(廣東省廣州市質(zhì)量監(jiān)督檢測研究院)
維生素是維持人體生長發(fā)育及新陳代謝而必須從食物中獲得的微量有機(jī)物質(zhì)之一。許多食品會添加維生素,但強(qiáng)化維生素應(yīng)符合適宜人群的攝入量,應(yīng)能在特定條件下保持質(zhì)量的穩(wěn)定。加大對維生素檢測方法及技術(shù)的研究,對科學(xué)控制維生素在食品中的添加量具有重要的意義。
維生素B12(VB12),又稱鈷胺素(Cobalamin),是非常重要的水溶性維生素之一,主要用于保健食品、谷物、飲料、乳品和嬰兒食品的營養(yǎng)強(qiáng)化。由于食品成分復(fù)雜、存在多種干擾因素,而且其VB12的含量十分微量,因此化學(xué)分析法的應(yīng)用受到限制。目前,微生物法仍為國際官方機(jī)構(gòu)測定VB12的的首選認(rèn)可方法。
雖然微生物法在維生素檢測過程中有較高的靈敏度和精確度[1],但是仍然存在步驟繁瑣、操作耗時、檢測周期長、易受外部因素干擾等諸多問題[2]。本文建立了微生物法測定食品中VB12含量的快速方法,與傳統(tǒng)微生物檢測法相比具有檢測周期短、操作步驟簡便、結(jié)果準(zhǔn)確性與重現(xiàn)性高的優(yōu)勢。
試驗菌株為萊士曼氏乳酸桿菌(Lactobacillus leichmanniii),ATCC 7830,來源為美國典型培養(yǎng)物保藏中心。
培養(yǎng)基為:乳酸桿菌肉湯培養(yǎng)基,乳酸桿菌瓊脂培養(yǎng)基,VB12測定培養(yǎng)基;均來自BD(碧迪醫(yī)療器械(上海)有限公司上海辦事處)。
標(biāo)準(zhǔn)品為VB12,來自USP(上海安譜科學(xué)儀器有限公司)。
無水磷酸氫二鈉0.65 g(廣州化學(xué)試劑廠),無水偏重亞硫酸鈉0.01 g(上?;瘜W(xué)試劑總廠),一水合檸檬酸0.6 g(廣州化學(xué)試劑廠);用100 mL蒸餾水溶解制得緩沖液,使用前配制。
試驗樣品為:SRM 1849a(NIST,National Institute of Standards and Technology)、配方乳粉、配方米粉、含乳飲料、功能飲料。
將乳酸桿菌肉湯培養(yǎng)物離心洗去肉湯培養(yǎng)基,并使用含有甘油的測定培養(yǎng)基進(jìn)行適宜的稀釋,加入96排管中,零下80 ℃凍存。
VB12標(biāo)準(zhǔn)工作溶液的濃度為1.25 ng/mL,在無菌條件下使用無菌濾器過濾備用。
(1)配方乳粉、含乳飲料等樣品:稱2~5 g樣品,充分溶解后加入緩沖液水解,在無菌條件下使用無菌濾器過濾,根據(jù)樣品中的VB12的標(biāo)稱含量進(jìn)行稀釋。
(2)配方米粉等樣品:稱2~5 g樣品,加入淀粉酶溶液酶解,滅活后在無菌條件下使用無菌濾器過濾,根據(jù)樣品中VB12的標(biāo)稱含量進(jìn)行稀釋。
(3)功能飲料等樣品:在無菌條件下使用無菌濾器過濾得到樣品溶液,根據(jù)樣品中維生素B12的標(biāo)稱含量進(jìn)行稀釋。
在無菌條件下,按表1順序在滅菌小管中對VB12標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行稀釋,制備相應(yīng)濃度的標(biāo)準(zhǔn)曲線溶液。
表1 VB12標(biāo)準(zhǔn)曲線溶液的制備
將凍存有試驗接種菌懸液的小管恢復(fù)到室溫,在每管中加入300 μL系列標(biāo)準(zhǔn)曲線溶液和300 μL無菌維生素B12測定培養(yǎng)基,一式3 份。使用渦旋振蕩器混合。
在無菌條件下,按表2順序在滅菌小管中對樣品測定液進(jìn)行稀釋,制備相應(yīng)濃度的樣品測定溶液。
將凍存有試驗接種菌懸液的小管恢復(fù)到室溫,在每管中加入300 μL系列樣品測定溶液和300 μL無菌VB12測定培養(yǎng)基,一式3 份。使用渦旋振蕩器混合。
(36±1.0)℃培養(yǎng)24~28 h。
混合均勻,使用酶標(biāo)儀進(jìn)行讀數(shù)。平行小管相對偏差小于15%的為有效數(shù)值。
表2 VB12樣品測定液的制備
以標(biāo)準(zhǔn)曲線管VB12含量做橫坐標(biāo),以吸光度做縱坐標(biāo),根據(jù)四參數(shù)方程擬合標(biāo)準(zhǔn)曲線,結(jié)果如圖1所示。標(biāo)準(zhǔn)曲線相關(guān)系數(shù)達(dá)到0.9989。
根據(jù)每管的吸光值從標(biāo)準(zhǔn)曲線查得對應(yīng)的VB12含量,除以相對樣液體積(v),得到每管樣品溶液中VB12含量。由所有有效管中測得的數(shù)值計算平均值(Cx)。樣品中VB12含量按下列公式計算:
m(g)為樣品質(zhì)量,f為樣品稀釋倍數(shù)。
以SRM 1849a、配方乳粉、配方米粉、含乳飲料、功能飲料為試驗樣品,每種樣品作6 次平行試驗,檢測結(jié)果見表3。所測數(shù)據(jù)表明該方法測定VB12含量有效,重復(fù)性良好。
圖1 VB12含量測定標(biāo)準(zhǔn)曲線
選擇已知維生素B12含量的配方乳粉作為加標(biāo)試驗樣品,在樣品稀釋液中加入一定體積的維生素B12標(biāo)準(zhǔn)溶液,加標(biāo)量分別為25.0,50.0,100.0 ng,進(jìn)行3 次重復(fù)試驗,試驗結(jié)果如表4所示;回收率為94.2%~103.1%,試驗靈敏度高。
表3 VB12含量檢測結(jié)果
表4 加標(biāo)回收試驗結(jié)果
國家標(biāo)準(zhǔn)方法為傳統(tǒng)微生物法,存在步驟繁瑣、操作耗時、檢測周期長、易受外部因素干擾等諸多問題。
在本方法中,試驗體系的體積縮小,標(biāo)準(zhǔn)溶液和樣品溶液的制備可以使用1.2 mL小管和移液器進(jìn)行操作,使得操作更加簡便、準(zhǔn)確,且代替了大量的容量瓶、試管和移液管等,既節(jié)省了人工也避免了雜質(zhì)、活性物質(zhì)等對試驗結(jié)果的影響。本文方法將試驗菌株預(yù)先固定在96排管,利用甘油保護(hù)冷凍的菌種[4],極大地縮短了試驗周期,在提高試驗效率的同時,使菌株的活力更加穩(wěn)定,保證了試驗的有效性。在維生素檢測過程中有較高的靈敏度和精確度。
商品化維生素檢測試劑盒的優(yōu)點在于操作步驟簡便[5],但是其配套標(biāo)準(zhǔn)溶液的保藏與制備是影響試驗結(jié)果準(zhǔn)確性的關(guān)鍵因素,并且如果樣品溶液只做一個稀釋度進(jìn)行檢測也會極大地影響結(jié)果準(zhǔn)確性。同時試劑盒價格十分昂貴,加重了維生素檢驗的負(fù)擔(dān)。
在本文方法中,標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備準(zhǔn)確可靠,樣品溶液采取多個濃度進(jìn)行檢測,保證了試驗結(jié)果的準(zhǔn)確性和重現(xiàn)性。同時采用小管進(jìn)行培養(yǎng),更利于試驗溶液的充分混勻并減少了試驗污染風(fēng)險。
在微生物法檢測微量維生素含量試驗中,試驗菌種的活力是影響試驗結(jié)果的關(guān)鍵因素, 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制是影響試驗結(jié)果的直接因素。試驗過程中須注意避免雜質(zhì)對試驗菌株生長的影響。在制備樣品測定液的過程中,須注意稀釋液的均勻性,并采用適宜的稀釋倍數(shù)。微量稀釋過程中要保證準(zhǔn)確性。
維生素分析檢測工作對于評價食品營養(yǎng)價值、控制強(qiáng)化食品中維生素的加入量具有重要意義。微生物法測定VB12含量的快速方法,操作步驟簡便,有利于建立有效的試驗流程和質(zhì)量管理,保證了試驗的有效性和結(jié)果的準(zhǔn)確性,適于在常規(guī)實驗室建立和應(yīng)用。
[1]Gregory M E. The microbiological assay of Vitamin B12in the milk of different animal species. British Journal of Nutrition,1954(8):340-347.
[2]張麗宏,王克新,王淼,等. 微生物法測定乳粉中維生素B12的應(yīng)用和探討. 中國乳品工業(yè),2008,36(10):58-60.
[3]GB 5413.14—2010 食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 嬰幼兒食品和乳品中維生素B12的測定.
[4]Grossowicz N,Waxman S,Schreiber C. CryoprotectedLactobacillus casei:an approach to standardization of microbiological assay of Folic acid in Serum. Netherlands Journal of Immunological Methods,1981,46(2):129-140.
[5]黃曉林,王淼,張麗宏,等. IFP微孔板試劑盒檢測配方乳粉中維生素B12方法探討. 中國乳品工業(yè),2010(7):48-49.