岳 亮 馬愛軍 趙艷飛 王新安 何偉國 孟雪松 翟介明 劉圣聰

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紅鰭東方鲀()性別差異微衛(wèi)星標(biāo)記的篩選*

岳 亮1, 2馬愛軍1①趙艷飛1王新安1何偉國1孟雪松3翟介明4劉圣聰3

(1. 中國水產(chǎn)科學(xué)研究院黃海水產(chǎn)研究所 農(nóng)業(yè)部海洋漁業(yè)可持續(xù)發(fā)展重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 青島市海水魚類種子工程與生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 青島 266071; 2. 上海海洋大學(xué) 上海 201306; 3. 大連天正實(shí)業(yè)有限公司 大連 116000; 4. 萊州明波水產(chǎn)有限公司 煙臺(tái) 261418)

采用以BSA為基礎(chǔ)的微衛(wèi)星標(biāo)記技術(shù)對(duì)紅鰭東方鲀()雌、雄群體進(jìn)行性別差異標(biāo)記篩選的研究。用雌、雄各30個(gè)個(gè)體構(gòu)建雌、雄基因池, 利用66對(duì)微衛(wèi)星引物掃描雌、雄基因池。在雌、雄基因池中擴(kuò)增出差異條帶的引物有8對(duì)。用兩個(gè)各包括30個(gè)雌、雄個(gè)體的群體對(duì)這8對(duì)引物進(jìn)行兩輪個(gè)體驗(yàn)證。結(jié)果表明, 引物f383在兩個(gè)雌、雄群體中擴(kuò)增出的差異條帶與性別都呈極顯著相關(guān)性(分別為0.710和0.673)(<0.01), f383是與紅鰭東方鲀雄性呈正相關(guān)的微衛(wèi)星標(biāo)記。紅鰭東方鲀性別差異微衛(wèi)星標(biāo)記的獲得, 為其性別相關(guān)基因的克隆和性別決定機(jī)制的研究提供理論基礎(chǔ)。

紅鰭東方鲀; 微衛(wèi)星; 性別差異

魚類在脊椎動(dòng)物的系統(tǒng)進(jìn)化中處于承前啟后的關(guān)鍵地位, 與魚類性別有關(guān)的研究是國際上的科研熱點(diǎn)。魚類進(jìn)化歷史長久, 演化分支繁多(尚曉莉等, 2010), 作為低等脊椎動(dòng)物, 其性別決定和分化機(jī)制相當(dāng)復(fù)雜, 魚類的性別決定機(jī)制具有原始性、多樣性和易變性, 并具有所有脊椎動(dòng)物的性別決定方式(文愛韻等, 2008)。魚類性別發(fā)育是以遺傳基因?yàn)榛A(chǔ), 并受到自身內(nèi)分泌調(diào)節(jié)和外界環(huán)境的影響, 是三者相互作用的結(jié)果(高建軍等, 2010), 這在一定程度上給魚類性別相關(guān)的研究增加難度。魚類性別相關(guān)的研究既具有重要的理論價(jià)值, 又具有可觀的實(shí)用價(jià)值, 一直吸引著國內(nèi)外魚類研究者的極大關(guān)注。分子生物學(xué)技術(shù)的快速發(fā)展為研究者們指明了方向。DNA分子標(biāo)記具有標(biāo)記位點(diǎn)多、標(biāo)記穩(wěn)定可靠、特異性強(qiáng)、實(shí)驗(yàn)重復(fù)性強(qiáng)等特點(diǎn)(劉云國等, 2009), 為辨別魚類的性別開辟了出路。RFLP、RAPD、AFLP 和SSR等是常用的分子標(biāo)記技術(shù)。微衛(wèi)星DNA以其保守性好、易于檢測、多態(tài)性高、共顯性遺傳、在基因組中均勻分布等特點(diǎn)被廣泛應(yīng)用于遺傳圖譜的構(gòu)建、品系間的遺傳結(jié)構(gòu)特點(diǎn)及性狀與位點(diǎn)的連鎖分析等方面的研究(徐興莉等, 2011)。微衛(wèi)星標(biāo)記技術(shù)也被用于尋找與魚類性別相關(guān)的分子標(biāo)記。在虹鱒微衛(wèi)星遺傳連鎖圖譜的研究中, Sakamoto等(2000)在雄性圖譜中發(fā)現(xiàn)兩個(gè)與性別決定位點(diǎn)連鎖的微衛(wèi)星標(biāo)記OmyFGT19- TUF和OmyRGT28TUF。隨后, 另外兩個(gè)與虹鱒雄性性別決定位點(diǎn)連鎖的微衛(wèi)星標(biāo)記Ots517NWFSC和Ssa1NVH被Woram等(2003)發(fā)現(xiàn)。Stein等(2002)從紅點(diǎn)鮭的Y染色體分離出與性別連鎖的微衛(wèi)星位點(diǎn)Yp136。Waldbieser等(2001)在構(gòu)建溝鯰()遺傳連鎖圖譜的過程中, 發(fā)現(xiàn)7個(gè)與性別決定位點(diǎn)緊密連鎖的微衛(wèi)星位點(diǎn)。Lee等(2004)在奧利亞羅非魚中發(fā)現(xiàn)11個(gè)與表型性別連鎖的微衛(wèi)星標(biāo)記。目前, 國內(nèi)有關(guān)應(yīng)用微衛(wèi)星DNA標(biāo)記技術(shù)已經(jīng)篩選出的魚類性別差異標(biāo)記的報(bào)道罕見。

紅鰭東方鲀(), 隸屬于鲀形目(Telraodontiformes)、鲀科(Tetradontidae)、東方鲀屬(), 是暖水性海洋底棲魚類, 味道鮮美、規(guī)格較大、肉質(zhì)比較緊、營養(yǎng)豐富、經(jīng)濟(jì)價(jià)值高, 為我國北方地區(qū)的優(yōu)良海水養(yǎng)殖魚類之一。由于紅鰭東方鲀的卵巢有劇毒, 而精巢無毒, 口感嫩滑, 受到美食者青睞, 因而, 雄性紅鰭東方鲀的市場價(jià)值更高。因此, 開展紅鰭東方鲀性別差異分子標(biāo)記篩選的研究, 在早期生長階段篩選出雄性魚種養(yǎng)殖, 對(duì)提高紅鰭東方鲀的經(jīng)濟(jì)效益和市場價(jià)值有重要的現(xiàn)實(shí)意義, 也為其性別決定機(jī)制和性別相關(guān)基因的研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

實(shí)驗(yàn)用的兩批紅鰭東方鲀樣品, 第一批來自煙臺(tái)市萊州明波水產(chǎn)有限公司, 雌、雄各30尾, 體長為33—39cm, 體重為1.18—1.95kg; 第二批來自大連天正實(shí)業(yè)有限公司, 雌、雄各30尾, 體長為36—43cm, 體重為1.52—2.98kg。解剖后觀察性腺, 辨別出雌、雄, 每尾魚取少量尾鰭于離心管中, 編號(hào)后至于-20°C冰箱保存。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 基因組DNA的提取和BSA基因池的建立 從-20°C冰箱中取出保存的樣品, 快速剪取30mg尾鰭, 用海洋動(dòng)物基因組DNA提取試劑盒提取DNA。提取的DNA樣品用核酸測序儀測定濃度和260/280值。每個(gè)DNA樣品取出部分稀釋到50ng/mL, 其余DNA原液放在-20°C冰箱保存。

雌、雄個(gè)體各30個(gè), 從稀釋到50ng/mL的DNA溶液中各取10mL混合成相應(yīng)的雌、雄基因池,-20°C保存基因池樣品。

1.2.2 引物合成及PCR擴(kuò)增 從Kai等(2011)與紅鰭東方鲀遺傳連鎖圖譜有關(guān)的文章中挑選66對(duì)雌、雄圖譜中特異的微衛(wèi)星引物。PCR反應(yīng)體系為: 10×Taq buffer 1.6mL, dNTPs 1.3mL (2.5mmoL/L), DNA 1.2mL (50ng/mL),酶 0.2mL (5U/mL), 上下游引物各0.7mL (10mmoL/L), 加無菌雙蒸水補(bǔ)至20mL。PCR反應(yīng)程序: 94°C預(yù)變性5min; 94°C變性30s, 退火30s, 退火溫度依引物而異, 72°C復(fù)性30s, 30個(gè)循環(huán); 72°C延伸10min, 4°C保存。取PCR擴(kuò)增產(chǎn)物5mL用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測, 記錄具有穩(wěn)定擴(kuò)增產(chǎn)物的引物。

1.2.3 變性聚丙烯酰胺凝膠電泳 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)94°C變性5min, 冰浴10min, 用8%變性聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測。電泳條件: 電壓490V, 電流60mA, 功率28W。先預(yù)電泳30min, 上樣后電泳2h左右。

1.2.4 差異條帶的篩選 記錄并分析聚丙烯酰胺電泳條帶, 通過雌、雄基因池的電泳結(jié)果, 初步篩選在兩基因池間能擴(kuò)增出差異等位基因片段的微衛(wèi)星位點(diǎn)。用相應(yīng)的引物, 按照上述的PCR反應(yīng)條件對(duì)雌、雄各30個(gè)紅鰭東方鲀個(gè)體進(jìn)行PCR擴(kuò)增。分析有差異的引物在個(gè)體上的具體擴(kuò)增情況。如果差異等位基因片段在雌、雄群體中出現(xiàn)次數(shù)差異極顯著, 則作為候選的性別特異微衛(wèi)星標(biāo)記, 其對(duì)應(yīng)的引物作為下一輪驗(yàn)證的候選引物。

以第二批紅鰭東方鲀雌、雄各30個(gè)個(gè)體基因組DNA為模板, 用候選的引物按照相同的條件進(jìn)行PCR擴(kuò)增和聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測, 驗(yàn)證候選標(biāo)記的準(zhǔn)確性。

1.2.5 差異等位基因片段的回收 利用無外源DNA污染的手術(shù)刀從8%的變性聚丙烯酰胺凝膠上切目的條帶, 放入盛有 20mL去離子水的 1.5mL離心管中, 用剪刀剪碎, 置于 4°C過夜, 使膠中的DNA盡可能地溶解到液體中(劉昕, 2011)。然后, 12000r/min離心約 2min, 仔細(xì)吸取上清作為再次PCR擴(kuò)增的模板, 按照上述PCR體系和程序進(jìn)行反應(yīng)。1%瓊脂糖凝膠電泳檢測后, 用瓊脂糖凝膠回收試劑盒(TIAN gel Midi Purification Kit)回收目的條帶。按照pGM-T克隆試劑盒的說明, 將目的DNA片段克隆到pGM-T載體上, 將陽性克隆送到上海生工生物工程公司測序。利用Chromas軟件對(duì)測序結(jié)果剪切和拼接(只留下紅鰭東方鲀本身的基因組序列), 用DNASTAR軟件中的SeqMan對(duì)同一標(biāo)記的多個(gè)序列進(jìn)行比對(duì)來確定DNA序列, 通過數(shù)據(jù)庫BLAST比對(duì), 搜索該序列的同源序列。

2 結(jié)果

2.1 基因組DNA的提取

通過試劑盒提取的紅鰭東方鲀雌、雄群體基因組DNA, 經(jīng)過分光光度計(jì)檢測,260/280值在1.8—2.0之間。瓊脂糖凝膠電泳圖片顯示DNA片段較完整, 沒有大量蛋白和RNA存在, 說明DNA質(zhì)量較高。圖1為部分DNA電泳圖。

圖1 樣品DNA電泳圖

表1 8對(duì)微衛(wèi)星標(biāo)記引物序列

2.2 BSA分池及PCR擴(kuò)增結(jié)果分析

用66對(duì)引物對(duì)所構(gòu)建的雌、雄基因池進(jìn)行PCR擴(kuò)增, 用8%的變性聚丙烯酰胺凝膠對(duì)PCR產(chǎn)物電泳檢測, 檢測結(jié)果顯示: 在雌、雄基因池中擴(kuò)增出差異條帶的引物有8對(duì), 分別為f172、f383、f638、f1497、f1050、f1372、f1637、f152。引物序列見表1。電泳結(jié)果如圖2所示。

2.3 差異等位基因片段在個(gè)體中的驗(yàn)證

將BSA池中篩選到的8對(duì)引物在構(gòu)建基因池的雌、雄各30個(gè)個(gè)體中進(jìn)行PCR擴(kuò)增, 通過8%變性聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測, 分析差異等位基因片段在不同雌、雄個(gè)體的擴(kuò)增情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn): 引物f1050在30個(gè)雌性個(gè)體中均未擴(kuò)增出條帶, 在30個(gè)雄性個(gè)體中有8個(gè)個(gè)體擴(kuò)增出條帶; 引物f383在幾乎所有(28/30)雄性個(gè)體中擴(kuò)增出條帶, 在個(gè)別(7/30)雌性個(gè)體中出現(xiàn)條帶。這與BSA擴(kuò)增結(jié)果一致。結(jié)果見圖3。

圖2 引物f172、f383、f638、f1497、f1050、f1372、f1637、f152在BSA中的擴(kuò)增條帶

a. 引物f172、f383、f638、f1497在BSA中的擴(kuò)增條帶; b. 引物f1050、f1372、f1637、f152在BSA中的擴(kuò)增條帶。M1. 100bp DNA標(biāo)記; M2. 50bp DNA標(biāo)記

用第二批紅鰭東方鲀?nèi)后w雌、雄各30個(gè)個(gè)體對(duì)f1050和f383這兩對(duì)引物進(jìn)行第二輪的個(gè)體驗(yàn)證顯示: 引物f1050在雌、雄群體間的擴(kuò)增條帶數(shù)無顯著差異, 而引物f383在雌性群體中只有極個(gè)別(3/30)個(gè)體中擴(kuò)增出條帶, 在雄性群體30個(gè)體中有23個(gè)個(gè)體擴(kuò)增出條帶。具體結(jié)果如圖4所示。

結(jié)合圖3和圖4分析, 引物f383經(jīng)過2個(gè)紅鰭東方鲀?nèi)后w共120個(gè)個(gè)體的驗(yàn)證, 在雌、雄個(gè)體中擴(kuò)增出的條帶都出現(xiàn)差異極顯著的結(jié)果, 差異等位基因片段在60個(gè)雌性個(gè)體中出現(xiàn)10次, 頻率很低, 為16.7%; 而在雄性60個(gè)個(gè)體中出現(xiàn)51次, 頻率極高, 為85.0%。由此可知, 引物f383該位點(diǎn)的差異片段對(duì)紅鰭東方鲀的性別極具雄性偏好性, 該位點(diǎn)應(yīng)該與紅鰭東方鲀性別決定區(qū)域存在相關(guān)關(guān)系。引物f383是紅鰭東方鲀遺傳連鎖圖譜中第19號(hào)染色體上的引物, 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與Kai等(2011)的研究結(jié)果相符合。

圖3 引物f383(a)和f1050(b)在雌、雄群體中擴(kuò)增的顯著差異條帶

2.4 差異等位基因片段的克隆與測序結(jié)果

對(duì)與紅鰭東方鲀雄性呈極顯著正相關(guān)的微衛(wèi)星位點(diǎn)f383的差異等位基因片段克隆并進(jìn)行測序。利用Chromas 軟件對(duì)測序結(jié)果剪切和拼接(只留下紅鰭東方鲀本身的基因組序列)序列如圖5所示。

利用Blast比對(duì), 搜索這條序列的同源序列, 結(jié)果表明這條序列為公布的紅鰭東方鲀第19號(hào)染色體上的一段, 同源性高達(dá)98%, 序列的覆蓋率達(dá)100%。

3 討論

高等脊椎動(dòng)物的性別決定機(jī)制皆為人知, 而魚類作為低等脊椎動(dòng)物, 性別分化處于原始階段, 性別決定和分化機(jī)制相當(dāng)復(fù)雜, 魚類的表型性別既受基因的決定, 又受環(huán)境因子的影響(李靜等, 2007)。在被研究報(bào)道過的魚類中, 有性染色體的魚類占10% (Devlin, 2002)。在有性染色體的魚類中, 決定性別的基因并不明顯地集中于性染色體上, 常染色體上的基因更多地參與到性別決定中(姚延丹, 2009), 羅非魚性別決定機(jī)制的研究為此提供佐證, Hammerman和Avtalion(1979)提出性別決定的“常染色體平衡理論”。因此, 根據(jù)染色體的形態(tài)來區(qū)分魚類的性別在大多數(shù)魚類中行不通?；贒NA水平的遺傳性別鑒定方法可以克服這一困難, 但首先需要篩選性別特異的DNA標(biāo)記, DNA標(biāo)記是研究魚類性連鎖的重要工具, 因?yàn)镈NA的分子結(jié)構(gòu)不會(huì)受生理或環(huán)境因素的變化而改變(馬洪雨, 2009)。

紅鰭東方鲀味道鮮美、營養(yǎng)豐富、脂肪含量低、經(jīng)濟(jì)價(jià)值高, 是一種具有較大市場發(fā)展?jié)摿Φ拿麅?yōu)海水養(yǎng)殖魚類。但是, 由于卵巢有劇毒, 誤食甚至喪命; 而精巢無毒, 豐腴鮮美、潔白如乳、入口即化、美妙絕倫, 因此價(jià)格不菲(陸麗君, 2012)。因此, 開展紅鰭東方鲀性別差異微衛(wèi)星標(biāo)記篩選的研究, 在其生長早期階段通過分子標(biāo)記技術(shù)選擇雄性魚養(yǎng)殖, 可以減少成魚養(yǎng)殖的工作量, 提高資源的利用率, 增加經(jīng)濟(jì)效益。

本研究采用分離群體分組分析法(BSA法), 用66對(duì)微衛(wèi)星引物對(duì)雌、雄基因池掃描, 初步篩選出在雌、雄基因池間擴(kuò)增出差異條帶的8對(duì)引物。如果與用單個(gè)個(gè)體進(jìn)行引物篩選的方法相比, BSA法工作量大大減少, 為前者的1/30。最終篩選出的引物f383在雌、雄群體間擴(kuò)增出的條帶均達(dá)到差異極顯著的水平。皮爾遜相關(guān)性檢測結(jié)果表明, 兩個(gè)群體中“雌雄分組”和“條帶的有無”均呈現(xiàn)極顯著的相關(guān)性(0.710和0.673)(<0.01), 表明引物f383與紅鰭東方鲀的性別相關(guān), 是與雄性正相關(guān)的標(biāo)記。采用與劉改艷(2011)相同的統(tǒng)計(jì)方法, 在兩個(gè)群體中, 該標(biāo)記在60個(gè)雄性個(gè)體中出現(xiàn)51個(gè)條帶, 雄性正確鑒定率為85.0%; 60個(gè)雌性個(gè)體中50個(gè)無帶, 雌性正確鑒定率為83.3%; 性別的平均正確鑒定率為84.17%, 在個(gè)體中的出現(xiàn)率為50.83%。

圖4 引物f383在雌、雄群體中擴(kuò)增的顯著差異條帶

a. 引物f383在編號(hào)1—15的雌、雄群體中擴(kuò)增的顯著差異條帶; b. 引物f383在編號(hào)16—30的雌、雄群體中擴(kuò)增的顯著差異條帶

圖5 紅鰭東方鲀雄性相關(guān)微衛(wèi)星標(biāo)記DNA序列

與紅鰭東方鲀雄性呈正相關(guān)的微衛(wèi)星標(biāo)記在雌性個(gè)體中出現(xiàn)的頻率是16.7%, 在雄性個(gè)體中出現(xiàn)的頻率是85.0%。說明該微衛(wèi)星標(biāo)記不是紅鰭東方鲀雄性特異的分子標(biāo)記, 而是與雄性緊密連鎖的標(biāo)記, 得到此結(jié)論可能有如下原因: (1) 實(shí)驗(yàn)所用材料不是來自同一家系, 環(huán)境條件不相同, 可能對(duì)紅鰭東方鲀的表型性別有影響, 導(dǎo)致少數(shù)個(gè)體的基因型和表型相悖; (2) 紅鰭東方鲀不存在性染色體或性染色體的分化程度較低。舒琥等(2010)在鲀形目染色體組型分析的研究中未發(fā)現(xiàn)紅鰭東方鲀具有異型性染色體, 為該推測提供了理論基礎(chǔ); (3) 在減數(shù)分裂過程中發(fā)生染色體交換重組(楊東, 2006)。

Kai等(2011)發(fā)現(xiàn), 以目前紅鰭東方鲀完整的Tru19(總長度為16Mb)圖譜為基礎(chǔ), 性別決定基因可能位于跨度為5Mb的區(qū)域, 該區(qū)域位于大的常染色體一樣的區(qū)域側(cè)翼。這對(duì)本實(shí)驗(yàn)引物的選擇有重要的指示性作用, 在此基礎(chǔ)上選擇第19號(hào)染色體上的所有引物進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。Kikuchi等(2007)通過基因組范圍的關(guān)聯(lián)分析表明, 第19號(hào)連鎖群的單一染色體區(qū)域決定紅鰭東方鲀的性別, 而本實(shí)驗(yàn)篩選的性別差異引物f383來自Kai等(2011)構(gòu)建的紅鰭東方鲀遺傳連鎖圖譜第19號(hào)染色體, 這與Kikuchi等(2007)的研究結(jié)果相符合。

紅鰭東方鲀性別差異微衛(wèi)星標(biāo)記的獲得, 為其性別相關(guān)基因的克隆和性別決定機(jī)制的研究提供理論基礎(chǔ)。以該標(biāo)記為基礎(chǔ)的紅鰭東方鲀性別鑒定技術(shù)可以在早期生長階段對(duì)紅鰭東方鲀進(jìn)行性別選擇, 實(shí)現(xiàn)分子標(biāo)記輔助育種, 這對(duì)生產(chǎn)實(shí)踐具有重要的指導(dǎo)作用和現(xiàn)實(shí)意義, 為紅鰭東方鲀產(chǎn)業(yè)的發(fā)展提供更大的發(fā)展空間。

馬洪雨, 2009. 三種重要海水養(yǎng)殖魚類性別特異標(biāo)記和微衛(wèi)星標(biāo)記開發(fā)及遺傳連鎖圖譜構(gòu)建. 青島: 中國海洋大學(xué)博士學(xué)位論文, 13

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SCREENING OF MICROSATELLITES GENDER-INDICATIVE MARKERS OF

YUE Liang1, 2, MA Ai-Jun1, ZHAO Yan-Fei1, WANG Xin-An1, HE Wei-Guo1,MENG Xue-Song3, ZHAI Jie-Ming4, LIU Sheng-Cong3

(1. Yellow Sea Fisheries Research Institute, Chinese Academy of Fishery Sciences; Key Laboratory of Sustainable Development of Marine Fisheries, Ministry of Agriculture; Qingdao Key Laboratory for Marine Fish Breeding and Biotechnology, Qingdao 266071, China; 2. Fisheries and Life Science, Shanghai Ocean University, Shanghai 201306, China; 3. Dalian Tianzheng Industrial Co. Ltd., Dalian 116000, China; 4. Laizhou Mingbo Aquatic Products Co. Ltd., Yantai 261418, China)

To determine the gender differences of male and female populations of, we screened the microsatellites based on bulked segregation analysis (BSA). Two gene pools were constructed with 60 individuals each containing 30 males and females, and scanned by 66 pairs of microsatellite primers, from which eight pairs of microsatellite primers of different bands were amplified and verified for the first round in the 60 individuals. The results show that the bands amplified by primers f1050 and f383 in male and female individuals differed significantly. And in the second round verification, bands amplified by primers f1050 in male and female individuals did not differ significantly, while bands amplified by primers f383 in male and female individuals differed significantly. In other words, primer f383 occurred in male individuals in two rounds of verification in coefficient 0.710 and 0.673, respectively, it is paternity-indicative for. The discovery shall provide a theoretical basis for gender-related gene cloning and sex determination.

; microsatellite; gender differences

10.11693/hyhz20120629001

* 中央級(jí)公益性科研院所基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)專項(xiàng)資金(20603022012005)資助。岳亮, 碩士研究生, E-mail: liang7650960@163.com

馬愛軍, 博士, 研究員, 博士生導(dǎo)師, E-mail: maaj@ysfri.ac.cn

2012-06-29,

2012-10-23

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