劉 磊，王志勇

（信陽農(nóng)林學院園藝系，河南 信陽 464000）

牡丹（Paeonia suffruticosa Andr.）為毛茛科芍藥屬落葉小灌木，原產(chǎn)中國，它雍容華貴，嬌艷嫵媚，花形大而美，被譽為“花中之王”。牡丹傳統(tǒng)的繁殖方法多采用播種、嫁接和分株方式，不僅成苗周期長，而且出苗量少，質量參差不齊。組織培養(yǎng)在牡丹的快速繁殖方面具有無可比擬的優(yōu)勢［1～2］，通過組織培養(yǎng)技術解決牡丹常規(guī)繁殖中存在的不足，是牡丹商品化、產(chǎn)業(yè)化發(fā)展的必然趨勢，也是加快牡丹育種和繁殖步伐的重要途徑。

1 研究進展

1.1 外植體類型

1.1.1 胚 胚培養(yǎng)技術是指將植物的種胚接種在無菌的條件下培養(yǎng)，使之生長發(fā)育成幼苗的技術，既可以用來克服胚敗育和發(fā)育不良，也可以縮短種子休眠期，促進萌發(fā)，提高萌發(fā)率。在自然界中，牡丹種子的休眠期長達數(shù)年，采用胚培養(yǎng)時可縮短至28～42 d。

培養(yǎng)基對離體胚的生長有著重要影響。周仁超等以‘紫斑牡丹’為材料進行胚培養(yǎng)，結果種胚在1/2MS+BA 1.0 mg/L+IAA 1.0 mg/L的培養(yǎng)基上可較快生長并分化出不定芽；不定芽在1/2MS+BA 1.0 mg/L+IAA 0.2 mg/L的培養(yǎng)基上可快速繁殖，平均增殖倍數(shù)達6.5［3］。楊紅超在牡丹種胚培養(yǎng)時發(fā)現(xiàn)，在培養(yǎng)基中添加胚乳的水提液對胚根和子葉生長有一定的抑制作用［4］。安佰義以胚為材料考察了不同培養(yǎng)基對叢生芽誘導的影響，結果WPM培養(yǎng)基叢生芽誘導率最高，為36.66%，較MS培養(yǎng)基的叢生芽誘導率提高6.66百分點；B5培養(yǎng)基叢生芽誘導率最低，為20.00%；MS培養(yǎng)基誘導出芽的總數(shù)最多，芽高、葉色正常，但平均叢生芽數(shù)較少；WPM培養(yǎng)基誘導出芽的總數(shù)少，芽矮，但平均叢生芽數(shù)較多；B5培養(yǎng)基誘導出的芽不僅總數(shù)、平均叢生芽數(shù)少，而且生長異常。另外，胚的不同發(fā)育時期對其培養(yǎng)結果有顯著的影響［5］。Brukhin V B和Batygina T B研究發(fā)現(xiàn)，只有選擇球狀胚階段后的胚狀體培養(yǎng)，才能增加繁殖能力，取自成熟種子的胚，在無激素MS和1/2MS培養(yǎng)基上培養(yǎng)均能形成正常小植株；而早期魚雷形胚和心形胚在培養(yǎng)后只有25%能形成小植株；在愈傷組織誘導培養(yǎng)基中培養(yǎng)21 d后，心形胚、魚雷形胚、成熟種胚的愈傷誘導率分別為60%、80%、100%［6］。

1.1.2 花藥和花粉 牡丹花藥、花粉的培養(yǎng)條件為花藥處于有絲分裂的第一階段，基本培養(yǎng)基中不加任何生長調節(jié)物質，培養(yǎng)溫度為25～30℃，從花藥中誘導出胚狀體需120～160 d，而且胚狀體的生長速度很慢［7］。Shoyama Y等成功地進行了P.suff ruticosa和P.lutea Superba兩個品種的花藥離體培養(yǎng)，所用培養(yǎng)基是LS+3%蔗糖+500 mg/LCH+1mg/Lkin+1 mg/L IAA，培養(yǎng)21d后可看到多細胞和多核花粉粒；培養(yǎng)42 d后，2%～3%的花粉粒形成了多細胞胚狀體［8］。Roberts和Sunderland用不加碳和瓊脂的MS培養(yǎng)基進行液體培養(yǎng)，接種花藥密度為1～2個/mL獲得成功［9］。

1.1.3 鱗芽 鱗芽培養(yǎng)被認為是牡丹組織培養(yǎng)中最有應用價值的途徑之一，關于鱗芽組織培養(yǎng)的報道很多，但是鱗芽的整個再生體系尚未建立，關鍵原因在于鱗芽生根十分困難。張桂花等利用牡丹腋芽和頂芽進行組織培養(yǎng)，獲得了沒有生根的試管苗植株［10］。徐桂娟以‘鳳丹’、‘海云紫’等品種為材料，以改良MS培養(yǎng)基作為基本培養(yǎng)基也成功地得到了再生植株［11］。2003年，李艷敏用‘青龍臥墨池’、‘銀粉金鱗’、‘紫瑤臺’3個牡丹品種的鱗芽進行組織培養(yǎng)，獲得再生植株并移栽成功［12］。鱗芽的取材部位不同，誘導的難易程度也不同，在所有鱗芽中，以土芽的分化表現(xiàn)最好，分化率可達94%；腋芽次之，為71%；花芽最差，僅為16%［13］。陳笑蕾在誘導‘洛陽紅’、‘胡紅’、‘肉芙蓉’、‘魯荷紅’、‘烏龍捧盛’、‘朱砂壘’6個牡丹品種增殖時，發(fā)現(xiàn)不同品種間的增殖率存在顯著差異，從大到小依次為‘烏龍捧盛’、‘魯荷紅’、‘胡紅’、‘洛陽紅’、‘朱砂壘’、‘肉芙蓉’［14］。

1.2 培養(yǎng)條件和培養(yǎng)基

1.2.1 培養(yǎng)條件 在牡丹組織培養(yǎng)過程中，溫度、光照、濕度和pH等環(huán)境因子是組織培養(yǎng)中重要的影響因素。研究認為，牡丹組織培養(yǎng)的最佳溫度為（25±1）℃，光照強度為1 500～2 000 Lx，光照時數(shù)為10～12 h/d，pH為5.8～6.0［5，15］。此外，在培養(yǎng)過程中應注意對晝夜溫差的控制，晝夜無溫差將導致干物質積累量、葉綠素含量減少、酶功能失調、蛋白質含量降低，從而導致玻璃化苗產(chǎn)生。通過變溫處理，加大晝夜溫差會使玻璃化現(xiàn)象消失［16］。在濕度控制方面，一般認為采用通透性較好的棉塞等封口材料有利于培養(yǎng)材料光合干物質積累，降低濕度，減少玻璃化苗的發(fā)生［17］。張桂花通過對牡丹品種‘金星雪浪’的研究發(fā)現(xiàn)，牡丹試管苗在20～22℃條件下葉片微綠，生長緩慢，個別出現(xiàn)玻璃化苗；在24～26℃條件下，葉片濃綠，苗健壯且生長速度較快；大于26℃，葉片黃化，苗弱，生長速度較慢甚至停止生長。光照時數(shù)低于8 h/d，試管苗表現(xiàn)正常，生長緩慢；光照時數(shù)為10 h/d時，試管苗長勢壯、生長快、芽分化多；光照時數(shù)高于12 h/d時，試管苗生長勢弱，個別出現(xiàn)玻璃化苗。光照強度為2 000 Lx時，試管苗生長表現(xiàn)最佳［10］。

1.2.2 培養(yǎng)基 在牡丹組織培養(yǎng)中，供試品種及其外植體類型不同，選用基本培養(yǎng)基則不同。在已報道的牡丹組織培養(yǎng)研究中，大多數(shù)學者將MS或1/2MS作為基本培養(yǎng)基［18～21］，但也有一些用WPM作基本培養(yǎng)基［5］。安佰義用經(jīng)過40 d低溫層積處理后的種胚作為外植體，分別接種于WPM、MS、B5培養(yǎng)基，培養(yǎng)50 d后，不同培養(yǎng)基上叢生芽誘導率存在一定差異。WPM培養(yǎng)基中叢生芽誘導率最高，為36.66%，比MS培養(yǎng)基高6.66百分點；B5培養(yǎng)基最低，為20.00%，比MS培養(yǎng)基低10.00百分點［5］。何桂梅以自然授粉約90 d的‘紫斑牡丹’和‘楊山牡丹’近成熟胚作為外植體，接種于MS、1/2MS、1/2MS+Vc100 mg/L培養(yǎng)基中，發(fā)現(xiàn)3種培養(yǎng)基上種胚的生長表現(xiàn)相似，均呈增大的趨勢，形成蓮座狀苗。MS培養(yǎng)基中少數(shù)種胚真葉淺綠色，1/2MS培養(yǎng)基添加Vc 100 mg/L后反而降低了種胚的抽真葉率及生根、成苗率，綜合考慮種胚的各種生長指標，認為1/2MS培養(yǎng)基可作為牡丹近成熟胚的基本培養(yǎng)基［22］。

1.3 生根培養(yǎng)

組培苗的生根過程是一個復雜的生理生化過程，一般影響組培苗生根的因素有植物材料、培養(yǎng)基類型［23］、植物生長調節(jié)劑、糖和其它因子［24］。在牡丹無根苗生根培養(yǎng)階段常使用的生長調節(jié)劑為IBA，根據(jù)IBA的使用方式不同，其生根方法分為一步生根法（在含有低濃度IBA培養(yǎng)基上連續(xù)培養(yǎng)）、速蘸法（將微插條基部在一定濃度IBA溶液中浸泡一定時間，然后將其轉接到含有活性炭而不含植物生長調節(jié)劑的培養(yǎng)基中［1］）、兩步生根法（先在根誘導培養(yǎng)基上進行短期誘導培養(yǎng)，然后轉移至不含植物生長調節(jié)劑的培養(yǎng)基中讓根系發(fā)育），先采用根誘導再進行根形成的兩步連續(xù)生根法培養(yǎng)是最有效的生根方法［25］。試管苗瓶外生根技術是近幾年研究成功的一項先進生根技術，該技術的關鍵是將試管苗生根和馴化結合起來，從而省去用來提供營養(yǎng)物質和支撐作用的培養(yǎng)基，簡化組培程序，降低生產(chǎn)成本，提高繁殖系數(shù)，進而解決了組培工廠化育苗生根難的問題［26～27］。

1.4 組培苗的移栽馴化

牡丹移栽成活率低是限制組培快繁技術應用于生產(chǎn)及育種研究的關鍵因子之一。雖然幼苗生根質量高及生長健壯為移栽馴化成活奠定了良好的物質基礎，但適宜的煉苗移栽方法、上盆時間、栽培基質、環(huán)境及移栽后的溫濕調控與管理手段也是影響幼苗成活的重要技術環(huán)節(jié)。李玉龍在牡丹試管苗誘導出根1條，長到3～4 cm時進行煉苗，將瓶塞打開放在陽光充足處通風透光煉苗3～4 d后移栽，效果較好［28］?？紫樯J為以腐殖土做基質移栽幼苗比蛭石作基質移栽幼苗成活率高，且移栽苗生長健壯［29］。李志軍等在保持20℃左右的溫度條件下，通過蛭石+草炭土（1∶1）和泥炭+珍珠巖（1∶1）兩種基質對生根苗移栽影響的研究表明，兩者對移栽成活率的影響差異不顯著，但對幼苗后期生長速率有一定的影響，移栽30 d后，幼苗平均高分別為18.4、11.5 cm，因此認為蛭石+草炭土（1∶1）基質更適宜幼苗生長［30］。

2 存在的問題

2.1 污染

組培苗培養(yǎng)過程中造成污染的因素很多，如工作環(huán)境、培養(yǎng)基及器皿消毒不徹底、外植體帶菌、工作人員操作不規(guī)范等。造成污染的病原主要分為細菌和真菌兩大類，細菌污染的特點是菌斑呈黏液狀，且在接種1～3 d后即可被發(fā)現(xiàn)；真菌污染的特點是污染部分長有不同顏色的霉菌，在接種3～15 d后才出現(xiàn)癥狀［31］。常用的消毒劑有升汞、次氯酸鈉、雙氧水等［32］。

2.2 褐化

牡丹為木本植物，次生代謝旺盛，植物體內(nèi)含有較多的酚類化合物，組織培養(yǎng)過程中外植體極易褐化，這些褐色物質在培養(yǎng)基中不斷擴散，抑制其它酶的活性，毒害培養(yǎng)材料，嚴重影響組培苗的成活率、擴繁率。在牡丹組培中對褐化的控制不容忽視，最常用的方法是在培養(yǎng)基中添加防褐劑。好的防褐劑既能有效控制褐化現(xiàn)象的發(fā)生，又能促進繁殖材料的生長和增殖［33］。

2.3 玻璃化

所謂玻璃化，是指在離體培養(yǎng)中，組織莖芽逐漸變?yōu)榘胪该鳡罨沃仓?，這種植株難以移栽成活，嚴重制約著繁殖效率。在牡丹離體培養(yǎng)中，由于生長調節(jié)物質、光照、溫度的不適宜，經(jīng)?？梢杂^察到玻璃化現(xiàn)象。

2.4 組培苗生根難度大

主要表現(xiàn)在生根率不高，一些品種難以獲得生根苗；生根質量差，部分不定根由愈傷組織產(chǎn)生，使根與莖中間形成離層，缺乏疏導組織聯(lián)系，且不定根易脫落，影響移栽成活［34］。因此，誘導帶有高質量根系的試管苗是凾待解決的問題。

2.5 移栽成活率低

一是組培苗在移栽過程中容易斷根，二是組培苗移栽階段感病嚴重而加大死亡率。因此要不斷提高不定根質量和組培苗適應環(huán)境的能力，提高移栽成活率，才能為實現(xiàn)牡丹商品化、產(chǎn)業(yè)化發(fā)展奠定基礎。

3 今后的研究方向

隨著組織培養(yǎng)技術的迅猛發(fā)展，離體快繁技術在繼續(xù)發(fā)揮傳統(tǒng)優(yōu)勢。針對牡丹組培生產(chǎn)中存在的問題，應不斷加強牡丹品種組織培養(yǎng)的技術體系研究，研制出針對不同品種的高效、實用、標準組培快繁體系。同時利用現(xiàn)代生物技術進一步拓寬研究領域，如利用轉基因技術在分子水平上改良牡丹的特定性狀，以提高其抗逆性［35］，擴大園林綠化的應用范圍；改變花色［36］，延長盛花期［37～38］，篩選優(yōu)良切花品種；矮化植株和縮短根長，實現(xiàn)牡丹由田間栽培到室內(nèi)培養(yǎng)的轉變。在牡丹藥用品種研究方面，通過RNAi技術，調控其代謝途徑，提高牡丹根皮中有效成分的含量。還應采用發(fā)根農(nóng)桿菌誘導牡丹發(fā)狀根，提高其生根率。

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