峰高，ρ為樣品的濃度，H為樣品峰高。根據(jù)實驗結(jié)果，選取樣品中同一位點的最低峰為基礎，記錄每次的峰高，計算平行測定的平均峰高，以樣品濃度對峰高作圖，如圖3。從圖3可以看出，樣品的出峰高度隨著樣品的濃度增大而升高；而當濃度降低到一定值時，峰值變化幅度也很小，這與儀器的信噪比有關，低于該值則無法對樣品進行檢測分型。根據(jù)公式（4）得出該分析儀的靈敏度為3.8×10-2ng/μL。

圖3樣品濃度與峰高的關系

3.3 重復性

重復性指在確定的測量條件下連續(xù)測試得到的普通原因（隨即變差）變差。根據(jù)實驗結(jié)果，選取任一泳道毛細管，以片段長度對出峰幀數(shù)作圖，如圖4。從圖中可以看出，對于同一位點，每次電泳時的出峰時間基本保持一致，相對標準偏差為0.8%，儀器的重復性較好，滿足STR分型要求。

3.4 分辨力

分辨力即儀器對長度相近的DNA片段的區(qū)分能力。其單位為DNA片段長度：堿基對（bp）。通過瓊脂糖凝膠平板電泳對合成的片段進行純度檢測，如圖5所示；并通過毛細管電泳對單個片段的實際片段長度進行檢測（如圖6），實驗結(jié)果表明所合成DNA片段均為質(zhì)量和純度較高的長片段DNA鏈。

圖5不同長度片段瓊脂糖凝膠平板電泳

對合成的片段進行適當濃度混合，采取進樣電壓3KV，進樣時間10s，電泳分離電壓為15KV在自行研制的118-16A遺傳分析儀上進行電泳，所得電泳圖譜如圖7所示。

在圖7中可以清楚地看出，在片段長度為500bp時，2個相差1個bp的條帶也可以很好的分離。因此通過該方法可以實現(xiàn)對DNA分析儀單堿基分辨能力的檢測。

4 結(jié)論

以Gene Scan-500 LIZ作為標準DNA樣品對GA118-16A遺傳分析儀進行初步性能評價，通過設計的實驗方案，對儀器性能進行檢測，其上樣檢測靈敏度達到3.8×10-2ng/μL，同時可實現(xiàn)單堿基分辨，重復性較高。檢測結(jié)果表明，設計的實驗方法能夠很好評價GA118-16A遺傳分析儀相應性能指標。

圖6498-501 bp DNA片段

圖7自設計DNA片段電泳分離圖

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