李素芳，任景怡，耿 強(qiáng)，陳 紅

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循環(huán)微小RNA與冠心病診斷

李素芳，任景怡，耿 強(qiáng)，陳 紅*

（北京大學(xué)人民醫(yī)院心臟中心，北京 100044）

微小RNA (miRNA)是一類在進(jìn)化上高度保守的非編碼小分子單鏈RNA（～22個核苷酸），在基因表達(dá)調(diào)控中發(fā)揮至關(guān)重要的作用。不同臨床分型的冠心病中，循環(huán)miRNA表達(dá)譜存在明顯差異，提示循環(huán)miRNA可能成為一類具有冠心病診斷價值的新型生物標(biāo)志物。本文主要就用于診斷冠心病的循環(huán)miRNA研究進(jìn)展做一綜述，為miRNA作為新一代診斷冠心病的生物標(biāo)志物提供依據(jù)。

微小RNA；冠狀動脈疾??；生物標(biāo)志物

微小RNA（microRNA，miRNA）是一類在進(jìn)化上高度保守的非編碼小分子單鏈RNA[～22核苷酸（nt）]，在轉(zhuǎn)錄后水平負(fù)性調(diào)控靶基因的表達(dá)。目前在人體中已發(fā)現(xiàn)1000多個miRNA，約30%的人類蛋白編碼基因受到miRNA的調(diào)控[1,2]。miRNA參與體內(nèi)許多生理和病理過程的調(diào)控，與心血管疾病、糖尿病、腫瘤、感染等多種疾病的發(fā)病或預(yù)后密切相關(guān)?，F(xiàn)有許多研究表明，miRNA不僅在冠狀動脈粥樣硬化性疾病（冠心?。┑陌l(fā)生、發(fā)展中具有重要作用，而且它們還存在于血液循環(huán)，因為不同臨床分型的冠心病具有各自特異的循環(huán)miRNA表達(dá)譜，使得這些miRNA可能成為一類具有冠心病診斷價值的新型生物標(biāo)志物[3?7]。

1 miRNA的生成及作用機(jī)制

編碼miRNA的基因序列通常位于基因間或內(nèi)含子區(qū)域。miRNA的生成先后在細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)中進(jìn)行（圖1）。細(xì)胞核內(nèi)，miRNA基因首先在RNA聚合酶Ⅱ的作用下，轉(zhuǎn)錄出長約數(shù)千個堿基的初級miRNA（pri-miRNA）。隨后pri-miRNA在Drosha酶（屬于核酸內(nèi)切酶Ⅲ家族）和DGCR8組成的酶復(fù)合物作用下，生成具有莖環(huán)結(jié)構(gòu)的長約70個核苷酸的miRNA前體（pre-miRNA）[8]。之后，pre-miRNA依賴Ran-GTP/Exportin-5被轉(zhuǎn)運到胞質(zhì)[9]。胞質(zhì)中，在核酸內(nèi)切酶Ⅲ家族的另一個成員Dicer酶的剪切作用下，去除pre-miRNA的莖環(huán)結(jié)構(gòu)，形成長約22個核苷酸的miRNA雙鏈結(jié)構(gòu)（miRNA/miRNA*）[10]。

在解旋酶的作用下，通常其中一條鏈的miRNA*被降解，另一條鏈即為成熟的miRNA。后者進(jìn)入RNA誘導(dǎo)沉默復(fù)合體（RNA-induced silencing complex，RISC），通過堿基配對結(jié)合到靶mRNA 3’端非翻譯區(qū)（3’-untranslated region，3’-UTR），在轉(zhuǎn)錄后水平通過誘導(dǎo)靶mRNA降解或抑制其翻譯，進(jìn)而抑制靶基因的表達(dá)。其中miRNA的“種子區(qū)”（seed region，即miRNA 5’端第2～第8個核苷酸）與靶點序列的高度互補(bǔ)至關(guān)重要，其余序列則在miRNA與靶基因的結(jié)合過程中起輔助作用[11]。

2 循環(huán)miRNA的來源及特點

早在2008年有關(guān)腫瘤的研究中就發(fā)現(xiàn)，miRNA廣泛存在于血液循環(huán)中[12]。循環(huán)miRNA可來源于多種細(xì)胞，如血小板、紅細(xì)胞、白細(xì)胞（淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、粒細(xì)胞）、內(nèi)皮細(xì)胞、肌細(xì)胞等[11?13]，在不同的疾病狀態(tài)或病理刺激下，循環(huán)miRNA表達(dá)譜存在差異，其細(xì)胞來源也有所不同[14]。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，機(jī)體組織或細(xì)胞可能是通過微顆粒、外泌體、凋亡小體、蛋白復(fù)合物或高密度脂蛋白的方式，將miRNA釋放到血液中，但其確切機(jī)制目前尚不十分清楚。

一方面，循環(huán)miRNA在血液中以微顆粒、外泌體等形式存在，性質(zhì)十分穩(wěn)定，能夠免受RNA酶的降解、耐反復(fù)凍融、耐酸堿及耐沸水煮，并可以在室溫下長時間放置。另一方面，miRNA的表達(dá)具有組織特異性或高表達(dá)性，在某一病變的早期，這些組織特異表達(dá)或高表達(dá)的miRNA便可出現(xiàn)特定的變化，從而使其在發(fā)病的最早階段即被檢測到[15]。上述特性使循環(huán)miRNA具備了作為生物標(biāo)志物用于診斷疾病的潛力。

3 循環(huán)miRNA是診斷冠心病的新一代生物學(xué)標(biāo)志物

越來越多的研究提示，循環(huán)miRNA可能會成為一種理想的冠心病新型標(biāo)志物（表1）。由于心肌或血管存在特異表達(dá)或高表達(dá)的miRNA，故冠心病患者可因心肌或血管受損，將細(xì)胞內(nèi)這些miRNA釋放至血液中，導(dǎo)致循環(huán)miRNA表達(dá)譜發(fā)生特征性變化。而且通過real-time PCR的方法可對循環(huán)miRNA進(jìn)行較為精確的定量分析。正是依據(jù)miRNA的上述特點和優(yōu)勢，迄今已發(fā)現(xiàn)了一系列具有冠心病診斷價值的循環(huán)miRNA。

圖1 miRNA的生成及作用機(jī)制

Figure 1 Biogenesis pathway of microRNA and their potential regulation mechanisms

表1 循環(huán)miRNA在診斷冠心病中的研究

CAD: coronary artery disease; AMI: artery myocardial infarction

3.1 循環(huán)miRNA與急性心肌梗死（AMI）

雖然在臨床工作中，心肌細(xì)胞的骨架蛋白——心臟肌鈣蛋白I/T（cardiac troponin I/T，cTnI或cTnT）以其高度敏感性和特異性廣泛應(yīng)用于急性心肌梗死（acute myocardial infarction，AMI）的診斷，但它也有其自身的局限性，如：在AMI超早期（0～6h內(nèi)），血液中并不能檢測到；各醫(yī)院cTn的檢測方法尚未標(biāo)準(zhǔn)化，不同檢測方法測得的cTn值可能會不同。這些均不利于AMI更早期的診斷。目前關(guān)于循環(huán)miRNA的臨床研究均提示，miRNA具有潛在的AMI診斷價值[13,16?19,23]，因為心肌特異表達(dá)或高表達(dá)的miRNA（如miRNA-1，miRNA-21，miNAR-133，miRNA-208a，miRNA-499等）存在于細(xì)胞質(zhì)內(nèi)，當(dāng)心肌細(xì)胞受到損傷后，這些miRNA會比cTn更快地釋放到血液中，使其用于早期診斷AMI成為可能。

3.1.1 循環(huán)miRNA與ST段抬高型心肌梗死 Wang等[13]以肌細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)豐富或心肌特異表達(dá)的miRNAs，如miRNA-1，miRNA-133，miRNA-499，miRNA-208a為檢測指標(biāo)，來評價這些miRNA是否可以作為診斷AMI的標(biāo)志物，且優(yōu)于cTnI。最終他們發(fā)現(xiàn)，與健康志愿者（＝30）、非AMI冠心病患者（＝16）或患有其他心血管疾病的患者相比，AMI患者（＝33）血漿中miRNA-1，miRNA-133a，miRNA-499和miRNA-208的含量均顯著升高。特別是miRNA-208a，在AMI患者出現(xiàn)心肌梗死（myocardial infarction，MI）癥狀后4h內(nèi)，即可以檢測到，而此時血漿中cTnI水平尚未升高。他們通過受試者工作特征曲線（receiver operator characteristic curve，ROC曲線）分析發(fā)現(xiàn)，在4個miRNA中，miRNA-208a診斷AMI的特異性為100%、敏感性為90.9%。該研究結(jié)果提示，血液循環(huán)中miRNA-208a可能是優(yōu)于cTnI、早期診斷AMI更為特異和敏感的心肌損傷標(biāo)志物。D’Alessandra等[16]的研究表明，AMI患者血漿miRNA-1，miRNA-133a和miRNA-133b的達(dá)峰時間均早于cTnI。與健康對照組（＝17）相比，AMI患者（＝33）miRNA-1、miRNA-133a、miRNA-133b達(dá)峰時間在發(fā)病后2～3h，而cTnI的達(dá)峰時間則出現(xiàn)在發(fā)病后3～4h。

此外，也有一些非心臟特異或高表達(dá)的miRNA——miRNA-30a和miRNA-195具有潛在的AMI診斷價值。Long等[23]的研究表明，循環(huán)miRNA-30a在患者發(fā)病后4h開始高表達(dá)，miRNA-195高表達(dá)則出現(xiàn)在發(fā)病后8h。通過ROC曲線分析發(fā)現(xiàn)，它們診斷AMI特異性及敏感性均＞90%。遺憾的是，它們的表達(dá)變化出現(xiàn)時間及達(dá)峰時間均晚于cTnI。

3.1.2 循環(huán)miRNA與非ST段抬高型心肌梗死（non-ST elevation myocardial infarction，NSTEMI） 由于NSTEMI患者常缺乏典型癥狀和明顯的心電圖改變，且心肌炎、急性充血性心力衰竭（congestive heart failure，CHF）等非冠心病也可引起cTn的升高，故可能會延誤病情的診治。miRNA作為診斷AMI的潛在標(biāo)志物，對此類患者的早期診治具有重要意義。

Olivieri等[18]以伴有CHF的老年NSTEMI患者[＝92，年齡（82.6±6.9）歲]、未患AMI的CHF患者[＝81，年齡（81.3±6.8）歲]、健康受試者[＝99，年齡（79.5±5.4）歲]為研究對象，以循環(huán)中miRNA-1，miRNA-21，miRNA-133a，miRNA-208a，miRNA-423-5p（在心力衰竭患者循環(huán)中升高[24]）和miRNA-499-5p為檢測指標(biāo)，來篩選用于診斷此類患者的循環(huán)miRNA標(biāo)志物。研究發(fā)現(xiàn)，與健康對照組相比，急性NSTEMI患者miRNA-499-5p升高最明顯，達(dá)80倍之多，其余4個miRNA升高3～10倍。與CHF患者相比，急性NSTEMI患者miRNA-499-5p和miRNA-21的水平明顯增加。值得一提的是，與cTnT或超敏cTnT（hs-CTnT）相比，miRNA-499-5p在鑒別診斷NSTEMI（＝31）和急性CHF患者（＝32）的過程中，具有更高的診斷正確率[miRNA-499-5p ROC曲線下面積（area under the ROC curve，AUC）＝0.86，cTnT AUC＝0.68，hs-cTnT AUC＝0.70]。

3.2 循環(huán)miRNA與心絞痛

目前臨床上尚不存在特異診斷心絞痛的生物標(biāo)志物，其確診主要依賴患者的臨床癥狀及冠狀動脈造影檢查。因為miRNA與動脈粥樣硬化的發(fā)展進(jìn)程密切相關(guān)[25]，如miRNA-126調(diào)節(jié)單核細(xì)胞的黏附、miRNA-92a調(diào)節(jié)血管新生、miRNA-133a/b與miRNA-145調(diào)節(jié)平滑肌細(xì)胞增殖及凋亡等。這些均提示，冠心病患者在未出現(xiàn)MI前，其循環(huán)miRNA表達(dá)譜可能已出現(xiàn)異常。因此，循環(huán)miRNA可能成為診斷心絞痛的有效生物標(biāo)志物。

3.2.1 循環(huán)miRNA與穩(wěn)定型心絞痛 Fichtlscherer等[21]研究發(fā)現(xiàn)，穩(wěn)定型心絞痛患者（＝67）與健康對照者（＝31）相比，前者血漿中內(nèi)皮細(xì)胞來源的miRNA-126，miRNA-17，miRNA-92a及平滑肌細(xì)胞來源的miRNA-145水平明顯降低，而心肌細(xì)胞來源的miRNA-133a和miRNA-208a水平明顯升高。血管高表達(dá)的miRNA在循環(huán)中出現(xiàn)下調(diào)，提示這些miRNA可能在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)受抑制或被其病變血管所攝取。而具有抗心肌細(xì)胞凋亡作用、心肌來源的miRNA-133a在循環(huán)中出現(xiàn)上調(diào)，提示處于冠心病早期的患者，其心肌細(xì)胞可能已經(jīng)出現(xiàn)損傷。上述這些循環(huán)miRNA出現(xiàn)異常，可能成為冠心病患者心肌損傷的早期預(yù)警信號。

需要指出的是，常用心血管藥物可以影響循環(huán)miRNA的表達(dá)譜[26,27]。穩(wěn)定冠心病患者循環(huán)中內(nèi)皮祖細(xì)胞來源的miRNA-221，miRNA-222水平及外周血單核細(xì)胞來源的miRNA-146a，miRNA-146b水平明顯升高，應(yīng)用阿托伐他?。╝torvastatin）與血管緊張素Ⅱ受體拮抗劑治療12個月后，miRNA-221，miRNA-222，miRNA-146a和miRNA-146b的表達(dá)水平較前明顯降低。這些研究提示，在尋找用于診斷該疾病的循環(huán)miRNA標(biāo)志物時，可能要避開容易受到藥物影響的miRNA。

3.2.2 循環(huán)miRNA與不穩(wěn)定型心絞痛 目前關(guān)于不穩(wěn)定型心絞痛患者循環(huán)miRNA表達(dá)譜的研究相對較少。Hoekstra等[12]研究發(fā)現(xiàn)，與穩(wěn)定型心絞痛相比，不穩(wěn)定型心絞痛患者外周血單核細(xì)胞中的miRNA-198，miRNA-134和miRNA-370水平均明顯升高。該研究提示，可以尋找不穩(wěn)定型心絞痛與穩(wěn)定型心絞痛患者差異表達(dá)的循環(huán)miRNA，用于兩種不同類型的冠心病患者的鑒別診斷。

4 問題及展望

雖然眾多臨床研究均發(fā)現(xiàn)了具有冠心病診斷價值的miRNA，但這些研究的規(guī)模均較小，因而仍可能具有一定的偶然性；且檢測miRNA的血液標(biāo)本處理方式不統(tǒng)一，有些是血漿標(biāo)本，有些則是血清標(biāo)本，新近還出現(xiàn)了全血標(biāo)本；最常用的血漿標(biāo)本又分富血小板血漿、乏血小板血漿、無血小板血漿，這種經(jīng)過不同離心力獲得血漿標(biāo)本，miRNA的表達(dá)譜是不一樣的[30]。故要尋找用于診斷疾病的miRNA，必須要統(tǒng)一血液標(biāo)本的處理方式。此外，miRNA的檢測借助實時PCR技術(shù)，這一檢測手段雖然敏感，但與cTn的檢測技術(shù)相比，步驟較多，報送時間不占優(yōu)勢，限制了其在臨床的應(yīng)用。

雖然目前關(guān)于循環(huán)miRNA作為診斷疾病標(biāo)志物的研究尚處于起步階段，距臨床應(yīng)用還有相當(dāng)遠(yuǎn)的距離，但現(xiàn)有的研究結(jié)果均提示，循環(huán)miRNA可能會成為穩(wěn)定型心絞痛、不穩(wěn)定型心絞痛、AMI患者早期預(yù)警標(biāo)志物。隨著研究的深入，研究規(guī)模的擴(kuò)大，檢測技術(shù)手段的不斷進(jìn)步，相信未來會有特異的、敏感的miRNA作為冠心病的診斷指標(biāo)，進(jìn)入臨床檢驗項目之中。

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（編輯: 張青山）

Circulating microRNA and the diagnosis of coronary heart disease

LI Su-Fang, REN Jing-Yi, GENG Qiang, CHEN Hong*

(Center of Cardiology, Peking University People’s Hospital, Beijing 100044, China)

MicroRNA (miRNA) are highly conserved, non-coding, short, single-chain RNA (～22 nt), and play essential roles in regulating gene expression. Many studies have shown that circulating miRNA profiles are significantly varied in different clinical types of coronary artery disease (CAD), which indicates that miRNA may be a new kind of diagnostic biomarker for CAD. In this paper, the research progress in circulating miRNA in diagnosing CAD was reviewed, so as to provide a basis for their application as promising diagnostic biomarker for CAD.

microRNA; coronary artery disease; biomarker

(2012ZX09303019)(81270274)(7132225,7122198)(2011-4022-03).

R541.4

A

10.3724/SP.J.1264.2014.00089

2013?11?11;

2014?01?08

國家科技重大專項“重大新藥創(chuàng)制”項目（2012ZX09303019）；國家自然科學(xué)基金（81270274）；北京市自然科學(xué)基金（7132225，7122198）；首都衛(wèi)生發(fā)展科研專項項目（2011-4022-03）

陳 紅, E-mail: chenhongbj@medmail.com.cn