王 秋，張學(xué)成，李進(jìn)道

（中國(guó)海洋大學(xué)海洋生命學(xué)院，山東 青島266003）

半索動(dòng)物腸鰓類(lèi)廣泛分布于南、北兩半球的大洋沿岸以及深海中，迄今發(fā)現(xiàn)有60～70種。它們大多數(shù)為底內(nèi)動(dòng)物，營(yíng)穴居生活，少數(shù)種類(lèi)為底上動(dòng)物，棲息于海藻或石塊之間。由于形態(tài)構(gòu)造、胚胎發(fā)育和繁殖方式的特點(diǎn)，在生物進(jìn)化研究中占有重要的地位。

再生（Regeneration）是動(dòng)物和植物中常見(jiàn)的生物學(xué)現(xiàn)象，指生物體對(duì)失去的結(jié)構(gòu)重新自我修復(fù)或代替的過(guò)程，生物器官或組織損傷后，保留的部分生長(zhǎng)出與原來(lái)形態(tài)與功能相同的器官或組織的現(xiàn)象。半索動(dòng)物是一類(lèi)再生能力較強(qiáng)的動(dòng)物，其再生和無(wú)性生殖較早引起了學(xué)者的注意。Spengel在描述腸鰓類(lèi)一般形態(tài)時(shí)，首次提到了腸鰓類(lèi)具有與無(wú)性生殖有密切關(guān)系的再生現(xiàn)象[1]。Kuwano發(fā)現(xiàn)三崎柱頭蟲(chóng)（Balanoglossus misakiensis）具有再生現(xiàn)象[2]。Dawydoff以實(shí)驗(yàn)的方法比較全面的研究了微小舌形蟲(chóng)（Glossobanlanuss minutus）的再生現(xiàn)象[3]。Gilchrist研究了翼柱頭蟲(chóng)（Ptychodera）的雙態(tài)性（Dimorphism）和無(wú)性繁殖[4]。Morton發(fā)現(xiàn)柱頭蟲(chóng)（Balanoglossusaustrallensis）也存在無(wú)性生殖現(xiàn)象[5]。Tweedell將玉鉤蟲(chóng)科（Harrimanlidae）科氏長(zhǎng)吻蟲(chóng)（Saccoglossuskowalevlevskii）的蟲(chóng)體橫切為2段觀察它們的再生現(xiàn)象[6]。Petersv指出：翼柱頭蟲(chóng)（Ptychodera）、柱頭蟲(chóng)（Balanoglossus）和舌形蟲(chóng)（Glossobanlanus）都是以同一模式進(jìn)行無(wú)性生殖[7]。Miyamoto研究了柱頭蟲(chóng)（Balanoglossussimodensis）蟲(chóng)體不同斷片的再生現(xiàn)象[8]。

1960年，中國(guó)海洋大學(xué)生命學(xué)院（原山東海洋學(xué)院生物系）胚胎學(xué)教研室李嘉泳教授指導(dǎo)作者開(kāi)始了三崎柱頭蟲(chóng)（Balanoglossusmisakiensis）生殖和發(fā)育的研究。1966年因故工作中斷。在1980年重新開(kāi)展三崎柱頭蟲(chóng)生殖和發(fā)育研究的工作時(shí)，多次發(fā)現(xiàn)了它們具有再生現(xiàn)象，并做了深入的研究。

1 材料和方法

1.1 樣品的采集

1980—1982 年，每年6～10月，在山東省青島市辛島灣潮間帶采集完整無(wú)缺的三崎柱頭蟲(chóng)（Balanoglossusmisakiensis），柱頭蟲(chóng)用裝有海水的廣口保溫瓶當(dāng)日帶回實(shí)驗(yàn)室飼養(yǎng)。

1.2 飼養(yǎng)方法

實(shí)驗(yàn)用柱頭蟲(chóng)均以直徑25cm，高12cm的圓形水槽進(jìn)行室內(nèi)飼養(yǎng)，以采集地區(qū)的沙質(zhì)基質(zhì)鋪滿(mǎn)水槽底部（厚度約5～6cm）。水槽內(nèi)砂質(zhì)基質(zhì)上自然生長(zhǎng)的底棲硅藻和碎屑作為主要餌料，另投入人工培養(yǎng)的三角褐指藻（Phaeodactylumtricornutum）。飼養(yǎng)水溫控制在17～20℃。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1980年6 月～1982年6月采集的部分三崎柱頭蟲(chóng)在暫養(yǎng)期間發(fā)生了自切，在上述培養(yǎng)條件下對(duì)自切片段的再生進(jìn)行了觀察，共觀察了6條個(gè)體。1981年秋～1982年春對(duì)113條柱頭蟲(chóng)進(jìn)行了人工手術(shù)橫切后的再生實(shí)驗(yàn)。使用剃刀片（或發(fā)縛）對(duì)三崎柱頭蟲(chóng)做橫切手術(shù)，橫切手術(shù)類(lèi)型和橫切部位如下：

A型 自蟲(chóng)體的生殖翼和肝區(qū)之間橫切為2段。手術(shù)時(shí)確保蟲(chóng)體后段肝囊的完整。

B型 將蟲(chóng)體橫切為3段。Ⅰ段包括吻、領(lǐng)、鰓區(qū)及生殖翼；Ⅱ段是肝區(qū)部分；Ⅲ段是肝囊以后的腸和肛門(mén)。C型 將蟲(chóng)體橫切為4段。Ⅰ段包括吻、領(lǐng)、和鰓區(qū)；Ⅱ段是鰓區(qū)后面的生殖翼部分；Ⅲ段是肝囊；Ⅳ段是腸區(qū)和肛門(mén)。

切割后的蟲(chóng)體斷片飼養(yǎng)方法如上所述，對(duì)照個(gè)體（4例）與實(shí)驗(yàn)個(gè)體置于同一條件下飼養(yǎng)。

能夠重建全部失去的器官，恢復(fù)完整的個(gè)體，并且生活習(xí)性和生存能力與母體相同的斷片視為再生個(gè)體，否則視為未再生斷片。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 自切后再生觀察

1980年6月28 日采集了1條柱頭蟲(chóng)，雌性，體長(zhǎng)約40cm，身體細(xì)長(zhǎng)柔軟，消化道內(nèi)充滿(mǎn)沙粒和碎屑，身體表面裹以黏液和沙粒。洞穴呈U字形，深度約15cm，生殖翼不夠豐滿(mǎn)，采集時(shí)氣溫為25℃，洞穴內(nèi)水溫為24℃，打開(kāi)洞穴時(shí)可以嗅到強(qiáng)烈的碘氣味，可能是三碘甲烷氣體[CHI3]。在飼養(yǎng)過(guò)程中，蟲(chóng)體夜間離開(kāi)洞穴活動(dòng)，見(jiàn)光后鉆入基質(zhì)，生殖翼逐漸豐滿(mǎn)。8月底采集地自然環(huán)境條件下柱頭蟲(chóng)的生殖期已過(guò)，但是已經(jīng)達(dá)到了產(chǎn)卵前狀態(tài)的飼養(yǎng)個(gè)體沒(méi)有排卵。9月2日飼養(yǎng)水溫提升到25℃，由于升溫的刺激，迅速排放了卵子，數(shù)小時(shí)之內(nèi)生殖翼中的卵子幾乎全部排光。排卵后的蟲(chóng)體于9月3日沿著生殖翼的中后部自切為前、后2個(gè)段片。前段包含吻、領(lǐng)、鰓區(qū)和生殖翼的一部分，后段包含生殖翼大部、肝囊區(qū)、腸區(qū)和肛門(mén)。缺少吻的后段雖然維持生命狀態(tài)直到10月初，但是始終不能鉆入基質(zhì)，沒(méi)有攝食行為，沒(méi)有出現(xiàn)再生前端器官的跡象，歷時(shí)近1個(gè)月解體。前段從自切到開(kāi)始攝食和開(kāi)始鉆入基質(zhì)的時(shí)間不足48h，恢復(fù)夜間離開(kāi)洞穴活動(dòng)，清晨再鉆進(jìn)基質(zhì)的生活習(xí)性。9月底前段生殖翼的后端發(fā)生了明顯退化，并進(jìn)行重建（Remodeling）活動(dòng)。10月底重建的前段生長(zhǎng)良好，再生出肝囊和腸，成為完整的個(gè)體，生活習(xí)性完全恢復(fù)了正常，夜出晝伏，攝食積極。后由于室內(nèi)溫度連續(xù)下降，蟲(chóng)體活動(dòng)能力逐漸減弱，鉆進(jìn)基質(zhì)耗費(fèi)的時(shí)間愈來(lái)愈長(zhǎng)，12月初室溫下降到7℃時(shí)，蟲(chóng)體完全失去鉆進(jìn)基質(zhì)的能力，在基質(zhì)表面自切為數(shù)段，不久即完全死亡。再生蟲(chóng)體體長(zhǎng)最終達(dá)到母體體長(zhǎng)的一半，大約20cm。這條柱頭蟲(chóng)在飼養(yǎng)條件下共生活了156d。

1981年7月2 日采集了另一條柱頭蟲(chóng)，雄性，體長(zhǎng)約35cm。7月4日，蟲(chóng)體在肝囊的后部邊沿處自切為2個(gè)段片。7月5日，前段又沿著生殖翼的后部發(fā)生了自切。7月6日，后部的2個(gè)段片死亡。惟有前端的斷片可以鉆入基質(zhì)，7月底重建再生了后部的肝囊、腸和肛門(mén)，恢復(fù)了正常生活（見(jiàn)圖1）。10月15日自然死亡，體長(zhǎng)約15cm。共生存105d。

圖1 三崎柱頭蟲(chóng)自切再生蟲(chóng)體Fig.1 A regenerative body of B.misakiensis by self－cleavage

1981年10月6 日和16日采集的2批柱頭蟲(chóng)，飼養(yǎng)期間各有1條個(gè)體沿著肝囊的前部自切為2個(gè)段片。再生情況與上述基本一致，前段能夠重建蟲(chóng)體失去的后部所有器官，后段未能再生出失去的蟲(chóng)體前部。

1982年5～6 月間，又觀察到2條自切為2段的個(gè)體，再生情況同上述基本一致。

2.2 橫切手術(shù)后再生實(shí)驗(yàn)

1981年秋～1982年春對(duì)84條柱頭蟲(chóng)做了A型、B型和C型分類(lèi)手術(shù)橫切實(shí)驗(yàn)，1982年4月對(duì)29條柱頭蟲(chóng)做了C型手術(shù)橫切重復(fù)實(shí)驗(yàn)（見(jiàn)表1）。

實(shí)驗(yàn)切割的斷片70%能存活20d以上，46%能存活30d以上。各種不同手術(shù)類(lèi)型的Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ段片都沒(méi)有重建失去的器官和恢復(fù)完整的個(gè)體，沒(méi)有再生能力。

不同手術(shù)類(lèi)型的Ⅰ段片都能不同程度地重建失去的后部器官。能夠重建全部失去的器官，實(shí)現(xiàn)再生的比率很高。手術(shù)橫切再生的蟲(chóng)體見(jiàn)圖2。

84條橫切為2段、3段和4段的實(shí)驗(yàn)，Ⅰ段片的再生率分別為44%、59%和52%。29條C型手術(shù)橫切為4個(gè)段片的重復(fù)實(shí)驗(yàn)，Ⅰ段片再生率為17%。包括重復(fù)實(shí)驗(yàn)在內(nèi)的113條試驗(yàn)蟲(chóng)體Ⅰ段片的平均再生率為42%。生存30d以上的Ⅰ段片，65%實(shí)現(xiàn)了再生。3種不同切割類(lèi)型的Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ斷片均未發(fā)生再生。4例對(duì)照個(gè)體，在實(shí)驗(yàn)期間均發(fā)生了自切再生，情況如前所述。

3 討論

本文結(jié)果表明，三崎柱頭蟲(chóng)具有吻和領(lǐng)的自切前端機(jī)體幾乎都能再生，重建失去的后部器官；具有吻和領(lǐng)的手術(shù)橫切斷片重建能力也很強(qiáng)，大約半數(shù)能再生缺失器官。生存時(shí)間越長(zhǎng)的手術(shù)斷片，實(shí)現(xiàn)再生的可能性越大，生存30d以上的斷片65%可能再生。但是失去吻和領(lǐng)的自切和手術(shù)橫切兩者的其它斷片均失去了這種再生能力?？梢?jiàn)，含有吻和領(lǐng)的前端機(jī)體，對(duì)三崎柱頭蟲(chóng)的器官重建、再生個(gè)體的重要性。

表1 三崎柱頭蟲(chóng)橫切斷片成活與再生個(gè)體的統(tǒng)計(jì)Table 1 Regeneration of transverse parts in Balanoglossusmisakiensis

圖2 三崎柱頭蟲(chóng)手術(shù)橫切再生蟲(chóng)體Fig.2 A regenerative body of B.misakiensis by operational cleavage

Tweedell[6]以玉鉤蟲(chóng)科（Harrimanlidae）的科氏長(zhǎng)吻蟲(chóng)（Saccoglossuskowalevlevskii）為材料，將蟲(chóng)體橫切為2段觀察它們的再生現(xiàn)象。結(jié)果隨著斷面自吻部逐步向后移動(dòng)，后面片斷再生身體前部器官的能力逐漸減弱。當(dāng)斷面在鰓區(qū)后部時(shí)，斷片的再生極性發(fā)生了改變，即后段失去了再生前部器官的能力，而前段的后端卻有較強(qiáng)的再生出身體后部器官的能力。他認(rèn)為科氏長(zhǎng)吻蟲(chóng)再生極性與切割面的部位有關(guān)。Miyamoto[8]將柱頭蟲(chóng)（Balanoglossussimodensis）橫切為10段，也發(fā)現(xiàn)蟲(chóng)體不同斷片再生能力不同的現(xiàn)象。

Dawydoff[3]以實(shí)驗(yàn)的方法比較全面的研究了微小舌形蟲(chóng)（Glossobanlanussminutus）的再生現(xiàn)象。他將蟲(chóng)體從頭部到尾部切為4段，Ⅰ段為吻和領(lǐng)部，Ⅱ段為鰓、生殖翼部，Ⅲ段為肝囊區(qū)和部分腸區(qū)，Ⅳ段為腸區(qū)和肛門(mén)。結(jié)果Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ段的前端均再生出吻、領(lǐng)和鰓等器官，第Ⅰ段沒(méi)有再生出身體的后部器官。說(shuō)明微小舌形蟲(chóng)除了含有吻和領(lǐng)的機(jī)體前端沒(méi)有再生能力之外，機(jī)體其它部位的再生能力具有一致性，即有能力重建缺失的器官、再生出新的個(gè)體。

值得注意的是，三崎柱頭蟲(chóng)的再生極性和微小舌形蟲(chóng)的再生極性表現(xiàn)出完全不同的分化。三崎柱頭蟲(chóng)只有含有吻和領(lǐng)部的前部機(jī)體能夠重建失去的器官實(shí)現(xiàn)再生，機(jī)體的其它部位沒(méi)有這種能力。這種現(xiàn)象與已經(jīng)研究過(guò)的其它腸鰓類(lèi)動(dòng)物[3，6，8]也是不相同的，值得進(jìn)一步研究。

R9ttinger等[9]綜述了半索動(dòng)物的發(fā)育，認(rèn)為這類(lèi)動(dòng)物處于動(dòng)物發(fā)育的十字路口，并且可能成為研究再生現(xiàn)象的模式生物。

4 結(jié)論

（1）三崎柱頭蟲(chóng)與其它腸鰓類(lèi)相同，有較強(qiáng)的再生能力。

（2）三崎柱頭蟲(chóng)自切或?qū)嶒?yàn)切割后，具有吻、領(lǐng)及鰓區(qū)的前段蟲(chóng)體具有再生后部器官恢復(fù)完整個(gè)體的能力。不具有這些器官的其它斷片則沒(méi)有再生能力。

（3）柱頭蟲(chóng)與舌形蟲(chóng)相比較，再生能力在性質(zhì)上具有明顯的差異。

附言：國(guó)內(nèi)柱頭蟲(chóng)的研究工作始于1930年代。1960年代初進(jìn)行了生殖生態(tài)研究，獲得了早期胚胎，受到先師童第周先生的重視和支持。1960年代中期工作中斷了。1980年代初期在飼養(yǎng)過(guò)程中發(fā)現(xiàn)了柱頭蟲(chóng)的再生現(xiàn)象，開(kāi)始對(duì)其再生進(jìn)行研究。這次實(shí)驗(yàn)是國(guó)內(nèi)至今僅有的一次柱頭蟲(chóng)再生實(shí)驗(yàn)，先后經(jīng)歷了四代人的努力，歷時(shí)三十余年。世界在這方面的研究也極少見(jiàn)。因?yàn)橄x(chóng)體柔軟易斷和營(yíng)底內(nèi)生活的習(xí)性，完整活體標(biāo)本不易采集到是研究極少的重要原因之一。唐樂(lè)明、王統(tǒng)崗、劉海玲等幫助采得了大量的完整活體標(biāo)本，錢(qián)培元、吳敏寧、管永紅等學(xué)生參加了工作，僅致謝意！

[1]Spengel J W.Die Enteropneusten des Golfes von Neapel und der angrenzenden Meeres－Abschnitte[J].Fauna u Flora d Golfes von Neapel Monogr，1893，18：684.

[2]Kuwano H.On a new enteropneust from Misaki，Balanoglossus misakiensissp[J].Annot Zool Jap，1902，4：77－84.

[3]Dawydoff C.Beobachtungen uber Regenerations prozess bei den Enteropneusten[J].Zeitschr Wiss Zool，1909，93：237.

[4]Gilchrist J.Dimorphism and asexual reproduction inPtychodera capensis.J[J].Linnaean Soc，1923，35：393.

[5]Morton J E.The occurrence in New Zealand of the enteropneustBalanoglossusaustrallensis[J].Trans Roy Soc，1950，78：464－466.

[6]Tweedell K S.Regeneration of the enteropneustSacclglossus kawalevskii[J].Biol Bull，1961，120：118－127.

[7]Petersv J A N，Ditadi A S F.Asexual reproduction inGlossobalanuscrozieri（Ptychoderidae，Enteropneusta，Hemichordata）[J].Mar Biol，1971，9：78－85.

[8]Miyamoto N，Saito Y.Morphological characterization of the asexual reproduction in the acorn wormBalanoglossussimodensis[J].Dev Growth Differ，2010，52：615－727.

[9]Eric R9ttinger E，Christopher J，Lowe C J.Evolutionary crossroads in developmental biology：hemichordates[J].Development，2012，139：2463－2475.