付蒙穎 王 英 鐘 敏 艾國平

(第三軍醫(yī)大學(xué)軍事預(yù)防醫(yī)學(xué)院熱帶醫(yī)學(xué)研究所，重慶 400038)

在過去的一個世紀里，人類成功從昆蟲體內(nèi)分離到了多種細菌，迄今為止研究最為廣泛的是蘇云金芽孢桿菌Bacillusthuringiensis。這些細菌已經(jīng)證實非常有效，目前市面上有超過100種產(chǎn)品用于控制各種農(nóng)作物害蟲和能夠傳播人類疾病的蟲媒。在過去的十年中，另一個殺蟲細菌，球型芽孢桿菌(Bacillussphaericus，Bs)逐漸受到關(guān)注并產(chǎn)生了商業(yè)化的產(chǎn)品，Bs的許多亞種被證實具有殺滅蚊幼蟲的能力。Kellen等(1965)首次報道了Bs是一種昆蟲病原體，盡管這一報道提示了Bs的重要性，但是直到1973年才認識到Bs可以作為一種殺滅昆蟲的生物殺蟲劑(Singer, 1973)。從此開始，我們對Bs的研究才有了進一步的發(fā)展，包括它的毒性機制和對宿主的毒性研究。本文將對Bs，目前更名為球形賴氨酸芽孢桿菌(Lysinibacillussphaericus,L.sphaericus)的特性、滅蚊毒素及作用機制進行綜述。

1 殺蟲活性

自從1965年發(fā)現(xiàn)球形賴氨酸芽孢桿菌具有昆蟲致病性以來，研究表明蚊幼蟲是其最主要的靶標(Kellenetal., 1965)。同時有文獻報道L.sphaericus對蛇形毛圓線蟲Trichostrongyluscolubriformis等具有不同程度的毒性(Boneetal., 1987)；其毒素Mtx1具有殺滅搖蚊Chironomidae幼蟲的能力(Partridgeetal., 2002)；而在注射sphaericolysin后，該毒素蛋白能夠殺滅德國小蠊(German cockroachBlattelagermanica)及斜紋夜蛾Spodopteralitura( Nishiwakietal., 2007)。除此之外，球形賴氨酸芽孢桿菌還表現(xiàn)出一系列的亞毒性作用包括延緩發(fā)育以及降低繁殖能力，但對其他生物卻沒有有害的影響，例如蜜蜂和真核微生物。目前認為球形賴氨酸芽孢桿菌的毒力作用譜較窄，因此其具有非常良好的安全使用記錄(Lacey, 2007)。

2 作用機制

多種球形賴氨酸芽孢桿菌亞株都能產(chǎn)生細菌素和對抗其他亞株的抗生素蛋白(抗菌毒素)(Cetinkayaetal., 2003)。下面的部分將對球形賴氨酸芽孢桿菌的毒性蛋白的相關(guān)研究進行綜述。

2.1 Sphaericolysin

Nishiwaki等(2007)從DNA II亞群球形賴氨酸芽孢桿菌 A3-2株中分離到了一種名為Sphaericolysin的蛋白毒素，將其注入德國小蠊和斜紋夜蛾體內(nèi)，能夠殺死這兩種昆蟲。從DNA V亞群球形賴氨酸芽孢桿菌中分離了一種與Sphaericolysin高度同源的一種蛋白毒素，名為膽固醇依賴的細胞溶素(Cholesterol-dependent cytolysin)( Frometal., 2008)；Sphaericolysin的編碼基因同樣出現(xiàn)在已經(jīng)測序完成的球形賴氨酸芽孢桿菌 C3-41株基因組中(Huetal., 2008)。因此，我們有理由認為，編碼這種毒素蛋白的基因可能分布較廣。研究發(fā)現(xiàn)，Sphaericolysi的成熟蛋白是經(jīng)過剪切掉N端信號肽并分泌到培養(yǎng)基中的一個53 kDa的蛋白(Nishiwakietal., 2007)。它和B.thuringiensis分泌的產(chǎn)氣莢膜梭菌素O (Perfringolysin O)和蜂房桿菌溶素(Alveolysin)同屬于硫醇細胞溶素超家族。它包括一個類似于膽固醇依賴細胞溶素的模體結(jié)構(gòu)，并且在與膽固醇共同注射時，其滅蟲活性顯著性降低。通過透射電鏡觀察發(fā)現(xiàn)該毒素和產(chǎn)氣莢膜梭菌素O類似，能夠使紅細胞表面產(chǎn)生許多約35 nm直徑的孔洞?？傊?，已有的研究顯示，球形賴氨酸芽孢桿菌能夠通過產(chǎn)生和分泌毒素蛋白Sphaericolysin殺死其宿主。

2.2 營養(yǎng)期殺蚊毒素

球形賴氨酸芽孢桿菌在其生長的營養(yǎng)期也會分泌具有昆蟲毒性的毒素。目前已經(jīng)鑒定出兩類營養(yǎng)期殺蚊毒素(Vegetative mosquitocidal toxins，Mtx)，根據(jù)作用機制可以分為兩類：

2.2.1Mtx1蛋白：Mtx1蛋白首先從弱毒性 SSII-1株中鑒定出來，然后發(fā)現(xiàn)在強毒性和弱毒性株中都普遍存在，盡管很多都是以假基因的形式存在(Thanabaluetal., 1991)。早在對數(shù)生長期該蛋白就開始轉(zhuǎn)錄，并且球形賴氨酸芽孢桿菌中mtx1啟動子驅(qū)動的β-半乳糖苷的生產(chǎn)水平比枯草桿菌低，說明不同宿主中調(diào)節(jié)元素的活性是有差異的(Ahmedetal.， 1995)。研究發(fā)現(xiàn)Mtx1蛋白在球形賴氨酸芽孢桿菌中不僅表達水平較低且不穩(wěn)定(Myersetal., 1978)，可以被一種枯草桿菌蛋白酶家族絲氨酸蛋白酶sphaericase所降解(Watietal., 1997)。該酶及其降解Mtx1的活性隨后有了進一步研究(Yangetal., 2007)，而在DNA亞群V的球形賴氨酸芽孢桿菌中的Mtx1卻有較強的穩(wěn)定性(Thanabaluetal., 1995)。

Mtx1為一個分子量為100 kDa，N端具有其特征信號序列結(jié)構(gòu)的蛋白，盡管具有信號序列，但沒有證據(jù)證明其會分泌到培養(yǎng)基中(Thanabaluetal., 1991)。該信號序列的去除有利于重組該蛋白的表達，去除后的重組Mtx1蛋白分子量為97 kDa (Thanabaluetal. 1992)。信號肽樣序列下游區(qū)域與ADP-核糖基轉(zhuǎn)移酶細菌毒素結(jié)構(gòu)類似。Mtx1會被存在于蚊中腸中的酶﹑胰蛋白酶以及胰凝乳蛋白酶水解，產(chǎn)生一個約27 kDa包含有ADP-核糖基轉(zhuǎn)移酶結(jié)構(gòu)的分子和一個約70 kDa包含有內(nèi)部重復(fù)序列的分子(Schirmeretal., 2002a)。這些重復(fù)序列為一個凝集素樣模體(Lectin-like motif)，其可能參與結(jié)合糖基團，因而可能決定了毒素的特異性。Mtx1的晶體結(jié)構(gòu)呈現(xiàn)4個蓖麻毒素B樣凝集素功能域環(huán)繞著ADP-核糖基轉(zhuǎn)移酶結(jié)構(gòu)域的結(jié)構(gòu)，這種結(jié)構(gòu)可以保護其不被蛋白酶所水解(Treiberetal., 2008)。晶體結(jié)構(gòu)中的活化環(huán)暴露可以使其被蛋白酶水解，以便使凝集素結(jié)構(gòu)域調(diào)節(jié)催化結(jié)構(gòu)域被靶細胞攝取。盡管蚊細胞中Mtx1的靶標仍不清楚，但研究證實Mtx1會修飾致倦庫蚊Cx.quinquefasciatus的某些蛋白﹑Hela細胞的幾種蛋白﹑E.coli的EF-Tu(Schirmeretal., 2002b)以及大豆胰蛋白酶抑制子，并且都是針對于精氨酸殘基進行修飾(Carpuscaetal., 2006)。Mtx1蛋白C端70 kDa區(qū)域(包含凝集素重復(fù)域)能夠引起致倦庫蚊和埃及伊蚊Aedesaegypti細胞形態(tài)學(xué)發(fā)生改變。但Mtx1水解后的27和70 kDa區(qū)域?qū)τ谄錃⑽枚拘远际潜仨毜?Thanabaluetal., 1993)。在Hela細胞內(nèi)表達27 kDa的ADP-核糖基轉(zhuǎn)移酶結(jié)構(gòu)域?qū)a(chǎn)生細胞毒性并導(dǎo)致細胞產(chǎn)生肌動蛋白結(jié)構(gòu)類似的絲狀偽足(Schirmeretal., 2002b)。

2.2.2Mtx2蛋白：Mtx2蛋白是從SSII-1株中鑒定出來與Mtx1不同的另一類毒素蛋白(Thanabaluetal., 1996)。隨后這一家族中的另一成員Mtx3也被報道(Liuetal., 1996)。這些蛋白是成孔毒素家族的成員，屬于NCBI保守結(jié)構(gòu)域數(shù)據(jù)庫中的梭狀芽胞桿菌ε毒素ETX/MTX2家族。B.thuringiensis同樣能夠產(chǎn)生類似蛋白，包括Cry15Aa (de Maagdetal., 2003)。Mtx2和Mtx3在營養(yǎng)期就會產(chǎn)生，并且對致倦庫蚊和埃及伊蚊都有殺傷作用(Liuetal., 1996; Thanabaluetal., 1996 )。Mtx2毒素蛋白的自然突變會導(dǎo)致對兩種蚊種的毒性不一樣，224位氨基酸殘基被認為在決定靶標時起決定性作用，若該位點為賴氨酸，則表現(xiàn)出對致乏庫蚊的毒力更強；若該位點為蘇氨酸則表現(xiàn)出對埃及伊蚊的毒力更強(Chanetal. 1996)。Mtx2蛋白的C端對于其溶解性和活可能同樣非常重要(Phannachetetal., 2010)。

2.3 Bin毒素

Bin或Binary毒素儲存在伴胞晶體中，它們被認為是強滅蚊活性株的特征。該毒素由兩種蛋白組成：BinA(370個氨基酸，42 kDa)和BinB(448個氨基酸，51 kDa)。它們由同一個操縱子控制同時轉(zhuǎn)錄，在指數(shù)生長期以及孢子期之前表達(Ahmedetal., 1995)，若在孢子形成早期進行阻斷，則不會積累毒素晶體(El-Bendaryetal., 2005)。不同亞株之間的Bin蛋白非常保守，目前僅報道有5種突變型且任意兩種突變型蛋白序列之間不會超過6個氨基酸的不同(Hireetal., 2009)。Bin毒素蛋白家族的其他成員還包括球形賴氨酸芽孢桿菌的Cry49蛋白；B.thuringiensis的Cry35和Cry36蛋白(Jonesetal., 2007)。對幼蟲的研究發(fā)現(xiàn)，Bin毒素晶體在中腸的堿性環(huán)境中溶解，并進行有限的蛋白水解，變成毒性增加的較小分子量的衍生物(Alyetal., 1989, Davidsonetal., 1990)。這一水解過程在易感和不易感昆蟲中都會發(fā)生(Broadwelletal., 1987)。

最初的毒力作用于昆蟲中腸，中毒后的幼蟲也會表現(xiàn)出神經(jīng)核肌肉組織的損傷。在蚊中腸溶解活化后，毒素結(jié)合到庫蚊胃盲囊和后部中腸的表皮細胞，按蚊的少量局部細胞，而不作用于埃及伊蚊(Davidsonetal., 1988, Oeietal., 1992)。結(jié)合至庫蚊細胞是由BinB蛋白介導(dǎo)的，其可以獨自直接結(jié)合到中腸的特定區(qū)域的GPI-錨定麥芽糖酶(GPI-anchored maltase, Cpm1) (Oeietal., 1992, Darbouxetal., 2001)。該毒素還能與按蚊細胞的刷狀緣膜片段結(jié)合，但在岡比亞按蚊Anophelesgambiae中，BinA可以不需要BinB就可以直接結(jié)合(Charlesetal., 1997)。該蚊種中的Bin蛋白受體也是與Cpm1直接同源的麥芽糖酶，名為Agm1。在埃及伊蚊的另一個蛋白，與Cpm1和Agm1都高度同源的，但埃及伊蚊卻對Bin毒素不敏感，暗示這種作用的特異性可以是由高親和力的小作用域所決定的，而這種小的作用域在蚊種間卻不同源(Opotaetal., 2008)。與受體結(jié)合后將會導(dǎo)致細胞死亡，而這一系列反應(yīng)仍不清楚。研究發(fā)現(xiàn)庫蚊的細胞被毒素作用后，出現(xiàn)了孔洞。使用人造細胞膜進行試驗也得到了相似的結(jié)果(Boonsermetal., 2006)。說明Bin毒素的作用是通過在細胞膜上形成孔洞來實現(xiàn)的。將克隆的Cpm1基因轉(zhuǎn)染至哺乳動物細胞后，在Bin毒素的刺激下細胞表現(xiàn)出孔道的開放，液泡的出現(xiàn)，但未發(fā)現(xiàn)裂解(Pauchetetal., 2005)。進一步的研究發(fā)現(xiàn)Bin毒素作用于這些細胞會導(dǎo)致陽離子通道的開放、毒素與其受體的內(nèi)化以及大型液泡的產(chǎn)生。這些液泡并不與內(nèi)化的毒素共位。內(nèi)化的毒素-受體復(fù)合物進入吞噬內(nèi)體進行降解循環(huán)。一種假設(shè)是孔道的形成可能被p38 分裂激活蛋白激酶所識別，導(dǎo)致了中腸細胞的自噬。Bin毒素會導(dǎo)致液泡產(chǎn)生，但其自己的移動卻是區(qū)域化的，并不會遷移至降解細胞器中。每一種Bin蛋白引起的毒性作用的意義目前仍然不清楚(Opotaetal., 2011)。由于這兩種細菌毒素的不同性質(zhì)，引發(fā)了一系列對于重組毒素的實驗，但這些重組毒素卻沒有用于野外使用。

3 毒素的協(xié)同作用

營養(yǎng)期毒素Mtx1和Mtx2能夠協(xié)同殺傷埃及伊蚊(Rungrodetal., 2009)。同時，營養(yǎng)生長期的Mtx蛋白與孢子期相關(guān)的Bin蛋白也可以聯(lián)合發(fā)揮殺傷作用(Wirthetal., 2007)。在中毒的昆蟲中，大多數(shù)球形賴氨酸芽孢桿菌在幼蟲死亡的時候同時進入營養(yǎng)生長期。因此，營養(yǎng)生長期產(chǎn)生的毒素和Bin毒素可能在自然的球形賴氨酸芽孢桿菌感染過程中相互關(guān)聯(lián)發(fā)揮合作效應(yīng)。Mtx1、Mtx2以及Mtx3是與營養(yǎng)期相關(guān)的毒素，并不會被分泌，早期對不產(chǎn)生Bin毒素的SSII-1株的研究提示蚊中腸對細菌的消化可能是使毒素釋放的原因之一。球形賴氨酸芽孢桿菌toxins和B.thuringiensis毒素的協(xié)同作用也有報道：Mtx1和Cry11A；Mtx2和Cry11A 或Cyt1A；Bin和Cry4A，Cry4B或Cry11A(Wirthetal., 2004; Wirthetal., 2007)。

4 展望

球形賴氨酸芽孢桿菌已經(jīng)證實可以作為一種野外使用的高效蚊控生物殺蟲劑，盡管有一定的耐受出現(xiàn)。處理這個潛在的問題，例如使用重組毒素或與其他殺蟲劑(例如B.thuringiensis)交替使用可以維持球形賴氨酸芽孢桿菌殺蟲劑的效用。最近20年，對球形賴氨酸芽孢桿菌以及它的昆蟲致病性的研究取得了巨大的成就，但仍然存在一些問題未被闡明。雖然我們能夠在野外通過使用高密度的孢子來控制該細菌的過度使用，然而對它的自然生態(tài)學(xué)卻是知之甚少。研究其在自然條件下的持久性和回收利用，從而達到自然環(huán)境能夠接受的最小細菌效量，這將會是一個非常有意義的工作。盡管從分子水平上已經(jīng)獲得了很多關(guān)于其毒力作用機制的信息，但很多細節(jié)仍然是迷。研究表明Bin毒素可以形成孔道，我們便開始去理解靶細胞為什么會液泡化以及一系列類似的有意義的生理現(xiàn)象。但目前仍未鑒定出Mtx1和Mtx2家族蛋白的受體，蚊細胞中Mtx1的ADP-核糖基化結(jié)構(gòu)的分子作用靶點也有待進一步探索。

重組球形賴氨酸芽孢桿菌或其他表達其毒素微生物的研究可能會使該細菌具有極高的效用，有望在野外降低耐受或延長耐受產(chǎn)生時間。我們對該細菌及其毒素更深入的認識必將更加有利于進一步的開發(fā)研究。