付 峰，隋正紅，常連鵬，周 偉，魏惠惠

（1.中國海洋大學海洋生物遺傳學與育種教育部重點實驗室，山東 青島266032；2.煙臺大學海洋學院，山東 煙臺264005）

龍須菜（Gracilariopsislemaneiformis）是我國重要的產(chǎn)瓊膠紅藻，是主要的瓊膠來源；其多糖成分還具有抗氧化和抗腫瘤等一些生理活性，具有開發(fā)醫(yī)藥產(chǎn)品與保健食品的價值；它還被用做養(yǎng)殖鮑魚的主要鮮品飼料；龍須菜養(yǎng)殖可以修復淺海生態(tài)環(huán)境，有效防止海洋赤潮[1－2]。我國龍須菜的人工栽培始于1980年代，目前已成為我國繼海帶和紫菜之后的第三大栽培海藻。龍須菜栽培業(yè)不僅促進了瓊膠制造業(yè)的發(fā)展，還產(chǎn)生了良好的生態(tài)效益，對促進我國的海水養(yǎng)殖事業(yè)的可持續(xù)發(fā)展具有重要的意義[3]。

野生型龍須菜主要分布在我國山東半島的潮間帶，其最適生長溫度是12～23℃。隨著龍須菜養(yǎng)殖業(yè)的不斷發(fā)展，其耐高溫性、生長速率及瓊膠含量仍亟待提高，以擴大其栽培地域并延長栽培時間，進一步提高產(chǎn)品產(chǎn)量和質(zhì)量。1998年張學成等[3]采用 N－甲基－N’－亞硝基胍（MNNG）誘變，經(jīng)過10a的栽培選育出了耐高溫品系981，其生長速率、瓊膠含量和耐高溫性均得到了顯著地提高，在我國南方海域得到了廣泛推廣，它能夠耐受的最高溫度由原來的23℃提高到了26℃[4]，然而981仍然不能夠在南方成功渡夏，因此亟待選育出更加耐高溫的品系，來滿足龍須菜栽培業(yè)的需要。

高溫脅迫可以破壞植物體活性氧（ROS）代謝的平衡，導致產(chǎn)生過量的活性氧，引起細胞傷害。過量的活性氧可以引起膜脂過氧化，產(chǎn)生丙二醛（MDA）。丙二醛的含量與高溫對細胞的傷害程度有關[5－6]。植物通過體內(nèi)抗氧化系統(tǒng)來抵御氧化壓力，研究顯示高溫脅迫下植物體抗氧化酶的活性在植物耐高溫中起著重要作用，在藻類中的研究顯示也是如此[7－8]。超氧化物歧化酶（SOD）是抗氧化系統(tǒng)中主要的一種酶，研究顯示它的活性變化與藻體的耐熱性相關。熱激蛋白基因（hsp）的表達也是藻類應對高溫脅迫的一種響應機制，當藻體受到高溫脅迫時，體內(nèi)的熱激蛋白基因會大量表達，參與體內(nèi)新生肽鏈的折疊、組裝以及變性蛋白的復性和降解，緩解高溫脅迫帶來的傷害，產(chǎn)生耐熱性[9－10]。

本實驗首次利用紫外線誘變方法處理龍須菜果孢子，通過對其進行紫外誘變，進一步探索選育龍須菜優(yōu)良品系的適宜方法。本文以耐高溫作為主要性狀篩選龍須菜抗逆突變體，就高溫脅迫對突變株藻體與981和野生型的MDA含量，SOD活性以及hsp70基因的表達情況等方面的影響進行了比較分析，旨在建立適于龍須菜耐高溫品系的篩選方法和選育出龍須菜的高產(chǎn)抗逆品系，為進一步將其應用于生產(chǎn)打下基礎。

1 材料與方法

1.1 果孢子體的培養(yǎng)和誘導放散

本實驗用材料為2011年10月采自青島湛山灣的野生果孢子體。用毛刷刷洗除去雜藻。采用f/2培養(yǎng)基，培養(yǎng)溫度為（20±1）℃，光強30μmol/（m2·s），光暗周期12L∶12D。每周更換一次培養(yǎng)基。

將經(jīng)過處理的雌配子體切成2cm長的藻段，置于9cm玻璃培養(yǎng)皿中，加入培養(yǎng)基30mL，每個培養(yǎng)皿中藻體切段數(shù)為4～6段，培養(yǎng)條件同上。定期觀察，待果孢子大量放散。

1.2 果孢子紫外誘變

將剛放散附著在玻璃平皿中的果孢子用來進行紫外誘變，誘變劑量為20W紫外燈（254nm），距離為30 cm，照射時間設置為0、10、20、30、40、50、60s共7個時間梯度。每個時間梯度設置3個平行。紫外線照射后加入f/2培養(yǎng)基，避光黑暗培養(yǎng)24h，然后再恢復至光下培養(yǎng)，培養(yǎng)條件（20±1）℃，15μmol/（m2·s），12L∶12D。誘變后第7天對存活的果孢子進行統(tǒng)計。在倒置顯微鏡10倍物鏡下（×200），隨機挑選20個視野，顏色保持紅褐色的記為存活的，統(tǒng)計存活的孢子數(shù)目，用來計算果孢子的紫外誘變致死率，致死率/%＝（1－存活孢子數(shù)目/總孢子數(shù)）×100%。

1.3 耐高溫藻株的篩選

選擇剛附著未經(jīng)誘變處理的野生果孢子，培養(yǎng)在（20±1）℃的培養(yǎng)箱中，光強30μmol/（m2·s），光暗周期12L∶12D，每周更換1次培養(yǎng)基。待其長至5cm左右長的幼苗期時（約8周后），將培養(yǎng)在玻璃培養(yǎng)皿中的幼苗置于高溫水浴，溫度分別設置為36～42℃共計6個溫度梯度，每個溫度設置3個平行，脅迫培養(yǎng)30min，然后再置于培養(yǎng)溫度為（20±1）℃條件黑暗培養(yǎng)12h，恢復至光下培養(yǎng)；5d后觀察藻株存活情況，計算存活率。導致野生型幼苗全部死亡的最低溫度即確定為致死溫度，作為幼苗期突變藻株耐高溫篩選的溫度。

將紫外誘變后生長至5cm長的四分孢子體幼苗置于上述溫度預實驗確定的篩選溫度，水浴熱脅迫30min，將存活的藻體經(jīng)培養(yǎng)成熟后，每株稱取約0.1g藻段，每株設3個平行，置于35℃高溫脅迫培養(yǎng)72h，觀察藻體狀態(tài)，存活下來的即初步認定為耐高溫藻株。

1.4 日平均生長速率的測定

1.4.1 實驗室內(nèi)高溫培養(yǎng) 稱取0.5g鮮重的突變體藻株、981和野生型藻體，置于含300mL滅菌海水（含f/2培養(yǎng)基）的500mL三角燒瓶中，培養(yǎng)在培養(yǎng)箱中，溫度為（28±1）℃，光照強度30μmol/（m2·s）（12L∶12D），培養(yǎng)3個周，每周更換1次培養(yǎng)基。每株藻體設置3個平行。在培養(yǎng)結(jié)束后稱量藻體鮮重。

1.4.2 膠州灣海上培養(yǎng) 2012年9月20日～10月20日，將初篩得到的耐高溫藻株掛于青島膠州灣海區(qū)進行栽培試驗，海區(qū)水溫18～25℃，平均水溫21.5℃（數(shù)據(jù)來自國家海洋局官網(wǎng)，http：//www.soa.gov.cn）。每個品系各夾苗10根。在膠州灣海區(qū)掛養(yǎng)30d后稱重。

按照下列公式計算龍須菜的日平均生長速率（Specific Growth Rate，SGR）：

SGR ＝100 （lnWt－lnW0）/t，

式中，SGR/%·d－1為日平均生長速率，Wt為第t天的藻體濕重/g；W0為初始夾苗量/g。

1.5 抗逆特征分析

稱取0.2g鮮重的突變體、981和野生型藻體，置于含200mL滅菌海水（含f/2培養(yǎng)基）的500mL三角燒瓶中，在培養(yǎng)溫度（32±1）℃，光照強度30μmol/m2·s（12L∶12D）培養(yǎng)1、2、3d。熱脅迫后，稱取0.1g藻體立即置于液氮中凍存，然后儲存于－80℃用來進行后續(xù)的測定。每株藻體設置3個平行。在（20±1）℃培養(yǎng)的沒有經(jīng)過熱脅迫的藻體作為對照組。

1.5.1 丙二醛（MDA）含量 MDA含量采用硫代巴比妥酸比色法測定[11]。將0.1g鮮重的樣品，加入0.05mol/L的磷酸緩沖液（pH＝7.8）5mL研磨成勻漿。加入5mL含有0.5%硫代巴比妥酸的5%的三氯醋酸，混合液沸水浴加熱10min，冷卻后，10 000×g離心15min，收集上清，分別測定在450、532和600nm處的吸光值。MDA（μmol/g FW）含量計算如下：

MDA＝[6.45× （A652－A600）－0.56×A450]×Vt/（1 000×FW），

其中，Vt：上清的體積/mL；FW：樣品鮮重/g。

1.5.2 過氧化物歧化酶（SOD）活性測定 SOD活性采用氮藍四唑（NBT）法測定[11]。將0.1g鮮重的樣品，加入含有1%吡咯烷酮的0.05mol/L磷酸緩沖液（pH＝7.8）5mL研磨成勻漿。收集上清為粗酶液，10 000×g離心10min。將含有100μL粗酶液的試管中加入100mmol/L磷酸緩沖液（pH＝7.8）2.55mL，130mmol/L的甲硫氨酸300μL，0.75mmol/L氮藍四唑（NBT）300μL，0.1mmol/L的EDTA·Na2300μL和0.02mmol/L核黃素60mL。將試管置于35℃，光照強度為50μmol/（m2·s）處顯色20min。用可見分光光度計在560nm處測定溶液的吸光值?？偟鞍缀坑每捡R斯亮藍染色法測定[12]。總SOD活性（U/g），比活力（U/mg prot）計算如下：

總SOD活性＝（A0－As）×Vt/（A0×0.5×FW×Vs）比活力＝ 總SOD活力/總蛋白含量，其中，A0：光下對照的吸光值；As：樣品的吸光值；Vt：粗酶液的體積/mL；Vs：參加反應的粗酶液的體積/mL；FW：樣品的鮮重/g。

1.6 熱激蛋白基因hsp70的表達情況分析

稱取0.2g鮮重的突變體、981和野生型藻體，置于含200mL滅菌海水（含f/2培養(yǎng)基）的500mL三角燒瓶中，在32℃培養(yǎng)箱中熱脅迫4h，光照強度30 μmol/（m2·s）。在（20±1）℃培養(yǎng)的沒有經(jīng)過熱脅迫的藻體作為對照組。實驗設置3個重復。采用熒光定量PCR方法來確定熱脅迫條件下熱激蛋白基因hsp70的表達量。

總RNA的提取采用Plant RNA Kit試劑盒（購自OMEGA），cDNA 合成利用 RT reagent kit with gDNA Eraser試劑盒（購自TaKaRa）。根據(jù)hsp70－1[13]全長cDNA 序列設計特異性引物 Hsp70－s/Hsp70－a（見表1），根據(jù)龍須菜 18SrRNA 序列（GenBank：JN561078.1）設計內(nèi)參基因引物 18SrRNA－s/18S rRNA－a（見表1）。QRT－PCR采用SYBR Select Master Mix（購自上海英維捷基）在 ABI 7500熒光定量PCR儀上進行，所有的反應設置3個平行。hsp70mRNA 的表達量用2－ΔΔCT方法進行計算[14]。

表1 熒光定量PCR中設計的引物序列Table 1 Sequence of primers used in Quantitative RT－PCR

1.7 數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 20.0進行單因素方差分析（ANOVA），采用最小顯著差數(shù)（LSD）法進行，以P0.05為差異顯著性水平。

2 結(jié)果

2.1 紫外誘變條件的確定

紫外誘變預實驗采用了從0～60s的不同輻射時間，來確定紫外誘變的半致死劑量。從圖1可以看出，果孢子對紫外線輻射比較敏感。在紫外線輻射30s時，果孢子的致死率為60.46%，輻射60s時致死率為93.21%。根據(jù)實際的致死率，得出紫外誘變的線性致死率（見圖1）。通過圖1中的公式計算得，在致死率為50%時的紫外輻射時間約為27s，致死率為80%時的紫外輻射時間約為48s。

為了獲得較高的正突變率，又不至于造成大部分細胞死亡[15]，本實驗選用了20W 紫外燈，照射距離30cm，輻射時間為48s的誘變條件。

2.2 篩選溫度的確定

5cm長的龍須菜四分孢子體幼苗經(jīng)高溫脅迫30 min后，結(jié)果顯示其對高溫變化比較敏感，在41℃高溫水浴處理30min的條件下，野生型四分孢子體幼苗的存活率為0（見圖2）。以沒有野生型幼苗存活的最低處理溫度作為致死溫度，用來進行突變藻株的耐高溫篩選。因此，在后續(xù)的實驗中采用41℃作為突變藻株幼苗耐高溫的篩選溫度。

圖1 不同紫外誘變時間對果孢子的致死率Fig.1 The lethal rate of carpospores by UV irradiation at different doses

圖2 不同溫度脅迫下幼苗的存活率Fig.2 The survival of tetrasporophyte under different temperature

2.3 果孢子的紫外誘變和耐高溫藻株的篩選

剛附著的果孢子（每個平皿中大約有105個孢子，共60個平皿）經(jīng)紫外誘變后，存活的藻體幼苗培養(yǎng)在9cm玻璃培養(yǎng)皿中，經(jīng)41℃熱脅迫30min，3d后觀察發(fā)現(xiàn)一些藻體尖端變白，有的甚至整個藻體變白死亡。隨著培養(yǎng)時間的延長，有的尖端變白的藻體恢復為紅棕色。5d后觀察藻體存活情況，此時整個藻體均保持紅棕色的藻體被認定為存活的藻株，初步認定其為耐高溫幼苗。

耐高溫幼苗長至成熟藻體后，經(jīng)35℃脅迫培養(yǎng)72h后，仍有部分藻體在高溫脅迫下出現(xiàn)藻體變綠、變白死亡的現(xiàn)象，另外一部分藻體經(jīng)脅迫后仍然能保持活力，藻體顏色保持紅棕色，經(jīng)此2次篩選后存活的藻株初步認定其為耐高溫藻株，用于后期性狀分析。

2.4 日平均生長速率的測定

將初步篩選獲得的耐高溫藻體和981藻株以及野生型，分別經(jīng)過在實驗室和在海上的培養(yǎng)后，其中2株藻體具有較快的日平均生長速率，被命名為BZT－11和BZT－18。

2株突變株的日平均生長速率與981藻株和野生型進行了比較分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在實驗室內(nèi)和海上培養(yǎng)的兩株突變體的生長速率明顯比981藻株和野生型快，而且差異極顯著（P＜0.01）（見圖3）。

圖3 藻株在實驗室（A）和海上（B）條件下的日平均生長速率Fig.3 The specific growth rate of tetrasporophyte under different cultivation in lab（A）and sea（B）

2.5 丙二醛含量的測定

見圖4，隨著脅迫時間的延長，4株藻體的MDA含量呈現(xiàn)上升的趨勢。而且野生型藻體MDA含量增加的比其它3株藻體要多。在脅迫之前的對照組中顯示，4株藻體的 MDA含量差異不顯著（P＞0.05）。在脅迫3d后，四株藻體的MDA含量出現(xiàn)了明顯的差異，野生型的MDA含量最高約為對照組的2.48倍，BZT－11藻株的MDA含量最低，為對照組的1.81倍。BZT－18和981藻株的MDA含量相近，分別為對照組的1.81和2.10倍，與前兩者均差異顯著（P＜0.05）。

圖4 藻株在熱脅迫不同時間后的MDA含量變化Fig.4 The changes of MDA of four strains under different heat stress time

2.6 過氧化物歧化酶活性的測定

見圖5在熱激1天后，4株藻體的SOD活性均呈升高趨勢，在脅迫后第1天顯著升高。隨著脅迫時間的延長，藻體的SOD活性逐漸降低，在脅迫后第3天，其活性顯著低于對照組。在高溫脅迫前后，BZT－11、BZT－18和981藻株的SOD酶活性差異不顯著（P＞0.05），但是均比野生型高，具有顯著性差異。在脅迫的第1天，藻株的SOD含量的增加量有差異，BZT－11增加了183.71%，BZT－18增加了176.21%，981增加了195.33%，野生型增加了169.77%。BZT－11 和BZT－18的增加量均比野生型的多。

圖5 藻株在熱脅迫不同時間后的SOD活性變化Fig.5 The changes of SOD activity of four strains under different heat stress time

2.7 熱激蛋白基因表達量的測定

熱激4h后，熱激蛋白基因hsp70的表達量迅速增加（見圖6）。其中BZT－18和981藻株hsp70的表達量差異不顯著（P＞0.05），分別為對照組的15.94和16.42倍；BZT－11藻株hsp70的表達量為對照組的12.48倍，這3株藻體的熱激蛋白基因的表達量都明顯地高于野生型藻株（P＜0.05）。

圖6 藻株在熱脅迫4h后hsp70表達量的變化Fig.6 The changes of MDA of four strains under different heat stress time

3 討論

3.1 誘變方法

近年來，紫外誘變技術應用廣泛，尤其在微生物和微藻方面。它的誘變頻率高，而且不易回復突變，是使用最早、沿用最久、應用最廣泛的一種物理誘變劑。紫外線可引起DNA與蛋白質(zhì)的交聯(lián)、胞嘧啶與尿嘧啶之間的水合作用、DNA鏈的斷裂、形成嘧啶二聚體等，從而導致基因突變[15]。

紫外誘變被廣泛應用于藻類誘變育種中。Sandesh等[16]利用紫外誘變的方法獲得了高產(chǎn)類胡蘿卜素和蝦青素的雨生紅球藻。李建宏等[17]利用紫外線對鈍頂螺旋藻進行誘變，篩選獲得的兩株突變株的生長速度和光合放氧速率均有顯著提高，而且其長碳鏈不飽和脂肪酸含量高于出發(fā)藻株。張學成等[18]通過對小球藻株進行紫外誘變，篩選出了3個株系，其生長速率和蛋白含量均有顯著的提高。嚴興洪等[19]利用紫外線輻射誘變條斑紫菜原生質(zhì)體，獲得了可再生的純紅色突變體。Shen等[20]通過紫外線輻射細基江蘺2mm厚的藻體切片，對其進行誘變，通過篩選獲得了穩(wěn)定的具有鎘（Cd）抗性的突變藻體。

誘變育種是龍須菜品系選育的一個重要的手段。龍須菜誘變研究中經(jīng)常使用的化學誘變劑有甲基磺酸乙酯（EMS）和N－甲基－N’－亞硝基胍（MNNG）。Zhang等[22]用甲基磺酸乙酯（EMS）誘變龍須菜誘導獲得了多種色素突變體，為龍須菜的遺傳研究提供了良好的材料。張學成等[21]用MNNG誘變龍須菜幼配子體，獲得了各種色素突變體，為研究突變體的光合特性和色素組成提供了基礎，而且研究發(fā)現(xiàn)江蘺屬海藻的顏色是由多基因控制的性狀。張學成等[3]采用 MNNG誘變龍須菜藻體，經(jīng)過羥脯氨酸和高溫條件的篩選，獲得了981良種，并通過海上實踐證實了其遺傳穩(wěn)定性。孟琳等[23]利用MNNG誘變981藻尖，通過高溫篩選獲得了07－2耐高溫新品系，具有比981更耐高溫、生長快、瓊膠含量高等優(yōu)良特性。

相對于一些化學誘變，紫外誘變方法簡單方便，安全有效。在海藻方面大多是以微藻藻株或者大型海藻幼體作為誘變處理的材料。在本次實驗中，采用剛釋放附著的果孢子作為紫外誘變的對象，剛附著的果孢子還沒有分裂，為單細胞，遺傳物質(zhì)的改變?nèi)菀妆憩F(xiàn)在完整植株體，不會形成嵌合體；且剛放散的果孢子也沒有很厚的多糖外壁，利于紫外線的穿透和功效發(fā)揮，因此它是進行誘變的良好材料。本實驗中利用紫外誘變果孢子的方法來獲得生長快速的耐高溫突變體，實驗結(jié)果顯示了紫外輻照方法對于果孢子誘變的可行性。

3.2 耐熱突變體的篩選

研究顯示龍須菜在幼體時期具有更高的抗高溫性[24]。本實驗中為了獲得能夠穩(wěn)定表達耐熱性的突變藻株，將不同生長階段的突變體，包括幼苗期和成熟期，都經(jīng)過高溫脅迫的篩選。四分孢子體幼苗期的耐高溫篩選溫度設置為導致野生型幼苗的存活率為零的最低處理溫度。因此幼苗期高溫篩選條件為41℃熱脅迫30min。成熟期藻體的耐高溫篩選溫度參照本實驗室前期的實驗結(jié)果[25]。

在熱脅迫條件下，MDA含量的增加，說明細胞膜脂過氧化的程度增高，細胞受損害的程度增加。在本實驗中MDA含量在整個熱脅迫過程中逐漸升高，說明藻體細胞膜受損害的程度隨著脅迫的時間的增加而增強。龍須菜在高溫下MDA含量的變化，與他人的研究結(jié)果相似[26]，表明高溫脅迫條件下 MDA含量與藻類的耐熱性具有重要相關性。在整個熱脅迫過程中兩株突變株的MDA含量明顯低于野生型，而與981藻株沒有顯著性差異，初步說明了篩選獲得的這2株突變藻株可能具有較高的抗逆性。

SOD能夠清除活性氧，是抗氧化防御系統(tǒng)中的關鍵酶之一，研究顯示藻類細胞SOD活力的升高與其高耐熱性相關[27－28]。本研究結(jié)果顯示在4株藻體中SOD活性在脅迫后的第1天內(nèi)呈上升趨勢，隨著脅迫時間的延長活性逐漸降低，藻體受到高溫的傷害可能與SOD含量的降低有關。在高溫脅迫下，2株突變藻株的SOD活性與981藻株相當，并始終高于野生型，而且在脅迫第1天SOD活性的增加幅度高于野生型，這在一定程度上也反映了2株突變藻株具有較強的耐熱性。

Hsp70是生物體內(nèi)一種高度保守的熱激蛋白，hsp70基因的表達是藻類應對熱脅迫的一種重要的方式[27]。Gu等[13]也曾報道在高溫脅迫條件下hsp70基因的表達與龍須菜的耐熱性是直接相關的。在本實驗中，4株藻體經(jīng)熱脅迫4h后，hsp70基因的表達水平均比對照組顯著增高，而2株突變株hsp70基因的表達量又比野生型藻株分別高出3.64和4.66倍。這也更加證實了2株突變株比野生型藻體具有更高的耐熱性。

實驗表明，紫外輻射是龍須菜的一種有效的誘變育種方法。篩選出的2株耐高溫突變株BZT－11和BZT－18顯示了比981和野生型較快的日平均生長速率。與野生型相比，在熱脅迫條件下突變株具有較低的MDA累積含量，較高的SOD活性和hsp70基因表達水平，初步顯示了它們可能會具有較高的耐熱性。BZT－11和BZT－18藻株有望作為優(yōu)良品系應用于生產(chǎn)栽培，2株突變株的特性是否能夠穩(wěn)定遺傳，這仍然需要進行大量的后續(xù)研究和實踐工作。

本試驗將紫外誘變與耐高溫篩選相結(jié)合，建立了一套可行的龍須菜耐高溫品系的篩選方法，為深入了解龍須菜的耐高溫機制，選育生長快而且耐高溫的龍須菜優(yōu)良品系提供研究基礎。

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