唐紅衛(wèi)，王成彬

解放軍總醫(yī)院 臨床檢驗科，北京 100853

NF-κB及p38MAPK信號通路對支氣管上皮細胞與中性粒細胞共培養(yǎng)IL-6分泌的調(diào)控作用

唐紅衛(wèi)，王成彬

解放軍總醫(yī)院 臨床檢驗科，北京 100853

目的 探討支氣管上皮細胞(bronchial epithelial cells，BEAS-2B)與中性粒細胞(neutrophils，NEU)聯(lián)合培養(yǎng)時IL-6分泌的機制。方法免疫磁珠法提取外周血中性粒細胞，建立中性粒細胞與BEAS-2B細胞聯(lián)合培養(yǎng)體系。應用Roche cobas e411檢測上清液中IL-6濃度。結(jié)果BEAS-2B和中性粒細胞聯(lián)合培養(yǎng)時，上清液IL-6濃度為(3 691±482.3) pg/ml，與細胞單獨培養(yǎng)[BEAS-2B(313.4±34.7) pg/ml；NEU(219.1±11.3) pg/ml]差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.001)；蛋白質(zhì)印跡法(Western blotting)結(jié)果顯示BEAS-2B和中性粒細胞聯(lián)合培養(yǎng)可激活BEAS-2B細胞內(nèi)NF-κB及p38MAPK的信號通路；而加入NF-κB通路抑制劑MG-132，可有效抑制上清液中IL-6的分泌[(1 075.3±83.9) pg/ml vs (3 691±482.3) pg/ml，P＜0.01]；p38MAPK通路抑制劑SB203580亦能抑制IL-6的分泌[(1 532.8±176.1) pg/ml vs (3 691±482.3) pg/ml，P＜0.01]；且MG-132的抑制效果明顯好于SB2035580[(1 075.3±83.9) pg/ml vs (1 532.8±176.1) pg/ml，P＜0.01]；當聯(lián)合使用兩種抑制劑(MG-132和SB203580)時可進一步減少IL-6的分泌[(353.1±33.5) pg/ml vs (1 075.3±83.9) pg/ml，P＜0.01；(353.1±33.5) pg/ml vs (1 532.8±176.1) pg/ml，P＜0.01]。結(jié)論BEAS-2B細胞與NEU細胞接觸后激活BEAS-2B細胞體內(nèi)NF-κB及p38MAPK通路，進而調(diào)控IL-6的分泌。

支氣管上皮細胞；中性粒細胞；IL-6；信號通路；

細胞因子(cytokines，CK)可調(diào)控炎癥反應或作為炎癥反應的效應分子，參與炎癥細胞的發(fā)育、成熟、分化、募集、活化的各個環(huán)節(jié)，因此在氣道炎癥性疾病的發(fā)病機制中發(fā)揮重要作用。白介素-6(interleukelin-6，IL-6)是細胞因子大家庭的重要一員，主要由單核巨噬細胞、內(nèi)皮細胞、上皮細胞及淋巴樣細胞產(chǎn)生，是一種多效應細胞因子[1-2]。在氣道炎癥發(fā)病機制中，IL-6主要作為協(xié)同因子與IL-4、IL-5、IL-13促進B細胞分化成熟與IgE合成，但IL-6不能單獨使靜息的B細胞合成IgE[3-5]。一些研究表明支氣管上皮細胞與嗜酸性粒細胞聯(lián)合培養(yǎng)可刺激IL-6的分泌，并且IL-6的分泌與NF-κB及p38MAPK信號轉(zhuǎn)導通路密切相關[6-7]。然而，中性粒細胞作為氣道炎癥反應的主要效應細胞，其在IL-6的分泌過程中發(fā)揮的作用卻少有研究。本次試驗，我們重點探討支氣管上皮細胞與中性粒細胞聯(lián)合培養(yǎng)，上清液中IL-6產(chǎn)生的細胞內(nèi)調(diào)控機制。

材料和方法

1 材料 實驗所需靜脈血取自健康志愿者，13.8%枸櫞酸鈉抗凝；BEAS-2B細胞由軍事醫(yī)學科學院朱茂祥教授惠贈；來自于正常人的支氣管上皮細胞NHBE，美國專利號：U. S. Pa.t 4885238，引進時細胞代齡為22代。

2 儀器與試劑 Anti-CD16免疫磁珠、磁性分離器、LS分離柱(Miltenyi Biotech，德國)，全自動血細胞分析儀(SysmexXE-2100，日本)，Cobas e411及其配套試劑(Roche，德國)。Phospho-IκBα (Ser32) (14D4) Rabbit mAb、Phospho-p38 MAPK Rabbit mAb(Cell Signal Technology，美國)，山羊抗兔IgG/辣根酶標記(中杉金橋，中國)，SB-203580(Selleck，美國)，MG-132(Selleck，美國)。

3 中性粒細胞的提取與共培養(yǎng)體系的建立 取抗凝全血20 ml，采用免疫磁珠法提取中性粒細胞，全自動血細胞分析儀鑒定中性粒細胞濃度，錐蟲藍染色鑒定細胞活力；取純度＞95%、活力＞90%的中性粒細胞，DMEM/F12培養(yǎng)基重懸待用[8-9]。BEAS-2B細胞培養(yǎng)于DMEM/F12培養(yǎng)基(含10%胎牛血清)，37℃，5% CO2，95%濕度培養(yǎng)，待形成單層細胞時加入中性粒細胞。抑制性實驗中，BEAS-2B細胞和中性粒細胞預先用抑制劑SB-203580或MG-132處理1 h[10-11]。

4 IL-6檢測 BEAS-2B細胞按8×104/孔接種于48孔板，待細胞融合＞95%，每孔加入5×105中性粒細胞，共孵育8 h。收集單獨或混合培養(yǎng)2 h、4 h、8 h、12 h時的各組細胞上清液，置于無菌管中，1 500 r/min，離心10 min。用Roche Cobase 411機器檢測各組上清液中IL-6的濃度。

5 Western blot檢測BEAS-2B細胞內(nèi)NF-κB及p38MAPK信號通路的活性 BEAS-2B細胞按6.4×105/孔接種于6孔板中，待形成單層細胞時，每孔加入4×106中性粒細胞，共孵育15 min (p38MAPK 30 min)，收集BEAS-2B細胞。胰酶消化，收集BEAS-2B細胞[12-13]。加入RIPA高效裂解液，4℃，12 500 r/min×5 min，收集上清液，即為所提取蛋白。加入上樣緩沖液，煮沸15 min，進行10% SDS-PAGE凝膠電泳。電泳結(jié)束后，采用半干轉(zhuǎn)膜法將蛋白轉(zhuǎn)入PVDF膜上。用5%脫脂奶粉封閉4 h，然后加入兔源性單克隆抗體，4℃，過夜。TBST洗膜3次，加入山羊抗兔IgG/辣根酶標記抗體，室溫1 h。洗膜3次，加入發(fā)光液，顯影。

6 統(tǒng)計學處理 采用SPSS16.0進行統(tǒng)計學分析，結(jié)果均以表示；各組間IL-6結(jié)果比較采用單因素方差分析檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結(jié) 果

1 免疫磁珠陽選法分離純化外周血中性粒細胞免疫磁珠陽選法分離純化中性粒細胞，全自動血細胞分析儀測中性粒細胞純度為97.4%，錐蟲藍染色測中性粒細胞活力＞98%。

2 上清液中IL-6的濃度 BEAS-2B細胞及NEU細胞單獨培養(yǎng)時，上清液中僅分泌少量IL-6。將兩種細胞共孵育2 h、4 h、8 h、12 h時，發(fā)現(xiàn)上清液中IL-6的含量均較單獨培養(yǎng)時明顯增加；且隨著共孵育時間的延長，IL-6的分泌量亦逐漸增加，至8 h時達峰值(圖1)；而加入NF-κB通路抑制劑MG-132，可有效抑制上清液中IL-6的分泌；p38MAPK通路抑制劑SB203580亦能抑制IL-6的分泌；且MG-132的抑制效果明顯好于SB2035580；當聯(lián)合使用兩種抑制劑(MG-132和SB203580)時可進一步減少IL-6的分泌。見表1。

3 BEAS-2B細胞內(nèi)NF-κB、p38 MAPK的活性Western blotting結(jié)果顯示：BEAS-2B細胞單獨培養(yǎng)時，細胞內(nèi)不表達Phospho-IκBα；加入中性粒細胞聯(lián)合培養(yǎng)后，細胞內(nèi)Phospho-IκBα的表達量顯著增加，即聯(lián)合培養(yǎng)激活細胞內(nèi)NF-κB通路；加入NF-κB通路抑制劑MG-132后，BEAS-2B細胞內(nèi)Phospho-IκBα表達量下降(圖2A)。BEAS-2B單獨培養(yǎng)時表達低水平的Phosphop38MAPK；受到中性粒細胞刺激后Phospho-p38MAPK的表達量明顯增加，而抑制劑SB-203580能有效抑制BEAS-2B細胞體內(nèi)Phosphop38MAPK的表達(圖2B)。

表1 共培養(yǎng)8 h時IL-6的分泌量Tab. 1 Level of IL-6 when BEAS-2B and neutrophils were co-cultured for 8 h

圖 1 不同共培養(yǎng)時間對IL-6分泌的影響B(tài):BEAS-2B細胞；N：Neutrophils。 a：P＜0.01,與BEAS-2B細胞單獨培養(yǎng)比較；b：P＜0.001,與BEAS-2B細胞單獨培養(yǎng)比較Fig. 1 Effect of different co-cultured time on IL-6 secretion B: BEAS-2B cell; N: Neutrophils. a：P＜0.01, compared with BEAS-2B cells alone; b: P＜0.001, compared with BEAS-2B cells alone

圖 2 Western blot 檢測BEAS-2B細胞內(nèi)NF-κB、p38-MAPK通路的活性Fig. 2 Activity of NF-κB and p38-MAPK in BEAS-2B cells detected by Western blot

討 論

氣道炎癥時，受損的支氣管上皮周圍聚集大量中性粒細胞、單核細胞、巨噬細胞、肥大細胞、T淋巴細胞等。這些細胞相互作用，并釋放大量細胞因子(IL-6、MCP-1、GM-CSF等)參與支氣管上皮的損傷、修復和重建[14-15]。研究證實支氣管上皮細胞在IL-6的分泌過程中發(fā)揮重要作用。我們研究表明，靜息狀態(tài)下的BEAS-2B細胞及NEU細胞僅能分泌少量的IL-6，這可能與維持機體正常的生理活動有關。當BEAS-2B細胞接受中性粒細胞刺激后，2 h即可見上清液中IL-6含量明顯增加，并且隨著共培養(yǎng)時間的延長，IL-6的含量逐漸上升，至8 h左右達峰值，12 h IL-6含量下降。NF-κB是轉(zhuǎn)錄因子Rel家族的重要成員，靜息狀態(tài)下與I-κB構(gòu)成異源二聚體(NF-κB/ I-κB)，而不具備生物活性。當接受外界刺激后，可以觸發(fā)激酶活化和繼后的I-κB分子的磷酸化，后者可迅速降解并導致NF-κB/I-κB復合物的分離。然后活化的NF-κB異二聚體穿過核膜進入核內(nèi)，并將κB元件與相應基因結(jié)合導致轉(zhuǎn)錄活化。p38-MAPK通路是絲裂原活化蛋白激酶的重要成員，在基因表達調(diào)控和細胞質(zhì)功能活動過程中發(fā)揮重要作用，而P38-MAPK蛋白的磷酸化是p38-MAPK通路激活的先決條件。因此，為探討NF-κB及p38-MAPK通路在IL-6分泌中所起的作用，我們采用Western blot檢測BEAS-2B細胞內(nèi)phosphor-IκB蛋白及phosphor-P38MAPK蛋白水平。本研究發(fā)現(xiàn)，單獨培養(yǎng)的BEAS-2B細胞內(nèi)phosphor-IκB蛋白及phosphor-P38MAPK表達量極低；在接受中性粒細胞刺激后，BEAS-2B細胞內(nèi)IκB和P38MAPK蛋白磷酸化水平明顯增加。從而說明BEAS-2B細胞與中性粒細胞聯(lián)合培養(yǎng)可激活BEAS-2B細胞內(nèi)NF-κB通路及p38-MAPK通路。為進一步探明，NF-κB通路及p38-MAPK通路與IL-6分泌之間的關系，我們在實驗中加入NF-κB通路抑制劑MG-132和p38-MAPK通路抑制劑SB203580。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，抑制劑MG-132及SB203580均可減少聯(lián)合培養(yǎng)組上清液中IL-6的含量，并且MG-132的抑制效果較SB-203580好，聯(lián)合使用兩種抑制劑可進一步抑制IL-6的分泌，使IL-6含量恢復至正常水平。這說明IL-6的分泌主要受NF-κB及p38-MAPK通路的調(diào)控，通過抑制通路的活性可減少IL-6的分泌，而且NF-κB通路在調(diào)控IL-6的分泌過程中占主要位置。

綜上所述，支氣管上皮細胞直接參與氣道炎癥過程，中性粒細胞與支氣管上皮細胞接觸后，主要通過激活支氣管上皮細胞內(nèi)的NF-κB、p38MAPK信號轉(zhuǎn)導通路，直接或間接調(diào)控IL-6的分泌，而NF-κB通路抑制劑、p38MAPK通路抑制劑可極大減少IL-6的分泌。因此，研究NF-κB通路抑制劑、p38MAPK通路抑制劑對控制氣道炎癥效果具有重要臨床意義。

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Regulation of NF - κB and p38MAPK on IL-6 induced by the co-culture between neutrophils and bronchial epithelial cells

TANG Hong-wei, WANG Cheng-bin
Department of Clinical Laboratory, Chinese PLA General Hospital, Beijing 100853, China

WANG Cheng-bin. Email：wangcb301@126.com

ObjectiveTo investigate the secretory mechanism of interleukin (IL)-6 when bronchial epithelial cells were co-cultured with neutrophils.MethodsNeutrophils were isolated by immune-magnetic beads positive selection method and a system of human bronchial epithelial cells co-cultured with human neutrophils was constructed. The level of IL-6 was detected by the Cobas e411.ResultsThe level of IL-6 (3 691±482.3) pg/ml in the supernatant was signifcantly higher than the cells cultured singly [BEAS-2B (313.4±34.7) pg/ml; NEU (219.1±11.3) pg/ml], (P＜0.001). Western blotting suggested that NF-κB and p38-MAPK in BEAS-2B could be activated when BEAS-2B was co-cultured with neutrophils. The release of IL-6 could be inhibited effectively with MG-132 (the proteasome inhibitor of NF-κB) [(1 075.3±83.9) pg/ml vs (3 691±482.3) pg/ml, P＜0.01]. SB203580, the proteasome inhibitor of p38-MAPK, could also inhibit the release of IL-6 [(1 532.8±176.1) pg/ml vs (3 691±482.3) pg/ml, P＜0.01]. However, the MG-132 performed better than SB203580 in inhibiting the release of IL-6 [(1 075.3±83.9) pg/ml vs (1 532.8±176.1) pg/ml, P＜0.01]. The release of IL-6 decreased further when treated with the two inhibitors [(353.1±33.5) pg/ml vs (1 075.3±83.9) pg/ml) P＜0.01; (353.1±33.5) pg/ml vs (1 532.8±176.1) pg/ml, P＜0.01].ConclusionThe signal transduction pathway of NF - κB and p38MAPK in BEAS-2B can be activated, which can regulate the release of IL-6, when BEAS-2B are co-cultured with neutrophils.

bronchial epithelial cells; neutrophils; IL-6; signal pathway

R 562.25

A

2095-5227(2014)07-0730-04

10.3969/j.issn.2095-5227.2014.07.023

時間：2014-04-01 17:42

http://www.cnki.net/kcms/detail/11.3275.R.20140401.1742.004.html

2014-03-12

軍隊醫(yī)學科研十二五重大專項(CWS12J021)；國家科技支撐計劃(2013BAI17B05)

Supported by the 12th Five Years major special Projects of Chinese PLA Medical Technologies(CWS12J021); National Key Technology R&D Program (2013BAI17B05)

唐紅衛(wèi)，男，在讀碩士，技師。研究方向：免疫。Email：tanghongwei301@163.com

王成彬。Email：wangcb301@126.com