陳向武，趙穎熙

(浙江大學(xué) 醫(yī)學(xué)院 附屬義烏醫(yī)院 眼科， 浙江 義烏 322000)

短篇綜述

基因治療與眼部纖維化疾病

陳向武，趙穎熙*

(浙江大學(xué) 醫(yī)學(xué)院 附屬義烏醫(yī)院 眼科， 浙江 義烏 322000)

眼球是最適合進(jìn)行基因治療的器官之一。隨著轉(zhuǎn)化生長因子-β信號(hào)通路的認(rèn)識(shí)及miRNA、RNAi等技術(shù)的進(jìn)步，使得基因治療在眼部纖維性疾病的應(yīng)用中更具潛力。目前多種眼部纖維化疾病的基因治療研究進(jìn)展迅速，但仍面臨較多亟待解決的問題。

基因治療;眼部纖維化疾病;轉(zhuǎn)化生長因子-β;微小RNA;RNA干擾

基因治療簡而言之就是用基因來治療各種疾病。即通過載體(如病毒或粒子)將遺傳物質(zhì)引入人體細(xì)胞使其發(fā)揮改建、修飾、補(bǔ)充、封閉、對(duì)抗及殺傷等生物學(xué)效應(yīng)以治療疾病的技術(shù)方法，在許多疾病的預(yù)防和治療中已顯示出良好的發(fā)展前景[1]。眼部纖維化疾病如角膜的瘢痕化、原發(fā)性開角型青光眼與濾過性術(shù)后結(jié)膜的瘢痕化、后發(fā)性白內(nèi)障及增殖性玻璃體視網(wǎng)膜病變等由于病因復(fù)雜，常規(guī)的藥物、手術(shù)或激光等治療方法效果往往不令人滿意。隨著近年來眾多纖維化相關(guān)基因的發(fā)現(xiàn)，基因治療在眼部纖維化疾病的研究中取得了長足的進(jìn)展。本文就基因治療在眼部應(yīng)用的優(yōu)勢(shì)、眼部纖維化疾病基因治療的靶點(diǎn)選擇及基因治療在纖維化眼病中的研究進(jìn)展做一綜述，從而為纖維化眼病的防治提供新的思路。

1 眼部基因治療的優(yōu)勢(shì)

眼球因其獨(dú)特的解剖及生物學(xué)特性，而成為最適合進(jìn)行基因治療的器官[2]。首先，眼球是由多個(gè)小的分隔獨(dú)立的腔室(如前房、玻璃體腔及視網(wǎng)膜下腔等)構(gòu)成。這就為病毒載體選擇性感染不同眼部結(jié)構(gòu)提供了可能；另外得益于該解剖結(jié)構(gòu)，眼內(nèi)只要注入少量的病毒溶液，就可在治療部位長時(shí)間維持高濃度的病毒載體，而全身發(fā)生毒性反應(yīng)及病毒擴(kuò)散的風(fēng)險(xiǎn)微乎其微。第二，眼內(nèi)的絕大多數(shù)細(xì)胞不會(huì)發(fā)生有絲分裂 (極少部分細(xì)胞除外如神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞)[3]。這既降低了基因治療過程中眼內(nèi)細(xì)胞發(fā)生惡變的風(fēng)險(xiǎn)，又同時(shí)保證了新轉(zhuǎn)入的基因在眼內(nèi)的持續(xù)表達(dá)，而不受細(xì)胞分裂的影響。第三，眼球因其光學(xué)通透性而成為體內(nèi)唯一通過非創(chuàng)技術(shù)就可直接觀察到血管、神經(jīng)及其他內(nèi)部結(jié)構(gòu)的器官。再結(jié)合眼底照相、眼底熒光造影及光學(xué)相干斷層掃描等檢查手段，可對(duì)基因治療的過程與結(jié)果進(jìn)行有效地觀察和評(píng)估。第四，眼球由于血-眼屏障的存在而具有免疫赦免的特性，即眼前房、玻璃體腔、視網(wǎng)膜下腔和角膜基質(zhì)層對(duì)外來抗原的相對(duì)無反應(yīng)狀態(tài)[4]，這使得眼球針對(duì)基因產(chǎn)物和載體抗原的免疫應(yīng)答反應(yīng)明顯減輕，從而更有利于基因治療的進(jìn)行。第五，目前許多關(guān)于眼部疾病的動(dòng)物模型已經(jīng)制作成功[5]，這為基因治療的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究及臨床前治療效果的評(píng)估提供了可能。最后，未經(jīng)處理的對(duì)側(cè)眼在基因治療的過程中具有重要的對(duì)照價(jià)值。

2 眼纖維化疾病基因治療的靶點(diǎn)選擇

2.1 轉(zhuǎn)化生長因子-β及信號(hào)傳導(dǎo)通路

轉(zhuǎn)化生長因子-β(transforming growth factor beta，TGF-β)是已知的眾多生長因子中與瘢痕形成關(guān)系最為密切的一種生長因子[1, 6- 9]。其對(duì)炎性細(xì)胞和成纖維細(xì)胞具有很強(qiáng)的趨化作用，可刺激成纖維細(xì)胞產(chǎn)生膠原，并促進(jìn)間充質(zhì)細(xì)胞分泌各種細(xì)胞外基質(zhì)。因此任何干擾TGF-β的表達(dá)及其信號(hào)傳導(dǎo)通路的因素均可能抑制器官纖維化的發(fā)生發(fā)展。

TGF-β的信號(hào)傳導(dǎo)通路有兩條：即Smad信號(hào)通路和非Smad信號(hào)通路[6]。所謂Smad蛋白，即TGF-β信號(hào)從細(xì)胞表面受體傳導(dǎo)至細(xì)胞核的過程中起到關(guān)鍵性作用的一類信號(hào)傳導(dǎo)因子。根據(jù)其結(jié)構(gòu)和功能分成3類：R-Smads、Co-Smads及I-Smads。R-Smad亞族包括Smad 1、2、3、5和8。Co-Smad在哺乳類動(dòng)物中目前只發(fā)現(xiàn)一種，即Smad 4。Ⅰ-Smad亞族包括Smad6和7。目前已基本清楚TGF-β激活Smads經(jīng)典信號(hào)傳導(dǎo)通路過程：首先TGF-β活化后與Ⅱ型TGF-β受體結(jié)合形成復(fù)合物，進(jìn)而使Ⅰ型TGF-β受體活化具備激酶活性，活化的Ⅰ型TGF-β受體再磷酸化下游Smad2和Smad3的氨基殘基，使Smad2、Smad3活化并同Smad4形成三聚體，然后易位至細(xì)胞核，從而調(diào)節(jié)靶基因的轉(zhuǎn)錄應(yīng)答。需要注意的是， Smad 7在TGF-β的刺激下會(huì)與R-Smad競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合TGF-β的Ⅰ型受體。由于Smad 7穩(wěn)定性強(qiáng)于R-Smad，因此Smad7對(duì)TGF-β/Smad信號(hào)通路具有抑制作用。

此外，TGF-β還可通過激活如絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)、磷脂酰肌醇3激酶(phosphoinositide 3-kinase，P13K)、Rho/Roch等非Smad信號(hào)通路而發(fā)揮信號(hào)傳導(dǎo)作用[7- 9]。這些途徑不但受TGF-β調(diào)節(jié)，還可受到其他因子的調(diào)控[10]。

2.2微RNA(microRNA，miRNA)與RNA干擾(RNAinterference,RNAi)

近年來隨著microRNA與RNAi技術(shù)的發(fā)展，為纖維化疾病的基因治療靶點(diǎn)選擇提供了新的思路與手段。

所謂microRNA是一種21- 25個(gè)核苷酸的非編碼單鏈小分子RNA，通過特異性結(jié)合目的RNA的3,端非編碼區(qū)，在轉(zhuǎn)錄后水平和翻譯水平調(diào)控靶基因的表達(dá)，而發(fā)揮在細(xì)胞內(nèi)干擾RNA的作用。microRNA通過與目的mRNA的互補(bǔ)結(jié)合，直接或間接調(diào)控著90%以上人類基因的表達(dá)。目前發(fā)現(xiàn)特定microRNA能夠干擾TGF-β的表達(dá)及其信號(hào)傳導(dǎo)通路而發(fā)揮抗纖維化作用[11]。

RNAi是指通過正、反義RNA片段形成雙鏈RNA,從而特異性地抑制靶基因的轉(zhuǎn)錄后表達(dá)的現(xiàn)象。而干擾性小RNA(small interfering RNA, siRNA) 是RNA 干擾作用賴以發(fā)生的重要中間效應(yīng)分子。已經(jīng)有研究人員通過RNAi干擾TGF-β信號(hào)傳導(dǎo)通路來治療組織器官的纖維化，得到滿意的抗纖維化效果[12]。但由于RNAi技術(shù)的復(fù)雜性及抑制效應(yīng)的不確定性，還需要進(jìn)一步的研究。

3 纖維化眼病中基因治療的研究進(jìn)展

3.1 角膜的瘢痕化

角膜中TGF-β升高會(huì)導(dǎo)致多種細(xì)胞因子合成，使角膜基質(zhì)細(xì)胞活化、增殖并合成大量的細(xì)胞外基質(zhì)，導(dǎo)致大量排列混亂的膠原沉積，從而形成角膜基質(zhì)瘢痕[13]。因此抑制TGF-β信號(hào)通路是目前抗角膜纖維化研究的熱點(diǎn)。

有研究將攜帶Smad7 cDNA的腺病毒導(dǎo)入角膜堿燒傷小鼠模型的角膜組織中，發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)組成肌纖維細(xì)胞、巨噬細(xì)胞及生長因子的含量均較對(duì)照組減少，并且角膜的瘢痕與新生血管的生成亦較對(duì)照組減輕[14]。這說明干擾TGF-β信號(hào)通路抑制角膜纖維化是可行的。并且通過角膜燒傷模型還發(fā)現(xiàn)增加Smad7比抑制Smad3的抗纖維化作用更加明顯[12, 14]。那么TGF-β信號(hào)通路中哪個(gè)位點(diǎn)是抗纖維化效果最好的靶點(diǎn)？目前尚不明確，還需要進(jìn)一步的研究。

另外近年在角膜燒傷的動(dòng)物模型中，發(fā)現(xiàn)導(dǎo)入microRNA-133b基因的角膜組織中TGF-β表達(dá)量明顯下降，角膜纖維化也明顯抑制[15]。由于microRNA具有無毒及定點(diǎn)調(diào)節(jié)靶基因表達(dá)等優(yōu)勢(shì)，為未來基因治療角膜疤痕的提供更大的潛能。

3.2原發(fā)性開角型青光眼及濾過性術(shù)后結(jié)膜的瘢痕化

研究表明大部分原發(fā)性開角型青光眼患者眼內(nèi)小梁網(wǎng)鄰管區(qū)的細(xì)胞存在纖維增生及玻璃樣變等病理改變，這是導(dǎo)致眼壓升高和視神經(jīng)損害的主要原因[16]。這其中TGBβ扮演了重要的角色。有研究將攜帶Smad7 siRNA的載體導(dǎo)入體外培養(yǎng)的人小梁網(wǎng)細(xì)胞中使Smad7 mRNA沉默，發(fā)現(xiàn)TGBβ的作用加強(qiáng)，細(xì)胞外基質(zhì)的合成和細(xì)胞轉(zhuǎn)化均提高[17]。提示Smad7蛋白具有抑制原發(fā)性開角型青光眼的作用。

另外在青光眼濾過性手術(shù)中，Tenon’s囊纖維化是導(dǎo)致手術(shù)失敗的主要原因[18]。已知microRNA-29b的靶基因表達(dá)Ⅰ型膠原α鏈，Ⅲ型膠原蛋白α1鏈，Ⅳ型膠原蛋白α1鏈，Ⅴ型膠原蛋白α1鏈和α2鏈等一系列膠原蛋白。那么microRNA-29b是否對(duì)Tenon’s囊的纖維化過程具有調(diào)節(jié)作用？有實(shí)驗(yàn)對(duì)此進(jìn)行驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)人眼球結(jié)膜細(xì)胞中過量的microR-29b表達(dá)能夠有效抑制Tenon’s囊的纖維化[19]，但該實(shí)驗(yàn)細(xì)胞采用體外培養(yǎng)與術(shù)后結(jié)膜細(xì)胞生長環(huán)境不同，還無法確定在人體中microR-29b是否具有同樣的抗纖維化效果。

3.3 后發(fā)性白內(nèi)障

白內(nèi)障術(shù)后囊袋內(nèi)殘留或新生的上皮細(xì)胞增殖所導(dǎo)致的纖維增生是后發(fā)性白內(nèi)障的主要原因。TGBβ/smad信號(hào)通路亦在其中起著重要作用。其中Smad3是TGF-β信號(hào)通路的一個(gè)關(guān)鍵位點(diǎn)，通過阻斷TGF-β/ Smad3信號(hào)傳導(dǎo)通路可以有效抑制白內(nèi)障術(shù)后后囊膜的混濁[20]。很多的實(shí)驗(yàn)結(jié)果支持上述的觀點(diǎn)。如將晶狀體前囊膜外傷模型小鼠的Smad3基因敲除，發(fā)現(xiàn)該小鼠受損晶體的纖維化受到了抑制[21]。而將攜帶Smad7的腺病毒導(dǎo)入上述模型小鼠眼內(nèi)來競(jìng)爭(zhēng)性對(duì)抗Smad3的功能，發(fā)現(xiàn)小鼠晶狀體上皮細(xì)胞內(nèi)TGF-β、α-平滑肌纖維、蛋白多糖及Ⅵ型膠原蛋白均明顯減少，晶狀體前囊膜創(chuàng)口處纖維化明顯被抑制[22]。

3.4增殖性玻璃體視網(wǎng)膜病變(proliferativevitreoretinopathy，PVR)

PVR是指玻璃體后部和視網(wǎng)膜表面廣泛的纖維增殖膜收縮、牽拉并最終引起視網(wǎng)膜脫離的疾病。在PVR過程中有多種細(xì)胞參與，但視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞(retinal pigment epithelium，RPE)扮演著最重要的角色。但該細(xì)胞通過何種機(jī)制參與PVR的形成目前尚不清楚。有研究將攜帶Smad7基因的腺病毒導(dǎo)入PVR模型小鼠的RPE細(xì)胞內(nèi)干擾其TGF-β信號(hào)通路，發(fā)現(xiàn)小鼠RPE細(xì)胞中Ⅰ型膠原明顯下降伴眼內(nèi)PVR明顯抑制[23]。提示RPE細(xì)胞可通過TGF-β信號(hào)通路參與PVR的形成。最近將以肝細(xì)胞因子受體為靶向的siRNA與microRNA-34a分別導(dǎo)入體外培養(yǎng)的人RPE細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)RPE細(xì)胞內(nèi)與遷移、增殖相關(guān)的細(xì)胞因子如CDK2、CDK4、CDK及E2F1等均表達(dá)下降，證明該microRNA及siRNA對(duì)RPE細(xì)胞的遷移增殖功能具有抑制作用[24]，提示兩者也參與調(diào)節(jié)PVR的形成過程，這為PVR的防治提供了新的思路。

4 總結(jié)

雖然基因治療在眼部纖維化疾病中的研究發(fā)展迅速，但仍面臨許多亟待解決的問題：1)目前眼部纖維化疾病基因治療的研究多為離體細(xì)胞實(shí)驗(yàn)或動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，若進(jìn)一步明確其安全性和時(shí)效性等問題，則基因治療在臨床上的應(yīng)用將獲得突破性進(jìn)展。2)需進(jìn)一步闡明纖維化疾病的分子生物學(xué)發(fā)病機(jī)制，為基因治療提供基礎(chǔ)。3)需構(gòu)建更多可供選擇的目的基因，促進(jìn)基因治療發(fā)展。4)需加大對(duì)外源性基因?qū)塍w內(nèi)后的可調(diào)控性研究，以保障基因治療取得理想效果。雖然基因治療在眼部纖維性疾病中的臨床應(yīng)用還只處于初級(jí)階段，但隨著基因工程技術(shù)的發(fā)展，將加快眼部纖維化疾病基因治療的臨床應(yīng)用，并將開創(chuàng)基因治療眼部纖維化疾病的新時(shí)代。

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Gene therapy and ocular fibrotic disorders

CHEN Xiang-wu, ZHAO Ying-xi*

(Dept. of Ophthalmology, Yiwu Affiliated Hospital of Zhejiang University School of Medicine, Yiwu 322000, China)

Eye is one of the best target organs for gene therapy. With the understanding of TGF-β signaling pathway and progressing in the technology of miRNA and RNAi，Gene therapy is more promising in curing ocular fibrotic disorders. Although the gene therapy research in kinds of eye fibrotic diseases is developing rapidly, many problems need to be solved.

gene therapy; ocular fibrotic disorders; transforming growth factor beta; microRNA; RNA interference

2013- 12- 26

2014- 03- 24

*通信作者(correspondingauthor)： zhaoyixi@163.com

1001-6325(2014)09-1289-04

R 77

A