曾 香綜述,金玉姬審校

(吉林醫(yī)藥學(xué)院：1.2010級(jí)預(yù)防醫(yī)學(xué)本科班，2.基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，吉林 吉林 132013)

·綜 述·

胚胎干細(xì)胞的研究進(jìn)展

Research progress of Embryonic stem cells

曾 香1綜述,金玉姬2*審校

(吉林醫(yī)藥學(xué)院：1.2010級(jí)預(yù)防醫(yī)學(xué)本科班，2.基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，吉林 吉林 132013)

胚胎干細(xì)胞是來源于胚胎內(nèi)細(xì)胞團(tuán)的具有多向分化潛能的一類干細(xì)胞，自從20世紀(jì)70年代開始研究胚胎干細(xì)胞以來，已經(jīng)廣泛用于生命科學(xué)的許多領(lǐng)域。本文綜述了近些年關(guān)于胚胎干細(xì)胞建系、分化和應(yīng)用的研究進(jìn)展，同時(shí)也指出了目前所面臨的問題。

胚胎干細(xì)胞;臨床應(yīng)用;研究進(jìn)展

胚胎干細(xì)胞(Embryonic stem cells，ESC)是一種從早期胚胎的囊胚內(nèi)細(xì)胞團(tuán)細(xì)胞或胎兒原始生殖細(xì)胞(primordial germ cells，PGCs)中經(jīng)分離、體外抑制分化培養(yǎng)得到的具有發(fā)育全能性(或多能性)的一類干細(xì)胞。與已經(jīng)成熟分化的體細(xì)胞一樣，ES細(xì)胞也是一分為二地分裂增殖，且ESC具有體外培養(yǎng)無限增殖、自我更新和多向分化的特性。在一定的培養(yǎng)條件下，ES細(xì)胞可以在體外長久和穩(wěn)定地自我復(fù)制，實(shí)現(xiàn)“永生”。無論在體外還是體內(nèi)環(huán)境，ES細(xì)胞都能被誘導(dǎo)分化為內(nèi)、中、外3個(gè)胚層的幾乎所有類型細(xì)胞。因此，ES細(xì)胞成為研究哺乳動(dòng)物早期胚胎發(fā)生、細(xì)胞組織分化、基因表達(dá)調(diào)控等發(fā)育生物學(xué)基礎(chǔ)研究的一個(gè)非常理想的模型系統(tǒng)和非常有用的工具，也是進(jìn)行動(dòng)物胚胎工程開發(fā)和用于治療各種疾病，修復(fù)受損傷的組織和器官的一個(gè)重要途徑，具有廣泛的應(yīng)用前景[1]。1999年，《Science》將干細(xì)胞研究評(píng)為21世紀(jì)最重要的10項(xiàng)研究領(lǐng)域之首，ES細(xì)胞的建立、研究和應(yīng)用被認(rèn)為是繼“人類基因組計(jì)劃”之后，醫(yī)學(xué)、生命科學(xué)上的又一革命性進(jìn)展。

1 ES細(xì)胞的基本概念及其研究歷史

胚胎干細(xì)胞研究的起源來自20世紀(jì)70年代對(duì)畸胎瘤的研究：有人把早期的小鼠胚胎移植到成年小鼠體內(nèi)后產(chǎn)生了畸胎癌(即惡性的畸胎瘤)，畸胎癌內(nèi)的細(xì)胞(即EC，胚胎癌細(xì)胞)能在體外自我更新且能分化成不同種類的細(xì)胞，由于這種類型的畸胎癌只能由著床前的早期小鼠胚胎產(chǎn)生，因此推測EC細(xì)胞的來源是胚胎發(fā)育早期短暫出現(xiàn)的外胚層細(xì)胞(epiblast)。關(guān)于EC細(xì)胞的研究使科學(xué)家認(rèn)為可能從小鼠早期胚胎中分離到一種能分化成多種細(xì)胞的具有全能性的干細(xì)胞，即胚胎干細(xì)胞(ESC)。2001年美國國立衛(wèi)生院根據(jù)Austin Smith對(duì)小鼠ES細(xì)胞的研究，對(duì)其概念提出了一系列標(biāo)準(zhǔn)[2]。自從1981年Evans和Kaufman從延緩著床的小鼠囊胚內(nèi)細(xì)胞團(tuán)(ICM)中分離出胚胎干細(xì)胞后，全球就掀起了胚胎干細(xì)胞研究的熱潮。1998年，美國威斯康星大學(xué)的Thomson教授在建立靈長類動(dòng)物胚胎干細(xì)胞系的基礎(chǔ)上，建立了人類胚胎干細(xì)胞系(hES);同年，另一研究小組用流產(chǎn)胎兒性腺成功地分離和培養(yǎng)并建立了人胚胎生殖細(xì)胞(embryonic germ cells,EG細(xì)胞)系[2]。國內(nèi)在細(xì)胞胚胎干方面的綜合性研究雖然起步較晚(1989年)，但發(fā)展非常迅速。在基礎(chǔ)研究方面，尚克剛、賴學(xué)良等已先后建立了小鼠和兔細(xì)胞系，盛惠珍研究小組在國際上首次構(gòu)建了人-兔核移植重構(gòu)胚。在應(yīng)用研究方面，竇忠英的科研小組已第6次從人類胚胎干細(xì)胞中分化誘導(dǎo)得到心臟跳動(dòng)樣細(xì)胞團(tuán)，中國軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院發(fā)現(xiàn)了“人胚胎干細(xì)胞素”，用于臨床多種疾病的治療取得了明顯效果[3]。

2 ES細(xì)胞的基本特性

ES細(xì)胞具有與早期胚胎細(xì)胞相似的形態(tài)結(jié)構(gòu)，細(xì)胞體積小，核大，核質(zhì)比高，有一個(gè)或多個(gè)明顯的核仁，核型正常，具有整倍性。在體外分化抑制性生長時(shí)，ES細(xì)胞呈克隆狀生長，排列緊密，呈鳥巢集落狀，難以看清細(xì)胞界限，集落邊界清晰，有立體感。用堿性磷酸酶染色，ES細(xì)胞呈棕紅色，而周圍的成纖維細(xì)胞呈淡黃色。小鼠ES細(xì)胞的直徑為7～18 μm，豬、牛、羊ES細(xì)胞的顏色較深，直徑為12～18 μm[4]。

ES細(xì)胞具有全能性、無限增殖性、種系傳遞功能，ES細(xì)胞易于進(jìn)行基因改造操作，并保留了正常二倍體的性質(zhì)且核型正常，能參與胚胎各組織器官的生長發(fā)育等生理功能[4]。

ES細(xì)胞表面表達(dá)時(shí)相專一性胚胎抗原(stage-specific embryonic antigen，SSEA)，而且可以檢測到Oct-4基因的表達(dá)，這兩種蛋白為發(fā)育全能性的標(biāo)志。另外，ES細(xì)胞中AFP及端粒酶活性較高，可用于ES細(xì)胞分化與否的鑒定。hES細(xì)胞表達(dá)以下所有分子標(biāo)志物有Oct3/4、TDGF、Sox2、LeftyA、Thy-1、FGF4、Rex1、SSEA3、SSEA4、TRA-1-81、TRA-2-54和GCTM-2,這些分子標(biāo)志物在未分化的hES細(xì)胞中高表達(dá)，在分化細(xì)胞中不表達(dá)或低表達(dá)[5]。

3 ES細(xì)胞的建系與培養(yǎng)

ES細(xì)胞建系，來自由分離的內(nèi)細(xì)胞群細(xì)胞、從5～9周的胚胎生殖腺中分離ES細(xì)胞。也用克隆技術(shù)將體細(xì)胞核移植到去核卵母細(xì)胞中，使之發(fā)育成囊胚，再分離其內(nèi)細(xì)胞群細(xì)胞，由這種方法獲得的細(xì)胞或組織，遺傳物質(zhì)和供體一致，故移植后不會(huì)產(chǎn)生免疫排斥反應(yīng)，Hwang等[6]應(yīng)用這種方法獲得了胚胎干細(xì)胞。1981年，Evans等首先建立了小鼠的ES細(xì)胞系，在此之后近20年里，人們相繼自早期胚胎建立了倉鼠、豬、兔、水貂、大鼠、魚類、鳥類、牛、靈長類動(dòng)物(恒河猴、狨)和人的類ES細(xì)胞系。從PGCs分離克隆到小鼠EG細(xì)胞系后，人們分別自PGCs分離克隆到人、山羊、雞等類ES細(xì)胞[2]。

目前建立的hES細(xì)胞株主要來源于臨床進(jìn)行體外受精-胚胎移植(in vitro fertilization and embryo transfer，IVF-ET)和胞漿內(nèi)單精子注射(intracytoplasmic sperm injection，ICSI)治療的患者捐贈(zèng)的多余廢棄的新鮮或冷凍解凍后的胚胎。首先需去除囊胚的透明帶，常規(guī)的方法為鏈蛋白酶消化；然后去除外圍的滋養(yǎng)細(xì)胞層，可用機(jī)械法或利用補(bǔ)體介導(dǎo)的免疫手術(shù)法分離內(nèi)細(xì)胞團(tuán)；最后將完整的內(nèi)細(xì)胞團(tuán)接種在小鼠胚胎成纖維細(xì)胞(primary mouse embryo fibroblast，PMEF)飼養(yǎng)層上，后者一般用絲裂霉素處理或放射線照射的方法使其失去增殖能力。一段時(shí)間的培養(yǎng)后，hES細(xì)胞從內(nèi)細(xì)胞團(tuán)中長出來，形成集落樣的結(jié)構(gòu)，經(jīng)過反復(fù)傳代，建成hES 細(xì)胞系[7]。

ES細(xì)胞需要特殊的培養(yǎng)基。常用改良伊格爾培養(yǎng)基(MEM)α、達(dá)氏修正依氏培養(yǎng)基(DMEM)、組織培養(yǎng)基(TCM)199、F12等合成培養(yǎng)基。飼養(yǎng)層細(xì)胞能向培養(yǎng)液中分泌多種細(xì)胞因子，在一定程度上影響并調(diào)節(jié)細(xì)胞的生長。如白血病抑制因子(leukemia inhibitory factor，LIF)等細(xì)胞分化抑制因子和成纖維細(xì)胞生長因子、胰島素樣生長因子等促有絲分裂因子。培養(yǎng)ES細(xì)胞常用的飼養(yǎng)層有STO、SNL(G418R基因和LIF基因轉(zhuǎn)染的STO)、HBC5637、小鼠胚胎成纖維細(xì)胞(PMEF)等。PMEF與STO細(xì)胞一樣也能分泌抑制ES細(xì)胞分化的因子LIF，且PMEF與STO細(xì)胞相比其形成ES細(xì)胞的克隆率、維持ES細(xì)胞正常核型的能力及形成嵌合體的能力均比STO細(xì)胞要好一些[9]。

hES細(xì)胞的培養(yǎng)體系主要分為：含飼養(yǎng)層細(xì)胞培養(yǎng)法和無飼養(yǎng)層細(xì)胞培養(yǎng)法。

小鼠胚胎成纖維細(xì)胞(PMEF)是培養(yǎng)hES細(xì)胞最常用的飼養(yǎng)層。胎盤來源的飼養(yǎng)層細(xì)胞可以很好地支持hES生長并且不需要添加bFGF，這可能與飼養(yǎng)層細(xì)胞增強(qiáng)了內(nèi)源性bFGF表達(dá)或激活hES的ERK1/2-c-Fos/c-Jun信號(hào)通路有關(guān)。流產(chǎn)胎兒的皮膚和肌肉細(xì)胞，以及成人輸卵管上皮細(xì)胞體外培養(yǎng)后均能夠支持hES細(xì)胞的體外擴(kuò)增，而且他們用人血清代替SR或胎牛血清，用這種新的飼養(yǎng)層細(xì)胞建立了一株無動(dòng)物源性蛋白污染的細(xì)胞系，為將來安全的將細(xì)胞應(yīng)用于臨床治療帶來了希望。不過，即使是人源飼養(yǎng)層也不能排除異體污染的風(fēng)險(xiǎn)，所有目前的ES細(xì)胞還是無法滿足臨床應(yīng)用的要求[11]。

也用PMEF制備的條件培養(yǎng)液和基質(zhì)膠(matri gel，作為貼壁基質(zhì))建立hES的無飼養(yǎng)層的培養(yǎng)體系；在培養(yǎng)液中添加TGF、LIF及bFGF，輔助以fibronectin也建立了無飼養(yǎng)層培養(yǎng)體系；還可以通過使用特異性化學(xué)藥物激活Wnt信號(hào)途徑來維持ES細(xì)胞在無飼養(yǎng)層條件下的生長。近年來技術(shù)人員通過研究hES自我更新機(jī)制有關(guān)的信號(hào)通路開發(fā)出許多無飼養(yǎng)層、無異源污染的培養(yǎng)液，這些培養(yǎng)液中包含一些激活干細(xì)胞自我更新通路或抑制其分化的重組生長因子。目前已經(jīng)有較多商業(yè)化的無飼養(yǎng)層、無異源污染的成分明確的培養(yǎng)液出現(xiàn)，但是已被報(bào)道可用于hES建系的培養(yǎng)液僅有TeSR1，尚處試驗(yàn)階段未被商業(yè)化[12]。

4 ES細(xì)胞的定向分化及其機(jī)制

目前所使用的誘導(dǎo)方法主要包括：外源性生長因子誘導(dǎo)ES細(xì)胞分化、轉(zhuǎn)基因誘導(dǎo)ES細(xì)胞分化、ES細(xì)胞與其他細(xì)胞共培養(yǎng)的方式誘導(dǎo)ESC分化等[13]。

ES細(xì)胞可在體外誘導(dǎo)分化為神經(jīng)細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、成骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、肝細(xì)胞、心肌細(xì)胞、滋養(yǎng)層細(xì)胞、角化細(xì)胞、生殖細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、造血細(xì)胞、肺細(xì)胞和胰島細(xì)胞等多種細(xì)胞類型[14]。

ES細(xì)胞的分化受內(nèi)源性因素和外源性因素的共同調(diào)節(jié)。細(xì)胞內(nèi)基因表達(dá)的調(diào)控作用是ES細(xì)胞發(fā)生分化的決定因素，細(xì)胞所在的環(huán)境條件對(duì)ES細(xì)胞的分化也有重要影響。

內(nèi)源性調(diào)控：①基因因素。奢侈基因?qū)?xì)胞決定著細(xì)胞向特殊類型分化的物質(zhì)基礎(chǔ)，如編碼肌細(xì)胞肌球蛋白基因，編碼結(jié)締組織的膠原蛋白基因等。②細(xì)胞蛋白的調(diào)控。細(xì)胞的結(jié)構(gòu)蛋白如膜收縮蛋白和細(xì)胞周期素A、硫酸乙酰肝素(heparan sulfate，HS)、分泌性蛋白質(zhì)Nodal等都是對(duì)干細(xì)胞自我更新有著重要作用的細(xì)胞蛋白。③轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控。Oct-4和Nanog是兩種維持干細(xì)胞多能性和自我更新的轉(zhuǎn)錄因子，分別與Sox 2、FoxD3等其他轉(zhuǎn)錄因子以及LIF、骨形態(tài)生成蛋白(BMP)等胞外信號(hào)通路互相作用，在特異時(shí)空激活或抑制靶基因的轉(zhuǎn)錄[2]。

外源性調(diào)控：①分泌因子。間質(zhì)細(xì)胞能夠分泌許多因子，維持干細(xì)胞的增殖、分化。特別是TGF-β家族和Wnt信號(hào)通路在不同組織中都發(fā)揮重要作用；②蛋白信號(hào)。有些信號(hào)是通過細(xì)胞-細(xì)胞的直接接觸起作用的。β-Catenin就是一種介導(dǎo)細(xì)胞黏附連接的結(jié)構(gòu)成分，穿膜蛋白Notch及其配體Delta或Jagged也對(duì)干細(xì)胞分化有重要影響，變異的組蛋白H2AZ在染色質(zhì)功能的發(fā)育過程中是一個(gè)關(guān)鍵的調(diào)控因子，對(duì)基因表達(dá)等功能起重要的作用。③細(xì)胞外物質(zhì)的介導(dǎo)作用。細(xì)胞外起介導(dǎo)作用的物質(zhì)包括細(xì)胞外基質(zhì)、黏附分子、激素和細(xì)胞因子等[2]。

5 ESC的應(yīng)用

ES細(xì)胞及其體外分化模型能夠模擬胚胎正常發(fā)育進(jìn)程，在發(fā)育生物學(xué)、轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的生產(chǎn)、克隆動(dòng)物、動(dòng)物和人類疾病模型的建立、藥物的開發(fā)和篩選、基因治療、細(xì)胞組織和器官的修復(fù)和移植治療等方面都有廣泛的應(yīng)用前景。

5.1 研究胚胎發(fā)育及疾病的發(fā)生

許丹等證明用ES細(xì)胞培養(yǎng)體系對(duì)小鼠的早期胚胎進(jìn)行培養(yǎng),可以顯著提高小鼠早期胚胎的發(fā)育率[15]。還可以通過胚胎干細(xì)胞建立體外分化模型，并建立各種基因改變的胚胎干細(xì)胞系，以求發(fā)現(xiàn)某些基因或細(xì)胞因子在胚胎發(fā)育早期對(duì)不同類型細(xì)胞或組織分化的作用。hES細(xì)胞可用于研究人胚的早期發(fā)育,因?yàn)樵缙谌伺甙l(fā)育過程尚不明了,能導(dǎo)致先天性缺陷和胎盤異常而導(dǎo)致流產(chǎn)的事件。研究體外hES細(xì)胞，可以鑒定引致這些問題的遺傳學(xué)、分子生物學(xué)和細(xì)胞學(xué)事件，并確定如何預(yù)防其發(fā)生。hES細(xì)胞也可用于探索胚胎早期發(fā)育中染色體的異常，包括檢測早期兒童腫瘤的發(fā)生[16]。

5.2 用于細(xì)胞、組織的修復(fù)和移植治療

ES細(xì)胞最誘人的前景和用途是生產(chǎn)組織和細(xì)胞，因?yàn)樗哂邪l(fā)育分化成構(gòu)成機(jī)體的所有類型組織細(xì)胞的能力，任何因物理、化學(xué)或生物因素等造成的細(xì)胞損傷或病變引起的疾病都可以通過移植由ES細(xì)胞定向分化而來的特異組織細(xì)胞或器官來治療[2]。并且，通過控制胚胎干細(xì)胞生長環(huán)境、向胚胎干細(xì)胞轉(zhuǎn)染某一種系細(xì)胞形成的決定基因等，可獲得數(shù)量不受限制的特定種系的較純化的細(xì)胞，為細(xì)胞移植提供源源不盡的無免疫性的材料。如果這些細(xì)胞用于移植治療，將給帕金森氏病、脊髓損傷、糖尿病、心肌損傷、肝硬化、腎衰竭、各種血液疾病等疑難病癥的治療帶來新的希望[7]。

5.3 用于基因治療

通過將人胚胎干細(xì)胞定向誘導(dǎo)分化成所需的細(xì)胞、組織、器官，不僅解決了移植材料來源困難問題，又可以對(duì)干細(xì)胞的基因做某些修改，即破壞細(xì)胞中表達(dá)組織相容性復(fù)合物的基因，以躲避受者免疫系統(tǒng)的監(jiān)視，從而防止免疫排斥反應(yīng)的發(fā)生。另一種克服移植免疫排斥反應(yīng)的設(shè)想是結(jié)合克隆技術(shù)創(chuàng)建患者特異性的干細(xì)胞，用這種干細(xì)胞培養(yǎng)獲得的細(xì)胞、組織或器官，其基因和細(xì)胞膜表面的主要組織相容性復(fù)合體與患者的完全一致，不會(huì)導(dǎo)致免疫排斥反應(yīng)。另外，利用基因打靶技術(shù)使外源性DNA與胚胎干細(xì)胞中的相應(yīng)部分重組，或靶向破壞等位基因造成基因純合失效來治療某些遺傳性疾病，具有基因轉(zhuǎn)移效率高、易于操作的優(yōu)點(diǎn)。hES細(xì)胞可作為開發(fā)遺傳工程的一種新方法。當(dāng)前小鼠ES細(xì)胞的體外遺傳互補(bǔ)極易通過同源重組技術(shù)實(shí)現(xiàn),這是一種替換或添加基因的技術(shù)，它需要人為地將一個(gè)DNA分子導(dǎo)入基因組并表達(dá)它。利用這一方法，誘導(dǎo)分化成特定類型細(xì)胞的基因或表達(dá)所需蛋白產(chǎn)物的基因可以被導(dǎo)入ES細(xì)胞。如果利用人ES細(xì)胞使這一技術(shù)得以開發(fā),則可設(shè)計(jì)出基因治療的好方法[18]。

5.4 用于藥物篩選和藥物開發(fā)

新藥在臨床使用前需要進(jìn)行一系列的檢測和實(shí)驗(yàn)，這些實(shí)驗(yàn)都依靠動(dòng)物來完成，但是動(dòng)物模型實(shí)驗(yàn)不可能完全反映藥物對(duì)人體細(xì)胞的作用。胚胎干細(xì)胞能模擬體內(nèi)細(xì)胞或組織對(duì)被檢測藥物的反應(yīng)，使結(jié)果更接近真實(shí)情況，從而提供更安全、更有效、更經(jīng)濟(jì)的藥物篩選模型。于洲等對(duì)建立的胚胎干細(xì)胞神經(jīng)發(fā)育毒性評(píng)價(jià)模型的研究證明，其可以作為體外發(fā)育毒性評(píng)價(jià)方法對(duì)神經(jīng)發(fā)育毒物進(jìn)行篩選。此外，由于ES細(xì)胞類似于早期胚胎組織，它還可用來揭示哪些藥物會(huì)干擾胎兒的發(fā)育，引起出生缺陷。并且還可利用人胚胎干細(xì)胞建立人類疾病模型，在分子水平上研究疾病的發(fā)生機(jī)制，幫助尋找更有效的治療方法和藥物[19]。

6 目前存在的問題及展望

在ES細(xì)胞的研究中，仍然存在著許多問題，如誘導(dǎo)分化效率低、定向細(xì)胞分離和純化困難、培養(yǎng)條件滯后、定向分化的機(jī)制、臨床應(yīng)用與轉(zhuǎn)基因的安全性、交叉污染、免疫排斥等。除這些外，由于ESC涉及早期胚胎，因此由涉及的倫理、社會(huì)、法律、醫(yī)學(xué)、神學(xué)和道德等爭議也限制了當(dāng)前hES細(xì)胞的發(fā)展，不得不引起重視[20]。

近年來的研究顯示，體細(xì)胞在四個(gè)轉(zhuǎn)錄因子Oct-4、Klf-4、Sox-2和c-Myc的作用下可以重編程為誘導(dǎo)多能干細(xì)胞(induced pluripotent stem cells，iPSC)。由于人iPSC可以較容易地由個(gè)體自身的體細(xì)胞經(jīng)誘導(dǎo)獲得，同時(shí)避免倫理方面的問題，因此，iPSC被認(rèn)為是替代ESC的良好材料。為了提高iPS細(xì)胞技術(shù)的效率及安全性，研究圍繞著篩選標(biāo)記、載體系統(tǒng)、轉(zhuǎn)導(dǎo)基因的種類、體細(xì)胞類型和一些可以促進(jìn)效率提高的化合物篩選等展開，目前進(jìn)展很快。

但是，iPS細(xì)胞也存在許多謎團(tuán)，如iPS細(xì)胞其體細(xì)胞特異的基因是否完全沉默、重編程的結(jié)果差異和危險(xiǎn)性等[21]。希望隨著科技的發(fā)展，科學(xué)家們能陸續(xù)解答這些謎團(tuán)，讓ESC和iPS更好的造福于人類。

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1673-2995(2014)01-0062-05

吉林省科技發(fā)展計(jì)劃項(xiàng)目基礎(chǔ)研究自然科學(xué)基金項(xiàng)目(課題號(hào)：20130101147JC);吉林省2013年大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計(jì)劃項(xiàng)目.

曾 香(1990-)，女(漢族)，在讀本科.

金玉姬(1965-)，女(朝鮮族)，教授，博士.

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A

2013-11-21)