繆黃泰，聶紹平

(首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京安貞醫(yī)院急診危重癥中心，北京100029)

近年來，隨著細胞生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，人們對于細胞去分化的關(guān)注日趨增多。研究細胞去分化也不僅僅局限于細胞本身改變等微觀層面，已經(jīng)延伸至哺乳動物功能改變等宏觀層面，并為去分化由基礎(chǔ)研究向臨床應(yīng)用轉(zhuǎn)化奠定了良好的基礎(chǔ)。去分化是指已經(jīng)分化成熟的細胞，改變原有的分化程序，失去原有的結(jié)構(gòu)和功能，變回相對原始幼稚的狀態(tài)?，F(xiàn)有研究證實，在動物界，除了蚯蚓、兩棲類動物、斑馬魚等具有很強的再生能力之外，哺乳動物和人類的表皮細胞、脂肪細胞、神經(jīng)細胞、軟骨細胞、肝細胞、漿細胞以及部分腫瘤細胞等同樣具備一定的再生潛力，均存在去分化現(xiàn)象。本文就細胞去分化相關(guān)研究闡述去分化用于細胞治療的前景。

1 在體去分化現(xiàn)象的研究

部分活體動物在發(fā)生炎性反應(yīng)、腫瘤以及遭受創(chuàng)傷后，在自我更新和修復(fù)過程中，存在細胞去分化現(xiàn)象。這一現(xiàn)象可以出現(xiàn)在不同的組織中例如，神經(jīng)組織、皮膚組織及肌肉組織等，并伴隨一系列生物學(xué)反應(yīng)。細胞水平、蛋白水平和基因水平等均可以檢測到相應(yīng)的變化，并能夠在病理上得到一定證實。

通過大鼠坐骨神經(jīng)的遠端殘留神經(jīng)橫斷面檢測的細胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶(extracellular regulated protein kinases，ERK)的活性水平，發(fā)現(xiàn)坐骨神經(jīng)橫斷，即軸突的損傷可以產(chǎn)生一種強大而持久的信號，可以誘導(dǎo)相應(yīng)施旺細胞ERK信號的增強，進而誘導(dǎo)細胞去分化［1］。同樣將去除基底層細胞的人類表皮貼片用4，6-二脒基-2-苯基吲哚(4，6-diamidino-2-phenylindole，DAPI)標記后移植到全層皮膚受損的裸鼠身上，移植后7 d，對棘細胞層和顆粒層的免疫組化分析顯示部分細胞DAPI以及CK19和CK14或者β1整合蛋白呈現(xiàn)陽性［2］。這些結(jié)果表明，在體內(nèi)部分已經(jīng)分化的表皮細胞發(fā)生去分化，從而轉(zhuǎn)變?yōu)楸砥じ杉毎虮砥じ杉毎麡蛹毎?。?jīng)過形態(tài)學(xué)等方法檢測，這些去分化得到的表皮干細胞不僅形態(tài)類似于正常表皮干細胞，而且其核型檢查也與正常表皮干細胞相一致。如果將出生后1 d的小鼠的部分心臟組織切除，可以在心臟切除部分觀察到有大量的心肌細胞呈現(xiàn)出紊亂的肌節(jié)結(jié)構(gòu)，這種增生反應(yīng)在切除后7 d達到頂峰，并且遍及整個心臟組織，這些發(fā)現(xiàn)與新生小鼠心臟心肌細胞具備廣泛去分化和增殖的再生潛能相一致，而這種再生能力在小鼠出生7 d后消失。遺傳原基分布圖對再生部分心肌細胞的起源譜系進行分析表明，這些心肌細胞來源于心肌細胞譜系而不是非特異性心臟干細胞［3］。在配對基因盒5(Pax5)缺失的小鼠體內(nèi)，外周淋巴器官的成熟B細胞可以去分化形成骨髓中早期未分化定型的祖細胞，可以挽救胸腺中T淋巴細胞缺陷小鼠的T淋巴細胞生成。這些B細胞來源的T細胞，不僅攜帶免疫球蛋白重鏈和輕鏈基因重組，而且和功能性T細胞一樣參與免疫反應(yīng)［4］。對于腸上皮細胞(intestinal epithelial cell，IEC)遺傳模型的研究，發(fā)現(xiàn)去分化還與腫瘤細胞存在密切關(guān)系。NF-κB是炎性腫瘤微環(huán)境中的一個關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子，能夠調(diào)節(jié)Wnt信號，升高的NF-κB信號可以增強Wnt信號激活和誘導(dǎo)表皮細胞發(fā)生去分化轉(zhuǎn)變?yōu)槟[瘤起始細胞。

2 體外去分化現(xiàn)象的研究

動物細胞脫離在體環(huán)境后，可以在體外通過添加誘導(dǎo)劑或模擬在體環(huán)境，同樣能夠發(fā)生去分化。這種去分化常常對生物學(xué)信號存在一定的依耐性，一些化學(xué)分子可以作為多功能誘導(dǎo)劑，可以有效誘導(dǎo)多種細胞發(fā)生去分化。去分化后得到的相對原始的細胞，其功能學(xué)也發(fā)生相應(yīng)變化。

取大鼠坐骨神經(jīng)的施旺細胞進行體外培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)，Raf信號通過ERK途徑阻斷并反轉(zhuǎn)細胞分化，即使在軸突存在的情況下，Raf/ERK信號依然能夠誘導(dǎo)細胞去分化［1］。同樣在體外將無胸腺的野生型裸鼠的胚胎上皮和成年兔的角膜中心上皮進行結(jié)合，在相關(guān)的胚胎毛囊發(fā)育信號Wnts的控制下，已分化定型的成年兔角膜上皮基底細胞發(fā)生去分化，還原成邊緣性基底細胞表型。最初的過程包含Pax6的下調(diào)以及角膜特異性蛋白表達和基底角化細胞標記誘導(dǎo)的缺失。這些去分化的細胞通過Noggin依耐性機制，能夠再刺激真皮濃集區(qū)，接著誘導(dǎo)Pax6表達缺失的細胞形成毛囊濾泡。隨后，由新近分離的毛囊干細胞衍生的細胞分化形成表皮［5］。逆轉(zhuǎn)素reversine是一種2，6二甲基嘌呤衍生物，于2004年首次被發(fā)現(xiàn)能夠誘導(dǎo)小鼠定向分化的肌源性C2C12細胞去分化形成多能祖細胞，并能夠分化形成骨細胞和脂肪細胞。之后又陸續(xù)發(fā)現(xiàn)該化合物能夠誘導(dǎo)多種腫瘤細胞出現(xiàn)周期停滯、多倍體和細胞凋亡，可以抑制腫瘤細胞的生長和增殖，最終導(dǎo)致其死亡［6－7］，而其對于正常細胞的影響相對較?。?］;在50 nmol/L 的低濃度下，reversine顯著提高人類骨髓間充脂肪干細胞和脂肪組織干細胞的分化率［9］;reversine還能夠使包括影響細胞間相互作用、細胞運動、細胞生長發(fā)育的很多基因表達發(fā)生顯著改變，增強成熟Wistar大鼠纖維化細胞的可塑性，促進其去分化形成骨祖細胞樣細胞［10］。最近研究將骨髓間充質(zhì)干細胞來源的神經(jīng)細胞去除神經(jīng)細胞誘導(dǎo)劑，換用含血清培養(yǎng)液可以去分化成較原始的細胞群，稱為去分化的骨髓間充質(zhì)干細胞。這種去分化的細胞保留了干細胞的特征，但與原始骨髓間充質(zhì)干細胞相比，去分化的骨髓間充質(zhì)干細胞在體外能改善細胞存活并提高神經(jīng)元分化潛能;在大鼠腦損傷模型中，這種去分化的骨髓間充質(zhì)干細胞能明顯改善認知功能［11］。分離提純大鼠心肌細胞，培養(yǎng)數(shù)天以后發(fā)現(xiàn)，純化的心肌細胞失去他們特有的電生理學(xué)的性質(zhì)和紋理，變得扁平并開始分開。很多去分化的心肌細胞開始表達干細胞抗原c-kit，早期心臟轉(zhuǎn)錄因子GATA4和Nkx2.5;部分心肌細胞來源的細胞在體外自發(fā)形成球形，并能夠再分化形成心肌細胞和內(nèi)皮細胞［11］。

3 細胞去分化的可能機制

細胞在接受外界相應(yīng)刺激的情況下發(fā)生去分化，該過程可能涉及細胞基因表達、細胞內(nèi)環(huán)境、細胞內(nèi)信號傳導(dǎo)以及細胞表型的改變。如果其中某個環(huán)節(jié)被中斷，去分化過程將受阻。去分化的發(fā)生往往是在某些特定生物學(xué)刺激下發(fā)生的，這些刺激在細胞中被轉(zhuǎn)化為生物學(xué)信號，進而引導(dǎo)細胞逐步發(fā)生去分化。

體外培養(yǎng)的兔腎近端小管細胞，在遭受部分細胞氧化劑損傷死亡后，表皮細胞生長因子(epidermal growth factor，EGF)受體、P38、Scr和促細胞分裂劑激活性蛋白激酶3(mitogen activated protein kinase kinase 3，MKK3)被活化，最終存活的細胞發(fā)生去分化;其去分化機制可能包括:P38調(diào)節(jié)EGF受體的活化;Scr激活MKK3;MKK3逆向活化P38，最終由EGF受體來參與調(diào)節(jié)腎近端小管細胞的去分化，特異性抑制劑抑制EGF受體或P38后可阻斷腎近端小管細胞去分化［11］。另一項研究將無胸腺的野生型裸鼠的胚胎上皮和成年兔的角膜中心上皮結(jié)合1～2 d后，在真皮發(fā)育信號的誘導(dǎo)下，去分化的上皮細胞中的β-連接蛋白、Lef-1和K17明顯增加。角膜上皮去分化形成的細胞能夠分化得到濾泡間上皮，但去分化的發(fā)生不單純是簡單的細胞結(jié)合;真皮中Noggin的表達對于角膜角蛋白細胞最初的分化并非是必須的，而對于毛發(fā)的形成以及K10陽性細胞的出現(xiàn)是必不可少的［11］。采用reversine誘導(dǎo)成肌細胞去分化發(fā)現(xiàn)，reversine可能阻斷非肌源性肌球蛋白重鏈Ⅱ和絲裂原活化蛋白激酶1，繼而改變細胞周期及組蛋白乙?；癄顟B(tài)，最終使細胞發(fā)生去分化改變［12］。最近在葉酸誘導(dǎo)的小鼠急性腎損傷模型的研究中發(fā)現(xiàn)，EGF受體活性對于腎小管細胞去分化和增生是必不可少的［13］。

4 細胞去分化研究面臨的問題

一方面，通過細胞的去分化可以獲得多種細胞類型，去分化得到的多潛能細胞，可以用來修復(fù)異?；蛘呤軗p害的組織。另一方面，細胞去分化的研究涉及各種細胞，但是尚未找到一種能夠穩(wěn)定高效去分化的細胞。誘導(dǎo)細胞去分化的方法根據(jù)細胞類型各不相同，缺乏統(tǒng)一可靠的誘導(dǎo)體系。由于細胞去分化的詳細機制尚未明確，通過去分化獲得的細胞的細胞特性也不確定，其基因類型、細胞表型以及分化能力等均需要深入探索。

通過反轉(zhuǎn)錄病毒將4個轉(zhuǎn)錄子(Oct4、Sox2、Klf4和c-Myc)轉(zhuǎn)染至小鼠皮膚成纖維細胞后，發(fā)現(xiàn)成熟細胞可重編程為胚胎干細胞樣細胞，稱為誘導(dǎo)多能干細胞(induced pluripotent stem cells，iPS)，它可以再分化成神經(jīng)細胞或肌細胞，但該技術(shù)費用高、轉(zhuǎn)化效率低且存在致瘤性等缺點，限制了其實用性［13］。而通過質(zhì)粒將基因?qū)肽殠а毎坏┻M入細胞，質(zhì)粒就會觸動細胞向原始狀態(tài)轉(zhuǎn)化，血細胞轉(zhuǎn)化為 iPS細胞的成功率高達50% ～60%［13］。采用化學(xué)分子誘導(dǎo)成熟細胞去分化為誘導(dǎo)多能干細胞具有一定優(yōu)勢。比如藥物可快速高效到達靶細胞;操作簡便、便于推廣，但目前尚未發(fā)現(xiàn)穩(wěn)定高效且作用確切的特定誘導(dǎo)化學(xué)分子。

將綠色熒光蛋白(green fluorescent protein，GFP)基因轉(zhuǎn)到一蠑螈能再生的細胞內(nèi)，對另一沒有GFP基因的蠑螈進行截肢術(shù)，隨后將帶有GFP基因蠑螈的細胞移植到另一沒有GFP基因的蠑螈斷肢上，通過熒光觀察蠑螈再生的過程發(fā)現(xiàn):皮膚細胞能夠再生為皮膚細胞、結(jié)締組織和肌腱，而軟骨細胞、肌肉細胞和施旺細胞各自再生形成原來的細胞類型［14］。上述實驗結(jié)果表明，細胞再生的過程并非成熟的細胞都發(fā)生去分化，變成干細胞樣細胞，再統(tǒng)一分化，細胞去分化所能達到的幼稚程度有待進一步研究，并且成體細胞去分化后的再生是否具有定向分化的特點有待確定。

5 細胞去分化用于細胞治療的前景與展望

衰老、疾病及意外等造成人體細胞的老化、壞死，去分化為我們獲得理想的移植細胞提供一種新的來源，為疾病治療帶來了一種新的策略?，F(xiàn)有的去分化研究已經(jīng)涉及各個細胞領(lǐng)域。在衰老修復(fù)方面，reversine能夠誘導(dǎo)骨祖細胞樣細胞的產(chǎn)生，可用于椎間盤的修復(fù)［10］。在病因研究方面，EGF可以誘導(dǎo)人類胰島細胞去分化，應(yīng)用于胰島細胞相關(guān)疾病研究［15］;正常的甲狀腺組織能夠在一個培養(yǎng)固定的培養(yǎng)體系中去分化形成多功能的祖細胞，該培養(yǎng)體系可以用來闡明甲狀腺疾病的機制［16］;非干細胞在一定炎性因素的刺激下可發(fā)生去分化而獲得腫瘤觸發(fā)作用，有利于對腫瘤發(fā)生機制的深入研究［17］。在疾病治療方面，皮膚纖維原細胞誘導(dǎo)為與人體運動神經(jīng)細胞功能相似的細胞，具備治療神經(jīng)損傷及退行性病變的可能性［18］。成人骨髓和外周循環(huán)血液中提取的血細胞通過質(zhì)粒轉(zhuǎn)導(dǎo)基因后可去分化成相對原始的干細胞，有望用于治療血液系統(tǒng)疾?。?9］。胰腺β細胞在病理情況下發(fā)生去分化與2型糖尿病關(guān)系密切，有望通過對去分化β細胞進行再分化來治療2型糖尿病［20］。

今后的去分化研究將兼顧哺乳動物細胞和非哺乳動物細胞，觀察在自然狀態(tài)下和人為干預(yù)后發(fā)生的去分化，從細胞層面、分子層面揭示去分化的機制，并通過組織層面、功能層面來檢驗去分化的作用。另外，單一的去分化作用有限，需要與轉(zhuǎn)分化、重編程等相結(jié)合，來更好地實現(xiàn)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究向臨床醫(yī)學(xué)應(yīng)用轉(zhuǎn)化［21］。

通過去分化途徑獲得理想的移植細胞后經(jīng)過再分化和轉(zhuǎn)分化等處理，并最終用于細胞組織損傷的再生修復(fù)，將會給創(chuàng)傷醫(yī)學(xué)、腫瘤醫(yī)學(xué)、康復(fù)醫(yī)學(xué)、組織工程學(xué)等帶來深遠影響。

［1］ Harrisingh MC，Perez-Nadales E，Parkinson DB，et al．The Ras/Raf/ERK signalling pathway drives Schwann cell dedifferentiation［J］．EMBO J，2004，23:3061 － 3071．

［2］Li H，F(xiàn)u X，Zhang L，et al．In vivo dedifferentiation of human epidermal cells［J］．Cell Biol Int，2007，31:1436 －1441．

［3］Porrello ER，Mahmoud AI，Simpson E，et al．Transient regenerative potential of the neonatalmouse heart［J］．Science，2011，331:1078－1080．

［4］Cobaleda C，Jochum W，Busslinger M．Conversion ofmature B cells into T cells by dedifferentiation to uncommitted progenitors［J］．Nature，2007，449:473 －477．

［5］Pearton DJ，Yang Y，Dhouailly D．Transdifferentiation of corneal epithelium into epidermis occurs bymeans of amultistep process triggered by dermal developmental signals［J］．Proc Natl Acad Sci U SA，2005，102:3714－3719．

［6］Kuo CH，Lu YC，Tseng YS，et al．Reversine induces cell cycle arrest，polyploidy，and apoptosis in human breast cancer cells［J］．Breast Cancer，2012．doi:10．1007/s12282-012-0400-z．

［7］Hua SC，Chang TC，Chen HR，et al．Reversine，a 2，6-disubstituted purine，as an anti-cancer agent in differentiated and undifferentiated thyroid cancer cells［J］．Pharm Res，2012，29:1990 －2005．

［8］Piccoli M，Palazzolo G，Conforti E，et al．The synthetic purine reversine selectively induces cell death of cancer cells［J］．JCell Biochem，2012，113:3207 －3217．

［9］Conforti E，Arrigoni E，PiccoliM，etal．Reversine increases multipotent human mesenchymal cells differentiation potential［J］．J Biol Regul Homeost Agents，2011，25:S25－S33．

［10］Saraiya M，Nasser R，Zeng Y，et al．Reversine enhances generation of progenitor-like cells by dedifferentiation of annulus fibrosus cells［J］．Tissue Eng Part A，2010，16:1443－1455．

［11］Zhang Y，Li TS，Lee ST，etal．Dedifferentiation and proliferation of mammalian cardiomyocytes［J］．PLoS One，2010，5:e12559．

［12］Chen S，Zhang Q，Wu X，et al．Dedifferentiation of lineage-committed cells by a smallmolecule［J］．JAm Chem Soc，2004，126:410－411．

［13］He S，Liu N，Bayliss G，et al．EGFR activity is required for renal tubular cell dedifferentiation and proliferation in a murinemodel of folic acid-induced acute kidney injury［J］．Am JPhysiol Renal Physiol，2013，304:F356 － F366．

［14］Kragl M，Knapp D，Nacu E，et al．Cells keep amemory of their tissue origin during axolotl limb regeneration［J］．Nature，2009，460:60－65．

［15］Hanley SC，Assouline-Thomas B，Makhlin J，et al．Epidermal growth factor induces adult human islet cell dedifferentiation［J］．JEndocrinol，2011，211:231 －239．

［16］Suzuki K，Mitsutake N，Saenko V，et al．Dedifferentiation of human primary thyrocytes intomultilineage progenitor cellswithout gene introduction［J］．PLoSOne，2011，6:e19354．

［17］Schwitalla S，F(xiàn)ingerle AA，Cammareri P，et al．Intestinal tumorigenesis initiated by dedifferentiation and acquisition of stem-cell-like properties［J］． Cell，2013，152:25－38．

［18］Karumbayaram S，Novitch BG，Patterson M，et al．Directed differentiation of human-induced pluripotent stem cells generates active motor neurons［J］．Stem Cells，2009，27:806－811．

［19］Park TS，Huo JS，Peters A，etal．Growth factor-activated stem cell circuits and stromal signals cooperatively accelerate non-integrated iPSC reprogramming of human myeloid progenitors［J］．PLoSOne，2012，7:e42838．

［20］Dor Y，Glaser B．Beta-cell dedifferentiation and type 2 diabetes［J］．N Engl JMed，2013，368:572 －573．

［21］Eguizabal C，Montserrat N，Veiga A，et al．Dedifferentiation，transdifferentiation，and reprogramming:future directions in regenerativemedicine［J］．Semin Reprod Med，2013，31:82－94．