張爾力，董軍磊，劉琳，趙興春，葉健

（1. 中國人民公安大學，北京100038；2. 天津市公安局西青分局，天津300000；3. 廈門市公安局，廈門361003；4. 公安部物證鑒定中心， 北京100038）

男性的精子與女性的上皮細胞組成的混合斑，是性侵案件現(xiàn)場最常見的生物物證檢材。如何能夠快速清除女性成分而得到單純男性圖譜，是法醫(yī)界廣泛關(guān)注的一個難點。目前最常用的方法是經(jīng)典的“二步法”（差異裂解法）[1]，但是該方法在上皮細胞太多或者精子數(shù)太少等情況下，總是會有女性背景摻雜在男性分型中。高靈敏度的顯微激光捕獲細胞技術(shù)[2]在法醫(yī)界已經(jīng)運用得比較成熟。但是，這些方法需要專業(yè)技術(shù)人員與較高的實驗室要求。本實驗原理是在羧基功能化磁珠的表面進行一系列反應(yīng)，將抗ADAM2抗體偶聯(lián)在羧基磁珠上，制備成免疫磁珠，在一定緩沖體系下可以專一地

與精子結(jié)合，再進行洗滌，將女性上皮細胞沖洗掉，最終完成精子的捕獲，成功地獲得單一男性STR分型。實驗步驟僅需在單管中進行，且沒有太高的儀器設(shè)備要求，是一種值得探索的新方法。

1 材料和方法

1.1 材料

樣本：精子及口腔上皮細胞（女性）均為匿名健康成年人提供，兩供體為非親緣關(guān)系?；旌习邽楸緦嶒?zāi)M制備。

試劑和儀器：小型臺式離心機（賀利氏公司），漩渦振蕩器（ Scientific Industries公司，美國），磁力架（Invitrogen 公司，美國），恒溫金屬?。‥ppendorf公司，德國），ABI 9700熱循環(huán)儀（Applied Biosystems公司，美國），ABI 3130xl型遺傳分析儀（Applied Biosystems公司，美國），Qubit?熒光定量儀（Invitrogen 公司，美國），顯微鏡（Carlzeiss，德國）。表面羧基功能化磁珠（Invitrogen 公司，美國），Qubit?熒光定量試劑盒，AmpFlSTR?Identifiler plus PCR擴增試劑盒，QIAamp DNA M48提取試劑盒（Qiagen公司，德國），抗ADAM2抗體（Abcam公司，英國），蛋白酶K（20mg/ml上海生工公司，中國），DTT（二硫蘇糖醇，北京中生瑞泰科技有限公司，中國）。其余各種化學試劑均為分析純（北京中生瑞泰科技有限公司，中國）。

1.2 方法

1.2.1免疫磁珠捕獲模擬混合檢材中精子

1.2.1.1模擬混合斑樣本制備

將兩個口腔拭子浸泡在500uL反應(yīng)液中，室溫孵育1小時，震蕩，將棉花中的液體擠凈回收。根據(jù)牛鮑氏計數(shù)法計數(shù)，制備每份試驗樣本含精子和上皮細胞各為104數(shù)量級。圖1為分離前的混合樣本在普通光學顯微鏡下，兩種細胞均存在且結(jié)構(gòu)完整。同樣方法制備不同比例混合的兩種細胞的懸液，上皮細胞比精子分別為104:104，104:103，104:102，104:101。

圖1分離前的上皮細胞和精子混合樣本10×20

1.2.1.2免疫磁珠的制備

本實驗應(yīng)用EDC/NHS化學交聯(lián)法[8]制備免疫磁珠。具體步驟是：1）EDC/NHS活化羧基磁珠（EDC：1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亞胺；NHS：N-羥基琥珀酰亞胺）。2）偶聯(lián)：將適量抗ADAM2抗體與MES溶液混合，之后加入已活化的磁珠中。漩渦震蕩確保充分混合60min，避免磁珠沉淀。3）用Tris溶液淬滅未反應(yīng)的羧基基團。4）用含有適量的BSA和吐溫-20的PBS（磷酸緩沖鹽）洗滌4次去掉磁珠上的多余抗體，再將磁珠置于含有的BSA的PBS中，4℃保存。

1.2.1.3免疫磁珠分離混合細胞

將10uL免疫磁珠加入混合檢材中，室溫孵育90min，期間輕微震蕩，避免磁珠沉淀。之后將離心管置于磁力架上，吸出液體，用500uL反應(yīng)液沖洗磁珠3次，再用洗滌液清洗一次。

1.2.1.4分離后樣本處理

用QIAamp DNA M48提取試劑盒直接對小管中洗滌后的磁珠進行DNA 提取，操作按試劑盒說明進行。使用Qubit?熒光定量試劑盒按照規(guī)定步驟進行DNA定量。用AmpFlSTR?Identifiler Plus PCR擴增試劑盒10μL擴增體系擴增：反應(yīng)緩沖液（含酶）4μL、引物2μL、去離子水3μL和1uL DNA樣本。擴增程序：95℃11 min；94℃變性20s，59℃退火3min，循環(huán)29次；60 ℃終延伸30 min，15℃保持。在3130XL 型遺傳分析儀上按照標準步驟檢測擴增產(chǎn)物，用GenMapper IDv3.2軟件進行數(shù)據(jù)分析。

2 實驗結(jié)果

2.1 抗ADAM2抗體免疫磁珠捕獲混合細胞中的精子

實驗成功制備了免疫磁珠，將分離后的“免疫磁珠-精子”捕獲復(fù)合體置于電子顯微鏡下，觀察到精子的頭部吸附在免疫磁珠上（圖3），將所得的分型與樣本提供者進行比對，將有13個以上基因座分型與精子供者一致，并且各等位基因峰高大于50RFUs為標準，結(jié)果用SPSS 20統(tǒng)計學軟件進行χ2檢驗。分別對4種抗體進行比較。

結(jié)果如圖3顯示，實驗制備的免疫磁珠能將等比例混合細胞分離開，得到單一DNA STR分型（B），該分型與男性精子（D）供者一致。

2.2 靈敏度的驗證

設(shè)計不同比例的兩種細胞混合組分別與抗ADAM2抗體免疫磁珠反應(yīng)，統(tǒng)計結(jié)果如表1，在不同比例間進行比較：104:103與104:102的正確分型結(jié)果比較，P＜0.05，差異有統(tǒng)計學意義。結(jié)果表明，在目前的試劑條件下制備出的免疫磁珠，可以分離出比例高于104:103的混合細胞懸液中的精子，而不能分離出低于104:102的混合細胞懸液中的精子。

表1ADAM2免疫磁珠捕獲不同比例細胞懸液中的精子效果

圖2樣本DNA的STR分型圖

圖3電子顯微鏡下免疫磁珠捕獲精子圖

3 討論

近年來，免疫磁珠法由于其簡便、靈敏、高效的優(yōu)點，在生物醫(yī)藥領(lǐng)域的分離細胞研究中越來越受到關(guān)注[3]，學者們使用該方法分離和檢測各種人體細胞、細菌及微生物。而法醫(yī)學家嘗試用此方法解決混合斑精子的分離并取得了好的結(jié)果。Anslinger[4]等篩選1E10, 4E3和4E10三種抗體制備免疫磁珠分離精子，其中4E3效果最佳；趙興春[6]等用人精子魚精蛋白抗體和抗SPAG8抗體制備免疫磁珠，實現(xiàn)了精子的定向捕獲；李學博[7]等用抗MOSPD3抗體[8]實現(xiàn)了對104個/mL含量的精子捕獲率高達100%。

本實驗制備的抗ADAM2免疫磁珠能夠?qū)⒕訌幕旌霞毎蟹蛛x出來，靈敏度實驗顯示在精子含量為103個/uL時的分離成功率達70%，102個/uL時的成功率為0，實驗的靈敏度有待提高。靈敏度的高低首先與該抗體對應(yīng)的抗原在精子膜所處位置和含量有關(guān)，所以制備免疫磁珠時，應(yīng)優(yōu)選含量多，并且主要分布在精子頭部和頂體的抗原制備抗體；其次，還與反應(yīng)體系有關(guān)，優(yōu)化反應(yīng)體系也會對靈敏度產(chǎn)生影響，可以提高實驗的反應(yīng)靈敏度和成功率。人類精子膜抗原種類繁多，隨著研究的進行，可以尋找到多種合適抗原，合成抗體，完善試劑體系，將有可能制備出高靈敏度的免疫磁珠，簡化某些特殊性侵案件中精子和陰道上皮細胞混合檢材的處理過程，具有一定的法醫(yī)學應(yīng)用前景。

免疫磁珠分離細胞的根本原理是抗原抗體特異性反應(yīng)，該反應(yīng)受到環(huán)境影響大，對緩沖體系要求高，磁珠捕獲細胞的能力還與精子表面抗原的活性密切的關(guān)系。人精子膜抗原的本質(zhì)都是蛋白質(zhì)，而蛋白質(zhì)的活性受環(huán)境影響大。微生物、高溫、潮濕等環(huán)境都容易造成蛋白質(zhì)變性腐敗[9,10]。本實驗中使用的樣本是在理想狀態(tài)下將比較新鮮的精子和上皮細胞按一定的比例混合制成的，而真實的案件比實驗室條件復(fù)雜得多，并且精子因為受到不同外界環(huán)境的影響，表面抗原的情況會千差萬別，其蛋白活性的保持時間也會不同，所以如何選擇時效性較長的人精子表面抗原，以及免疫磁珠的保存條件及有效時間等問題，還有待深入研究探討。

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