錢海寧李 朋馬 猛李 錚*

1. 上海市交通大學醫(yī)學院附屬同仁醫(yī)院泌尿外科（上海 200336）; 2. 上海交通大學附屬仁濟醫(yī)院泌尿外科，上海市人類精子庫

梗阻性無精子癥動物不同顯微外科吻合技術的實驗研究

錢海寧1李 朋2馬 猛2李 錚2*

1. 上海市交通大學醫(yī)學院附屬同仁醫(yī)院泌尿外科（上海 200336）; 2. 上海交通大學附屬仁濟醫(yī)院泌尿外科，上海市人類精子庫

目的研究梗阻性無精子癥動物模型的制作方法,比較不同顯微外科吻合技術的優(yōu)缺點。方法將20只6周齡雄性SD大鼠隨機分成5組，包括假手術組、對照組、雙針縱向輸精管附睪套疊式吻合（VE）組、單針VE組、逆向單針VE組。除了假手術組外，各組大鼠都行近附睪端雙側輸精管結扎術，制作梗阻性無精子癥的動物模型；2周后分別行雙針VE、單針VE、逆向單針VE，對照組只行輸精管結扎術，假手術組我們把睪丸移出腹腔后再移回原位。12周后處死大鼠，檢測吻合口和輸精管結扎處精子肉芽腫形成情況，從輸精管的腹腔端向附睪注射美蘭，檢測吻合口的機械再通率。結果雙針VE組，單針VE組，逆向單針VE組的機械再通率分別是100%、75%、87.5%，精子肉芽腫的形成率分別是12.5%、12.5%、12.5%，平均手術時間是（38.1±4.3）min、（42.3±2.9）min、（41.0±3.3）min。結論雙側近附睪端輸精管結扎制作梗阻性無精子癥動物模型的方法簡單、可靠，適用于顯微VE技術訓練。單針法VE可以獲得雙針VE法相同的療效，節(jié)約手術成本，在缺少雙針縫線時不失為實用、有效的替代手術方法，逆向單針VE術能降低誤縫輸精管對側粘膜的概率。

無精子癥/外科學; 顯微外科手術

Key woorrddssazoospermia/surgery; microsurgery

在男性不育癥的患者中，6.1%[1]～13.6%[2]的患者診斷為梗阻性無精子癥，除去輸精管結扎的原因，大部分梗阻性無精子癥是由雙側附睪梗阻引起。對于附睪梗阻，輸精管附睪吻合術（vasoepididymostomy, VE）是解除梗阻的唯一方法，手術成功率與外科醫(yī)生的顯微外科經(jīng)驗密切相關[3,4]。本研究使用雙側近附睪端輸精管結扎的方法制作梗阻性無精子癥的大鼠模型，同時分析雙針VE吻合法、單針VE吻合法和逆向單針VE吻合法的術后效果。

材料和方法

一、動物取材

20只6周齡雄性SD大鼠（體重240g），隨機分成5組，每組4只，分別是假手術組、對照組、雙針吻合組、單針吻合組、逆向單針吻合組。

二、建立附睪梗阻大鼠模型

手術時使用10%水合氯醛行腹腔麻醉。除外假手術組，所有大鼠行雙側近附睪端輸精管結扎術。麻醉成功后，打開大鼠的腹腔，找到睪丸移出切口，辨認分離輸精管附睪結合部位，在結合點使用4-0手術縫線結扎輸精管。雙側完成后，睪丸放回原位，3-0可吸收縫線關閉腹腔。假手術組我們把睪丸移出腹腔后再移回原位。

三、VVEE

建立附睪梗阻模型2周后，行VE術。10%水合氯醛腹腔麻醉后，沿著原先腹部手術疤痕切開腹壁，睪丸移出切口。鈍性游離睪丸和輸精管。在4～25倍的手術顯微鏡下完成VE。在輸精管梗阻點的腹側切斷輸精管，4-0縫線結扎輸精管附睪側斷端。在附睪尾部尋找并游離一根比較飽滿的附睪管用于吻合。用9-0縫線將輸精管腹側斷端和待吻合附睪管附近的附睪背膜縫合，減少吻合口張力。

（一）雙針VE

使用兩根10-0雙針縫線縱向套疊式吻合輸精管和附睪管。首先，沿著選定的附睪管縱向平行放置2根雙針縫線的一面縫針，為了防止管腔凹陷，縫針不要抽出附睪管壁。在2根縫針之間使用顯微側切刀縱向切開附睪管，見附睪液流出，然后抽出縫針。在輸精管腹側斷端管腔內(nèi)均等分選定4個縫合點，縫針采用內(nèi)進外出的方式穿過縫合點。2根縫線打結后，附睪管就套疊進輸精管腔內(nèi)。

（二）單針VE

使用兩根10-0單針縫線縱向套疊式吻合輸精管和附睪管。第一根縫線首先在輸精管頭側斷端11點位用外到內(nèi)的方式穿過輸精管的粘膜層，然后縫針縱向穿過附睪管管壁，不要抽出縫針以防止管壁凹陷，同樣方法在輸精管頭側斷端1點放置第二根，第二根縫針在輸精管和附睪管的位置于第一根縫針平行。在2根縫針之間使用顯微側切刀縱向切開附睪管，見到附睪液，然后抽出縫針。第一根縫針在輸精管腹側斷端的7點位由內(nèi)到外的方式穿過輸精管粘膜層，第二根縫針在5點位同樣處理。2根縫線打結后，附睪管就套疊進輸精管腔內(nèi)。

（三）逆向單針VE

和單針VE基本相似，主要不同點在于，先從輸精管腹側斷端的7、5點位由外到內(nèi)穿過輸精管粘膜，同樣縫合附睪管后在輸精管斷端11、1點位由內(nèi)到外穿過輸精管粘膜（圖1）。

圖1 逆向單針縱向套疊輸精管附睪吻合術

四、術后檢測

VE后12周后處死大鼠，檢測精子肉芽腫形成情況。檢測吻合口的機械再通率，從輸精管附睪管吻合口的腹腔端向附睪注射美蘭，如果美蘭通過吻合口，進入附睪或睪丸組織，則認為吻合口通暢。

五、統(tǒng)計學分析

用費雪爾精確檢驗（Fisher’s exact test）方法比較各組機械再通率、精子肉芽腫發(fā)生率和手術時間，P＜0.05表示差異有顯著性意義。

結 果

在實驗過程中沒有動物死亡，也沒有發(fā)生手術后的感染。三種吻合方法手術所需時間、術后機械再通率和精子肉芽腫形成率見表1。三種手術方法的機械再通率分別為，100%（雙針VE）、75%（單針VE）、87.5%（逆向單針VE），無顯著性統(tǒng)計學差異（P＞0.05）；3種手術方法吻合口周圍精子肉芽腫形成率分別為12.5%、25%、25%，無顯著性統(tǒng)計學差異（P＞0.05）。平均手術時間單針VE（42.3±2.9）min和逆向單針VE（41.0±3.3）min之間差別不大，比雙針VE（38.1±4.3）略長，無顯著統(tǒng)計學差異。

表1 3種VE吻合術方法的手術效果

討 論

VE的成功率和手術醫(yī)生的顯微外科經(jīng)驗、技術密切相關，選擇合適的動物制作梗阻性無精子癥動物模型用于手術技術培訓非常重要。大鼠附睪管腔的直徑大約0.25mm，梗阻后擴張至0.5mm[5]，人附睪管直徑0.33mm梗阻后擴張至0.5mm，兩者比較接近，而且大鼠容易獲得，性價比較高，所以我們選擇大鼠制備附睪梗阻的動物模型，用于培訓醫(yī)生的顯微外科技術。行輸精管結扎時，應選擇輸精管附睪交界處結扎，這樣做有利于后期吻合，同時梗阻點和附睪炎引發(fā)的附睪輸精管梗阻點相似，比較符合國內(nèi)梗阻性無精子癥多為附睪炎引發(fā)的臨床特點。結扎后不切斷輸精管，可以減少出血，降低術后粘連和精子肉芽腫的發(fā)生，也便于在行吻合術時尋找輸精管。動物模型建立2周后，附睪和附睪管可見明顯擴張，直徑約為0.5mm。我們在實驗時發(fā)現(xiàn)延長大鼠梗阻時間（4～8周）無助于附睪管腔的進一步擴張，反而因大鼠體重上升，腹腔內(nèi)脂肪堆積增加VE的難度。

國外很多文獻比較VE治療和輔助生殖技術（ART）兩種方法治療梗阻性無精癥效果、并發(fā)癥和費用后認為：對于生精功能正常的梗阻性無精子癥患者，如果配偶生育功能正常，通過VE獲得下一代的性價比高于輔助生殖技術（包括IVF和ICSI）[6-9]，而且避免ART的缺點，例如卵巢過度刺激綜合征、多胞胎、早產(chǎn)和低體重新生兒等等，同時成功的吻合術滿足了再次生育的要求。但是相比ART在國內(nèi)發(fā)展迅猛，遍地開花，VE技術在國內(nèi)只有少數(shù)地區(qū)開展，我們通過動物實驗對3種VE吻合方法進行比較，希望有助于在更多地區(qū)開展這一技術。

在男性不育患者中，梗阻性無精子癥是少數(shù)幾種能通過手術去處病因徹底治愈的疾病。特別是引入顯微外科吻合技術后，手術后精道再通率不斷提高，最近報道雙針縱向套疊VE的再通率達到90%～100%[11-14]。雙針縱向套疊VE時，縫合輸精管時全部縫針都是內(nèi)進外出，手術操作相對簡單，也避免了誤縫輸精管對側粘膜，術后再通率高。缺點是許多醫(yī)療資源有限的地區(qū)，很難獲得吻合使用的雙針縫線，阻礙雙針輸精管附睪吻合技術的推廣普及。在本次動物實驗中，我們使用單針縫線行輸精管附睪管吻合術，2種單針吻合方法在穿越輸精管粘膜時先用顯微鑷子輕輕撐開輸精管管腔，然后再進針，進針方向先都是外進內(nèi)出，再內(nèi)進外出，這樣也可以避免誤縫對側粘膜，術后再通率同樣令人滿意[10]。單針顯微縫線容易獲取，大多數(shù)地區(qū)的泌尿外科醫(yī)生就有機會使用單針縫線學習和實施VE，有利于這一技術的推廣普及。

在本次動物實驗中，雙針VE的再通率達到100%，和已有文獻報道再通率90%～100%[11-14]接近。2種單針吻合技術和雙針吻合一樣都能使附睪管套疊進輸精管，這3種方法手術后輸精管和附睪管的相對構型是完全相同的，只是進針方向和順序不同。雙針法針先穿過附睪管，然后所有4根針由內(nèi)向外出穿過輸精管粘膜。單針法針先從11、1點位由外到內(nèi)穿過輸精管粘膜，縫合附睪管后在7、5點位由內(nèi)到外穿過輸精管粘膜。逆向單針法先從輸精管腹側斷端的7、5點位由外到內(nèi)穿過輸精管粘膜，同樣縫合附睪管后在輸精管斷端11、1點位由內(nèi)到外穿過輸精管粘膜。理論上，這3種不同縫合方法得到的吻合口是相同的。

本次實驗中2種單針吻合組術后再通率和雙針組有差別，但是差別沒有統(tǒng)計學意義，雙針吻合的優(yōu)勢是所有4根針內(nèi)進外出穿過輸精管粘膜，避免誤縫對側粘膜。我們在本次動物實驗中發(fā)現(xiàn)外進內(nèi)出穿過輸精管粘膜時，先用顯微鑷子輕輕撐開輸精管管腔，擴張輸精管內(nèi)腔，可以防止誤縫對側粘膜引起吻合口梗阻，使得單針法吻合輸精管附睪管獲得同雙針法相近的再通率。大鼠的輸精管和附睪管的管徑和人接近，結構相似，我們有理由相信單針縫合人的輸精管和附睪管時也不會誤縫對側粘膜引起吻合口梗阻。逆向單針吻合先從輸精管7、5點位由外向內(nèi)進針，對側粘膜（11、1點位）清楚暴露在手術視野下，徹底避免了誤縫對側粘膜，這是逆向單針吻合的優(yōu)勢所在。

3組實驗動物均發(fā)現(xiàn)有精液肉芽腫形成，雙針組1處，單針和逆向單針組各2處，組間差別無統(tǒng)計學意義。精液肉芽腫是由吻合口處漏出精液刺激周圍組織形成炎癥反應而產(chǎn)生[15]，我們發(fā)現(xiàn)有精液肉芽腫形成的5例吻合口只有1例不通暢，說明精液肉芽腫的形成和VE后的機械再通率沒有關系[15-17]。但是吻合口處精液漏出很有可能導致遠端輸精管內(nèi)沒有精液，造成手術失敗。為了減少精液肉芽腫的形成，是否需要在吻合口的粘膜外層更多縫合或者加縫1層，需要進一步的實驗研究。

單針組和逆向單針組的手術時間稍長于雙針組，但差別沒有統(tǒng)計學意義。事實上3種吻合方法縫針穿過輸精管、附睪管的次數(shù)是一樣的，縫線打結的數(shù)目也是相同的，我們相信通過一定時間單針吻合的訓練后，3種VE手術時間差別會越來越小。2種單針吻合術的技術難度不比雙針吻合術高，掌握雙針吻合技術的泌尿外科醫(yī)生很容易學會單針吻合技術[15]。因此，單針、逆向單針法VE是治療梗阻性無精子癥有效且容易推廣的方法。

大鼠雙側近附睪端輸精管結扎制作的梗阻性無精子癥動物模型和臨床輸精管附睪梗阻的病例相似，滿足顯微輸精管附睪吻合技術訓練要求。單針法輸精管附睪套疊式吻合安全、可行，可以獲得雙針法相同的療效，節(jié)約手術成本，在沒有雙針縫線的地區(qū)也可以開展顯微VE，逆向單針的優(yōu)勢是能降低誤縫輸精管對側粘膜的概率。

1 Aziz N, Agarwal A, Nallella KP, et al. Relationship between epidemiological features and aetiology of male infertility as diagnosed by a comprehensive infertility service provider. Reprod Biomed Online 2006; 12(2)∶209-214

2 Jequier AM. Obstructive azoospermia∶ a study of 102 patients. Clin Reprod Fertil 1985; 3(1)∶ 21-36

3 Chawla A, O’Brien J, Lisi M, et al. Should all urologists performing vasectomy reversals be able to perform vasoepididymostomies if required? J Urol 2004; 172(3)∶1048-1050

4 Thomas AJ Jr. Infertility. J Urol 2004; 172(3)∶ 829-830

5 Young GPH, Li PS, Gardner TA, et al. Animal models for microsurgical training and research, in Goldstein M (Ed)∶ Surgery of Male Infertility. Philadelphia, WB Saunders, 1995, 297-320

6 Baker K, Sabanegh ES Jr. The Role of Microsurgical Reconstruction in the Era of ICSI. In∶ Sandlow JI (ed). Microsurgery for Fertility Specialists∶ A Practical Text. New York∶ Springer Science+Business Media; 2013. p.153-166

7 Pavlovich CP, Schlegel PN. Fertility options after vasectomy∶ a cost-effectiveness analysis. Fertil Steril 1997; 67(1)∶ 133-141

8 Kolettis PN, Thoas AJ Jr. Vasoepididymostomy forvasectomy reversal∶ a critical assessment in the era of intracytoplasmic sperm injection. J Urol 1997; 158(2)∶467-470

9 Donovan JF Jr, DiBaise M, Sparks AE, et al. Comparison of microscopic epididymal sperm aspiration and intracytoplasmic sperm injection/in-vitro fertilization with repeat microscopic reconstruction following vasectomy∶ is second attempt vas reversal worth the effort? Hum Reprod 1998; 13(2)∶ 387-393

10 Peng J, Yuan Y, Zhang Z, et al. Patency rates of microsurgical vasoepididymostomy for patients with idiopathic obstructive azoospermia∶ a prospective analysis of factors associated with patency-single-center experience. Urology 2012; 79(1)∶ 119-122

11 Smrkolj T, Virant-Klun I, Sinkovec J, et al. Epididymovasostomy as the first-line treatment of obstructive azoospermia in young couples with normal spermatogenesis. Reprod Biomed Online 2010; 20(5)∶ 594-601

12 Ho KL, Wong MH, Tam PC. Microsurgical vasoepididymostomy for obstructive azoospermia. Hong Kong Med J 2009; 15(6)∶ 452-457

13 Kumar R, Mukherjee S, Gupta NP. Intussusception vasoepididymostomy with longitudinal suture placement for idiopathic obstructive azoospermia. J Urol 2010; 183(4)∶ 1489-1492

14 Chan PT, Lee R, Li PS, et al. Six years of experience with microsurgical longitudinal intussusception vasoepididymostomy (LIVE)∶ a prospective analysis. Proceedings of the 2008 Annual Meeting of the American Urological Association; 17-22 May 2008; Orlando, FL, USA. Abstract.

15 Monoski MA, Schiff J, Li PS, et al. Innovative singlearmed suture technique for microsurgical vasoepididymostomy. Urology 2007; 69(4)∶ 800-804

16 Stefanovic KB, Clark SA, Buncke HJ. Microsurgical epididymovasostomy by tubule intussusception∶ a new technique in rat model. Fertil Steril 1991; 55(1)∶ 189-193

17 Goldstein M∶ Surgical management of male infertility and other scrotal disorders, in Walsh PC, Retik AB, Vaughan ED, et al (Eds)∶ Campbell’s Urology, 8th ed. New York, WB Saunders, 2002, pp 1532-1588. 804

（2013-10-13收稿）

Study on different microsurgical anastomosis in the treatment of rat model with obstructive azoospermia

Qian Haining1, Li Peng2, Ma Meng2, Li Zheng2*
1. Department of Urology, Tong Ren Hospital, Shanghai Jiaotong University School of Medicine, Shanghai 200336, China; 2. Department of Urology, Ren Ji Hospital, Shanghai Jiaotong University School of Medicine Shanghai Human Sperm Bank

ObjectiveeTo study the method of making of obstructive azoospermia(OA) animal model, and compare the advantages and disadvantages of different microsurgical anastomosis.MetthhooddssTotal of 20 male SD rats (6-week-old) were randomly divided into 5 groups, including the sham operation group, the control group, the standard double-armed longitudinal intussusception vasoepididymostomy(VE) group, the single-armed and reverse single-armed longitudinal intussusception vasoepididymostomy groups. All rats except those in the sham operation group were treated with bilateral vasectomy (closed epididymis) to make obstructive azoospermia(OA) rat model. Two weeks after vasectomy, bilateral standard double-armed longitudinal intussusception vasoepididymostomy(VE), single-armed and reverse single-armed longitudinal intussusception vasoepididymostomy were performed in the assigned rats. Rats in the control group underwent vasectomy only. In the sham operation group, the testes of rats were moved out of the scrotum and then returned. Rats were sacrificed after 12 weeks. The anastomosis and vasectomy sites were inspected for sperm granuloma. Patency was confirmed by injecting Methylene blue from the abdominal end of the vas through the anastomoses to epididymis.RessuullttssIn the standard double-armed longitudinal intussusception vasoepididymostomy(VE), the single-armed and reverse single-armed longitudinal intussusceptionvasoepididymostomy groups, the patency rates were 100%, 75%, and 87.5%, sperm granuloma rates were 12.5%, 12.5% and 12.5%, the average operation times were 38.1±4.3min, 42.3±2.9 min, and 41.0±3.3 min, respectively.ConclussiioonnBilateral vasectomy (closed epididymis) is reliable, simple method to make obstructive azoospermia(OA) animal model, suitable for performing microscopic vasoepididymostomy(VE) training. This study suggests that the single-armed suture technique for vasoepididymostomy performing is almost as effective as the double-armed technique and can save operation cost. It allows the use of single-armed sutures to perform microsurgical vasoepididymostomy, in which double-armed sutures are not available. Reverse single-armed longitudinal intussusception vasoepididymostomy can reduce the probability of back-walling the tubular lumen.

∶ Li Zheng, E-mail∶ Lizhengboshi@163.com

R 698.2; R 699.8

*通訊作者, E-mail∶ Lizhengboshi@163.com

ddooii∶10.3969/j.issn.1008-0848.2014.02.012