姚綱　胡紅焱　梁慧等

[摘要] 目的 探索一種快速鑒定臨床標本中革蘭氏陽性桿菌的方法。 方法 利用PCR技術(shù)擴增待檢菌株的16 S rRNA基因序列，通過分析待檢菌株的16 S rRNA基因序列對其進行鑒定。 結(jié)果 5株待檢菌株的16 S rRNA基因序列均成功擴增，其中4株的16 S rRNA基因序列與基因庫中已注冊的核酸序列相似率達99.9%以上，將其鑒定到種的水平，1株的16 S rRNA基因序列與基因庫中雷弗森菌屬的核酸序列相似率為97.09%，將其鑒定為雷弗森菌屬。 結(jié)論 應(yīng)用16 S rRNA基因序列分析可快速、準確地鑒定臨床標本中的革蘭氏陽性桿菌。

[關(guān)鍵詞] 16 S rRNA基因；細菌鑒定；革蘭氏陽性桿菌

[中圖分類號] R446.5 [文獻標識碼] A [文章編號] 1674-4721（2014）03（a）-0094-03

近年來，隨著人口老齡化、免疫損害宿主增加等因素的影響，革蘭氏陽性桿菌感染的發(fā)病率有升高趨勢[1-3]。常見的革蘭氏陽性致病桿菌有單核細胞增生性李斯特菌、棒狀桿菌、紅斑丹毒絲菌、諾卡菌、產(chǎn)氣莢膜梭菌、艱難梭菌以及炭疽桿菌等。革蘭氏陽性桿菌感染其表型特征的敏感性及特異性較差，通過常規(guī)檢驗手段對其進行快速、準確的鑒定比較困難。2012年3～10月，本研究從臨床標本中相繼分離出5株革蘭氏陽性無芽胞桿菌。為了快速、準確地鑒定這些菌株，筆者利用PCR技術(shù)對其16 S rRNA基因進行擴增，然后通過16 S rRNA基因序列分析將其鑒定至屬或種的水平。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 5株革蘭氏陽性桿菌均分離自北京武警總醫(yī)院各科臨床標本，菌株編號分別為QC0411、QC0823、Y0720、Z0802、20983。

1.1.2 試劑 Chelex-100樹脂（伯樂公司，美國），瓊脂糖G-10（Gene公司，美國），溴乙錠（Promega公司，美國），Ex Taq聚合酶試劑盒及DL2000 DNA Marker均購自寶生物工程大連有限公司。16 S rRNA基因的擴增選用16 S rRNA基因細菌通用引物（F：5′-AGAGTT-TGATCCTGGCTCAG-3′；R：5′-ACGGCTACCTTGTTACGACTT-3′）[4]，引物由上海生工生物工程有限公司合成。

1.1.3 儀器 TC-312 PCR儀（Techne公司，英國），EPS-100核酸電泳儀（圣科儀器設(shè)備有限公司，上海），Gel Logic 100凝膠電泳成像儀（柯達公司，美國）。

1.2 方法

1.2.1 基因組DNA提取 參照文獻[5]用Chelex-100法提取。

1.2.2 16 S rRNA基因擴增 16 S rRNA基因擴增反應(yīng)體系由10×Ex Taq 緩沖液（Mg2+ Plus）5 μl、dNTP 混合物（各2.5 mmol/L）4 μl、引物F（10 μmol/L）及引物R（10 μmol/L）各2 μl、Ex Taq聚合酶 （5 U/μl） 0.25 μl、基因組DNA 4 μl組成，最后用無菌去離子水補足至50 μl。PCR反應(yīng)條件為95℃預(yù)變性5 min，然后95℃變性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸2 min，30個循環(huán)后72℃延伸5 min。

1.2.3 擴增結(jié)果檢測 取5 μl PCR產(chǎn)物于1.5%瓊脂糖凝膠電泳，溴乙錠染色后通過凝膠電泳成像儀照相觀察，確認目標基因擴增成功后，PCR產(chǎn)物送北京天一輝遠生物科技公司測序。

1.2.4 同源性鑒定 將測得的16 S rRNA基因序列用Vector NTI Advance（v.11.5.1）序列分析軟件包進行人工校讀，去除兩端測序圖譜不清容易引起混淆的序列，并對2個引物的雙向測序結(jié)果進行拼接[6]。登陸GenBank（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank）和核糖體工程數(shù)據(jù)庫（http：//rdp.cme.msu.edu/index.jsp），將測得的各菌株的16 S rRNA基因序列與基因庫中已注冊的核酸序列進行同源性比對。

2 結(jié)果

2.1 16 S rRNA基因擴增結(jié)果

所有菌株的16 S rRNA基因均擴增成功，反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)電泳檢測在約1500 bp處有一清晰條帶，與預(yù)期目的片段長度相符（表1）。

3 討論

傳統(tǒng)的細菌鑒定以分離培養(yǎng)為前提，然后依據(jù)其形態(tài)學(xué)、生理生化特征進行鑒定，從標本采集到得出明確的鑒定結(jié)果往往需要3～4 d甚至更長時間，且準確性不十分理想，給臨床及時指導(dǎo)診治帶來一定的困難。微生物自動鑒定系統(tǒng)的推廣應(yīng)用使這一現(xiàn)象有所改觀，但這種完全基于表型特征的鑒定技術(shù)仍然具有內(nèi)在的缺陷。PCR擴增技術(shù)及DNA 分子測序技術(shù)的發(fā)展，為細菌在基因水平的鑒定提供了技術(shù)保障，16 S rRNA基因序列分析已被廣泛應(yīng)用于細菌鑒定[7-8]。本研究通過擴增、分析待檢菌株的16 S rRNA基因序列，對5株革蘭氏陽性桿菌進行了快速、準確的鑒定，給臨床及時診治提供了可靠的依據(jù)。

16 S rRNA基因序列揭示了物種間內(nèi)在的親緣關(guān)系及其演化過程，目前已成為細菌鑒定的“金標準”。16 S rRNA基因序列全長約1550 bp，其核苷酸序列具有高度保守性，同時在保守區(qū)之間存在9～10個可變區(qū)，可變區(qū)在不同科、屬、種間存在一定的變異，可通過比較不同細菌的16 S rRNA基因序列間的差異對其進行分類鑒定[8]。隨著PCR及自動化DNA測序技術(shù)的不斷發(fā)展，細菌16 S rRNA基因序列分析的研究越來越成熟。目前，幾乎所有病原菌的16 S rRNA基因均已完成測序并錄入基因庫[7]。Bosshard等[9]認為，16 S rRNA基因序列相似率>99%鑒定為同一個種，95%～99%鑒定為同一個屬。本研究中4株待檢菌株的16 S rRNA基因序列與基因庫中已注冊的核酸序列相似率達99.9%以上，據(jù)此將其鑒定到種的水平；菌株Y0720的16 S rRNA基因序列與基因庫中雷弗森菌屬的核酸序列相似率為97.09%，將其鑒定為雷弗森菌屬。用此項技術(shù)鑒定臨床標本中的細菌，從標本送檢到得出鑒定結(jié)果，整個過程只需2～3 d，且鑒定指標單一、明確，即以保守的16 S rRNA基因序列為基準，通過可變區(qū)序列的差異加以鑒定，而傳統(tǒng)技術(shù)必須綜合大量的指標才能鑒定[10]，所以，對于臨床少見細菌及非典型菌株的鑒定，16 S rRNA基因序列分析可作為常規(guī)鑒定方法的有力補充，但由于原核生物的16 S rRNA基因序列具有高度保守性，故對于親緣關(guān)系較近的種或同一種內(nèi)不同菌株間的鑒別分辨力有限，且基因擴增、測序只能在具有一定條件的機構(gòu)和地區(qū)開展，因而限制了此項技術(shù)的應(yīng)用。

[參考文獻]

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（收稿日期：2014-01-22 本文編輯：許俊琴）

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（收稿日期：2014-01-22 本文編輯：許俊琴）

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（收稿日期：2014-01-22 本文編輯：許俊琴）