趙平偉 ，費(fèi) 強(qiáng)

（1.山西省飼料獸藥監(jiān)察所，山西太原030027；2.山西省汾陽(yáng)市動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，山西汾陽(yáng) 032200）

雞新城疫血凝抑制試驗(yàn)（HI試驗(yàn)）是診斷新城疫疫病、掌握雞群動(dòng)態(tài)、制定免疫程序的重要手段，因?yàn)槠淇旖?、成本較低、便于操作、能夠處理大量的樣品，所以成為動(dòng)物疫病實(shí)驗(yàn)室常用的檢測(cè)方法。但是很多從業(yè)人員缺乏系統(tǒng)的血清學(xué)檢測(cè)知識(shí)，容易出現(xiàn)試驗(yàn)結(jié)果偏差，甚至誤判，造成新城疫的發(fā)生和流行，給雞場(chǎng)帶來(lái)巨大的經(jīng)濟(jì)損失。

因此，正確運(yùn)用和熟練掌握試驗(yàn)方法至關(guān)重要。筆者在長(zhǎng)期實(shí)驗(yàn)室工作中反復(fù)操作，不斷摸索，積累了一些經(jīng)驗(yàn)，原與大家共同探討。

1 新城疫血凝試驗(yàn)和血凝抑制試驗(yàn)的原理和方法

新城疫病毒能選擇性地使某種或某幾種動(dòng)物的紅細(xì)胞發(fā)生凝集，此即為新城疫血凝試驗(yàn)（HA試驗(yàn)）。方法是用雞紅細(xì)胞與新城疫標(biāo)準(zhǔn)抗原作用，檢測(cè)出標(biāo)準(zhǔn)抗原血凝單位，為血凝抑制試驗(yàn)作準(zhǔn)備。而紅細(xì)胞凝集現(xiàn)象可于新城疫病毒懸液中加入特異性免疫血清所抑制，即為血凝抑制試驗(yàn)。方法是將檢測(cè)出血凝單位的新城疫標(biāo)準(zhǔn)抗原配制后與受檢血清反應(yīng)，再加入紅細(xì)胞作用。血凝抑制試驗(yàn)用于檢測(cè)受檢血清抗體血凝抑制滴度，判定受檢血清抗體是否為陽(yáng)性。

2 器材的選擇

2.1 反應(yīng)板、移液器、吸頭的選擇

為使微量反應(yīng)板、移液器、吸頭保持最佳工作狀態(tài)，應(yīng)建立選擇、使用、維護(hù)的標(biāo)準(zhǔn)操作程序，條件允許的情況下，微量反應(yīng)板、吸頭盡量使用一次性產(chǎn)品。

反應(yīng)板最好用96孔V型板，切記不可用試管刷刷板，以免破壞孔內(nèi)壁的光滑性。板必須刷凈，不干凈的板會(huì)出現(xiàn)自凝現(xiàn)象。試驗(yàn)完畢后，用自來(lái)水反復(fù)沖洗反應(yīng)板，浸在2％鹽酸溶液中1小時(shí)，再用自來(lái)水沖洗，浸入1％氫氧化鈉 15分鐘后，拿出來(lái)用自來(lái)水沖洗，最后浸泡于蒸餾水中30分鐘以上，撈出后將孔內(nèi)水甩干凈，倒放于37℃恒溫箱中烘干備用。對(duì)底部磨損嚴(yán)重的反應(yīng)板要及時(shí)淘汰。

實(shí)驗(yàn)時(shí)應(yīng)選用數(shù)字式單道和多道移液器。平時(shí)要做好移液器的保養(yǎng)及校驗(yàn)工作，這對(duì)保證移液器的準(zhǔn)確性非常重要，每次使用完畢，要將移液器量程調(diào)至最大刻度，以保持移液器彈簧的最好靈敏度，使用前核對(duì)刻度容量與實(shí)際容量是否相符。

吸頭應(yīng)光潔平滑，能與移液器上的吸頭套密封完好。

2.2 樣品的采集與保存

從1日齡測(cè)定新城疫母源抗體開(kāi)始，定期采樣監(jiān)測(cè)，早期每隔1～2周監(jiān)測(cè)一次，以后隨日齡的增大每3～4周測(cè)定一次。樣品應(yīng)具有足夠的數(shù)量和一定的代表性，一般萬(wàn)只以上雞群按0.5％采樣，小型雞群按1％采樣。采樣時(shí)應(yīng)從雞群的多個(gè)位置抓雞，采集病、弱雞只血樣應(yīng)單獨(dú)標(biāo)明。

隨機(jī)采樣時(shí)，應(yīng)對(duì)雞群品種、日齡、疫苗種類(lèi)、疫苗廠家、生產(chǎn)批號(hào)、免疫時(shí)間、免疫途徑、采樣數(shù)量等詳細(xì)登記，以便檢測(cè)后進(jìn)行結(jié)果分析和判斷，為新城疫免疫提供數(shù)據(jù)。

在翅靜脈采血時(shí)，多用一次性塑料管引流采血，其優(yōu)點(diǎn)是簡(jiǎn)單、快速，對(duì)雞只損傷小，封口后便于攜帶、存放和分離血清。采樣時(shí)采血量不得少于管長(zhǎng)的2/3，否則血量過(guò)少，分離到的血清不足，影響監(jiān)測(cè)結(jié)果。采血后，塑料管的一端要隨即密封，以免漏掉血清。如果用注射器采血，可用清潔、干燥無(wú)菌的小瓶盛裝，血液要放成傾斜，不能直立，否則不易分離出血清。另外還要在塑料或小瓶上標(biāo)明編號(hào)，以便區(qū)分。

除了離心分離血清外，如果想讓血清自然析出，不要馬上將血清放于冰箱內(nèi)，要在室溫（20℃左右）下放置2～3小時(shí)，待血清析出后，再放入4℃冰箱內(nèi)，這樣不但有利于血清的析出，又可避免血清高溫下污染變質(zhì)和溶血現(xiàn)象發(fā)生。

2.3 試劑的配制

雞新城疫血凝抑制試驗(yàn)最常用的稀釋液為0.85％的生理鹽水，要求其無(wú)菌、無(wú)雜質(zhì)。稀釋液PH值調(diào)整為7.0時(shí)，紅細(xì)胞沉降最充分，圖像最清晰，HI滴度值最大。若稀釋液偏酸性，易使紅細(xì)胞溶解；偏堿性時(shí)，吸附于紅細(xì)胞上的病毒易脫落。

不同雞的紅細(xì)胞對(duì)新城疫病毒的敏感性不同，有的雞紅細(xì)胞有自凝現(xiàn)象，有的雞紅細(xì)胞沉降慢，故試驗(yàn)時(shí)最好采3～4只成年健康公雞的血液混合，并用生理鹽水多次充分洗滌。紅細(xì)胞懸液的濃度要盡量準(zhǔn)確，如果濃度偏低，HA效價(jià)就偏高，HI效價(jià)就偏低；相反地，如果紅細(xì)胞懸液濃度偏高，HA效價(jià)就偏低，HI效價(jià)就偏高。紅細(xì)胞懸液使用時(shí)最好現(xiàn)用現(xiàn)配。

由于新城疫HI試驗(yàn)的結(jié)果判定是以完全抑制4單位抗原（4HAU）的血清最高稀釋倍數(shù)作為HI滴度的，檢測(cè)用的抗原稀釋為4單位抗原后還需要一次回歸實(shí)驗(yàn)，即檢測(cè)4單位抗原是否準(zhǔn)確?？乖貧w步驟如下：取50微升的生理鹽水加入微量反應(yīng)板的第1～4孔；將配制的4單位抗原50微升加入第1孔，然后依次倍比稀釋至第4孔，最后棄去50微升；4個(gè)孔再補(bǔ)加50微升生理鹽水，最后4個(gè)孔加紅細(xì)胞懸液50微升并混勻，室溫靜置30分鐘觀察結(jié)果。若第1、2孔紅細(xì)胞完全凝集，第3孔出現(xiàn)75％凝集，說(shuō)明4單位抗原配制準(zhǔn)確，可用于HI試驗(yàn)。若第3孔也出現(xiàn)完全凝集，說(shuō)明HA效價(jià)提高了一個(gè)滴度，需等量稀釋抗原；若只有第1孔出現(xiàn)完全凝集，說(shuō)明HA效價(jià)降低了一個(gè)滴度，抗原量需要加倍。如果標(biāo)準(zhǔn)抗原血凝價(jià)偏高，測(cè)定的血清抗體效價(jià)將偏低，反之待測(cè)定的血清抗體效價(jià)偏高。所以標(biāo)準(zhǔn)抗原的配制及檢測(cè)的準(zhǔn)確性對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果產(chǎn)生較大影響。

3 操作中的注意事項(xiàng)

微量移液器使用時(shí)有二個(gè)阻力位置，壓到第一個(gè)阻力位置為所調(diào)刻度的量值，為吸取液體時(shí)使用，再加壓力的第二個(gè)阻力位置為放液時(shí)使用。注意拇指用力，不要在吸取液體時(shí)將移液器重力壓過(guò)第一個(gè)阻力位置，否則會(huì)造成吸取液體偏多使試驗(yàn)結(jié)果不準(zhǔn)確。

在新城疫HI試驗(yàn)中有4次加樣步驟，即加生理鹽水、待檢血清、4單位抗原、紅細(xì)胞懸液。加樣時(shí)應(yīng)注意以下幾點(diǎn)：移液器吸頭需碰觸器壁以除去多余的液體；吸頭內(nèi)液面應(yīng)保持一致；在對(duì)被檢血清進(jìn)行倍比稀釋時(shí)，吸頭要插入液面以下，避免產(chǎn)生泡沫；加4單位抗原和紅細(xì)胞懸液時(shí)，吸頭要離開(kāi)液面，最好從后往前加；紅細(xì)胞懸液在試驗(yàn)時(shí)要充分搖勻等。

環(huán)境溫度對(duì)新城疫HI試驗(yàn)值的影響比較大，呈正相關(guān)。同時(shí)環(huán)境溫度影響出現(xiàn)結(jié)果的快慢，溫度高，出現(xiàn)結(jié)果快；但溫度過(guò)高，會(huì)出現(xiàn)反應(yīng)物解離和紅細(xì)胞溶血現(xiàn)象，所以，實(shí)驗(yàn)室應(yīng)配備空調(diào)，將溫度控制在20℃～25℃。

在室溫下，抗原抗體作用25～30分鐘為宜，加入紅細(xì)胞懸液后，以紅細(xì)胞對(duì)照完全沉淀的前后5分鐘內(nèi)判定結(jié)果較好。判定結(jié)果偏早，所測(cè)得的結(jié)果不能反映實(shí)際抗體水平；判定時(shí)間太遲，紅細(xì)胞易發(fā)生溶血現(xiàn)象，導(dǎo)致試驗(yàn)無(wú)效。

4 結(jié)果判定

在對(duì)照孔出現(xiàn)正確結(jié)果的情況下，以完全抑制紅細(xì)胞凝集的最大稀釋度為該血清的血凝抑制滴度。

監(jiān)測(cè)雞群的免疫水平時(shí)，要求新城疫血凝抑制滴度大于或等于4 log2，但是抽檢樣品若有10％以上出現(xiàn)11 log2以上的高血凝抑制滴度，應(yīng)考慮雞群是否受到新城疫強(qiáng)毒感染。

5 試驗(yàn)中常見(jiàn)錯(cuò)誤分析

全部凝集：紅細(xì)胞受到污染或保存時(shí)間過(guò)長(zhǎng)；4單位抗原效價(jià)過(guò)高或滴加失誤；生理鹽水受到污染。

整板無(wú)凝集：4單位抗原失效；試驗(yàn)中少加4單位抗原步驟；環(huán)境溫度高，讀秒時(shí)間拖延。

跳孔：倍比稀釋時(shí)，操作順序錯(cuò)亂；使用多道移液器時(shí)，每次吸取的液體量不一致；個(gè)別孔滴加4單位抗原時(shí)遺漏。

整板樣品效價(jià)為1 log2：操作時(shí)遺漏了倍比稀釋步驟。