鄔振華 李群 龔朝暉 沈志森

LAMA4基因?qū)戆┘?xì)胞增殖和侵襲的調(diào)控機(jī)制

鄔振華 李群 龔朝暉 沈志森

目的 構(gòu)建層粘連蛋白α4亞基（LAMA4）的過(guò)表達(dá)和干擾序列重組慢病毒，觀察其對(duì)Hep-2喉癌細(xì)胞株增值和侵襲的調(diào)控機(jī)制。方法 全基因合成LAMA4序列并篩選有效的LAMA4基因干擾序列，重組入帶有綠色熒光蛋白慢病毒載體。采用慢病毒感染喉癌細(xì)胞株Hep-2后，通過(guò)Western blot檢測(cè)過(guò)表達(dá)和干擾效率。MTT法檢測(cè)LAMA4基因表達(dá)變化時(shí)Hep-2細(xì)胞株增殖能力的變化。Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)喉癌細(xì)胞株感染前后侵襲能力的變化。利用Western blot和Real-time PCR檢測(cè)基質(zhì)金屬蛋白酶-2(MMP-2)與膜型基質(zhì)金屬蛋白酶(MT1-MMP)的基因表達(dá)量變化情況。結(jié)果 （1）攜帶LAMA4基因片段和小干擾片段的重組慢病毒成功構(gòu)建，包裝慢病毒后濃縮病毒懸液滴度達(dá)到5×105TU/μl。（2）基因沉默組LAMA4蛋白相對(duì)表達(dá)量明顯低于對(duì)照組，過(guò)表達(dá)組相對(duì)表達(dá)量明顯高于對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0．05）。（3）LAMA4干擾慢病毒感染Hep-2喉癌細(xì)胞株后，細(xì)胞株增殖無(wú)明顯變化。（4）Transwell小室檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，基因沉默組及過(guò)表達(dá)組Transwell細(xì)胞數(shù)與對(duì)照組的差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0．05）。（5）與對(duì)照組比較，基因沉默組及過(guò)表達(dá)組MMP-2及MT1-MMP基因與蛋白表達(dá)均發(fā)生明顯變化，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0．05）。結(jié)論 LAMA4基因可能是通過(guò)MMP-2和MT1-MMP基因相關(guān)通路調(diào)節(jié)喉癌細(xì)胞的侵襲能力，LAMA4可以作為治療喉癌轉(zhuǎn)移的潛在靶點(diǎn)。

基因 喉癌 慢病毒 侵襲能力 增殖

喉癌是耳鼻喉-頭頸外科常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，發(fā) 生率約占全身惡性腫瘤的5%，在我國(guó)的發(fā)病率呈上升趨勢(shì)[1]。喉癌患者5年內(nèi)死亡的主要原因之一為腫瘤的侵潤(rùn)和轉(zhuǎn)移，而腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移機(jī)制已成為目前全球研究的熱點(diǎn)。喉癌作為頭頸外科的多發(fā)病，其發(fā)生、發(fā)展涉及多中心、多環(huán)節(jié)、多通路，分子生物學(xué)機(jī)制尚未明確。隨著分子生物學(xué)研究技術(shù)的發(fā)展，喉癌侵襲和轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制研究逐漸受到重視[2-3]。層粘連蛋白（Laminin，LN）是構(gòu)成基底膜的重要成分之一，有研究證實(shí)，LN在高分化喉癌組織中表達(dá)水平顯著低于低分化及中分化喉癌，并且和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移能力相關(guān)[4]。LNα4亞基（Laminin A1-pha4，LAMA4）是LN的重要功能型亞基，是細(xì)胞外基質(zhì)中與腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)的一種功能性基因。腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移包括細(xì)胞黏附、細(xì)胞外基質(zhì)降解、細(xì)胞移動(dòng)等步驟，LAMA4基因被證明在此過(guò)程中發(fā)揮了重要作用[5]。本研究擬通過(guò)構(gòu)建重組慢病毒使LAMA4基因表達(dá)量發(fā)生變化，在過(guò)表達(dá)和沉默LAMA4基因后，觀察喉癌細(xì)胞增殖和侵襲能力的變化，以初步探討LAMA4基因?qū)戆〩ep-2細(xì)胞株增殖和侵襲能力的影響及作用機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 材料 Hep-2喉癌細(xì)胞株購(gòu)于上海中科院細(xì)胞庫(kù)。DMEM培養(yǎng)基、FBS、0.25%胰蛋白酶軍購(gòu)自Invitrogen公司；多克隆抗體購(gòu)于Creative Biomart公司。βactin單克隆抗體購(gòu)于美國(guó)Santa Cruz公司，二抗購(gòu)于北京中杉公司。慢病毒由寧波大學(xué)生化實(shí)驗(yàn)室包裝。細(xì)胞LAMA4基因的Genebank編號(hào)為NM 001105208。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) Hep-2喉癌細(xì)胞株培養(yǎng)在含10%FBS的DMEM培養(yǎng)基中，置于5%CO237℃恒溫培養(yǎng)箱中。

1.2.2 重組慢病毒感染Hep-2喉癌細(xì)胞株 用攜帶LAMA4全基因序列和LAMA4的小干擾RNA（sma11 interfering RNA，siRNA）序列的慢病毒感染Hep-2細(xì)胞株。將5×105個(gè)Hep-2細(xì)胞接種于24孔板，融合度達(dá)到50%～60%時(shí)分別用LAMA基因和siRNA的慢病毒和空載體病毒感染復(fù)數(shù)為50的病毒感染Hep-2細(xì)胞，72h后用熒光顯微鏡觀察綠色熒光蛋白（green f1uorescent protein，GFP）表達(dá)陽(yáng)性的細(xì)胞，計(jì)算重組慢病毒感染效率（重組慢病毒感染效率=GFP陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)/該視野下的總細(xì)胞數(shù)）。

1.2.3 基質(zhì)金屬蛋白酶-2（matrix meta11oproteinases-2，MMP-2）、膜型基質(zhì)金屬蛋白酶（membranetype-1 MMP，MT1-MMP）及LAMA4蛋白表達(dá)量檢測(cè) （1）分別將基因沉默組、過(guò)表達(dá)組和空載體病毒對(duì)照組細(xì)胞收集起來(lái)，PBS洗滌2次，去上清液，迅速加入100μ1細(xì)胞裂解液，用細(xì)胞刮刀刮下細(xì)胞后超聲裂解，4℃離心20min。取上清液BCA法測(cè)定蛋白濃度后，按比例加入5×SDSPAGE上樣緩沖液，沸水浴10min后保存待用。配制5%濃縮膠及10%分離膠后，取20μg蛋白上樣進(jìn)行SDSPAGE電泳。80V電壓于濃縮膠中電泳，待溴酚藍(lán)達(dá)到濃縮膠和分離膠分界時(shí)，改用120V電壓繼續(xù)電泳，至溴酚藍(lán)至凝膠底部時(shí)終止電泳。電泳后4℃下12V轉(zhuǎn)膜過(guò)夜，室溫封閉60min。將蛋白條帶按照分子量大小裁剪后，放入LAMA4和β-actin的相應(yīng)一抗（兔多克隆抗體）中，4℃過(guò)夜。次日，先將孵育一抗的PVDF膜取出，用緩沖液洗滌后，加入相應(yīng)的二抗（山羊抗兔）進(jìn)行孵育，1h后將條帶取出，進(jìn)行曝光處理，同時(shí)將膜上相應(yīng)的內(nèi)參條帶置入內(nèi)參抗體中進(jìn)行孵育過(guò)夜，次日孵育二抗后曝光處理。以結(jié)果條帶與內(nèi)參β-肌動(dòng)蛋白（βactin）吸光度值的比值作為目的條帶測(cè)量值。（2）依照前一步驟方法對(duì)3組細(xì)胞的蛋白分別進(jìn)行提取,測(cè)定蛋白濃度后待用。將各組細(xì)胞取20μg蛋白上樣進(jìn)行SDSPAGE電泳，轉(zhuǎn)膜。剪裁相應(yīng)分子量大小的PVDF膜孵育MMP-2、MT1-MMP的兔多克隆抗體，4℃過(guò)夜。次日孵育山羊抗兔二抗后，進(jìn)行曝光處理。同樣與內(nèi)參比較后進(jìn)行灰度分析得出測(cè)量值。

1.2.4 Hep-2細(xì)胞侵襲能力測(cè)定 將Transwe11小室（BD公司）上下室之間用孔徑為8 μm的硝酸酯膜分開(kāi)，膜上鋪Matrige1膠，50μg/室。下室用10%FBS作為趨化因子，上室分別加入密度為1×106個(gè)/m1的Hep-2細(xì)胞400μ1。孵育24h，取出拭去膜上層剩余細(xì)胞，用4%多聚甲醛固定，蘇木素染色，光學(xué)顯微鏡下觀察。每張膜隨機(jī)取5個(gè)視野，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取均值作為最終結(jié)果。

1.2.5 細(xì)胞生長(zhǎng)檢測(cè) 采用MTT法。選對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的各組細(xì)胞，胰蛋白酶消化，以5 000個(gè)細(xì)胞/孔接種于96孔板中。連續(xù)培養(yǎng)3d，每天選擇3個(gè)孔，單孔加入20μ1（5mg/m1）MTT，37℃、5%CO2培養(yǎng)4h；每孔加入150μ1 DMSO，室溫下?lián)u床震蕩10min，使紫色結(jié)晶充分溶解，490nm測(cè)定吸光值。

1.2.6 MMP-2和MT1-MMP基因表達(dá)量檢測(cè) 分別提取各組細(xì)胞的總RNA，逆轉(zhuǎn)錄后，運(yùn)用Rea1-time PCR方法檢測(cè)。Rea1-time PCR反應(yīng)總體系為20μ1，其中上下游引物各1 μ1，cDNA模板2μ1，SYBR Premix Ex TaqⅡ10μ1，雙蒸水補(bǔ)足體系至20μ1。反應(yīng)條件為95℃預(yù)變性3min；94℃變性30s、60℃退火30s、72℃延伸30s，共40個(gè)循環(huán)。PCR反應(yīng)結(jié)束后采用比較閾值法測(cè)定目的基因的相對(duì)表達(dá)水平，可以直接得到目的基因相對(duì)于內(nèi)參基因（GAPDH）的定量。目的基因的表達(dá)水平=2-△Ct，其中△Ct=（目的基因Ct-參照基因Ct）。PCR引物序列見(jiàn)表1。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS18.0統(tǒng)計(jì)軟件，所得數(shù)據(jù)以表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。

表1 PCR引物序列

2 結(jié)果

2.1 慢病毒感染效率 攜帶LAMA4基因片段和小干擾片段的重組慢病毒成功構(gòu)建，包裝慢病毒后，濃縮病毒懸液滴度達(dá)到5×105TU/μ1。重組慢病毒感染Hep-2細(xì)胞72h后，倒置熒光顯微鏡下觀察各孔中GFP的表達(dá)量，攜帶LAMA4全基因序列和siRNA序列的慢病毒及空載體病毒感染組中，Hep-2細(xì)胞GFP表達(dá)均成陽(yáng)性，且陽(yáng)性率達(dá)90%，詳見(jiàn)圖1。

圖1 光鏡下重組慢病毒感染Hep-2細(xì)胞株的情況（×200）

2.2 過(guò)表達(dá)和基因沉默后喉癌細(xì)胞中LAMA4蛋白水平的變化 對(duì)照組LAMA4蛋白相對(duì)表達(dá)量為0.56± 0.15，基因沉默組為0.39±0.16，過(guò)表達(dá)組為0.87±0.20，其電泳圖見(jiàn)圖2?；虺聊M相對(duì)表達(dá)量明顯低于對(duì)照組，過(guò)表達(dá)組相對(duì)表達(dá)量明顯高于對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）。

圖2 LAMA4蛋白相對(duì)表達(dá)量的變化

2.3 LAMA4基因表達(dá)變化對(duì)Hep-2細(xì)胞侵襲能力的影響 Transwe11小室檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，對(duì)照組Transwe11細(xì)胞數(shù)為（26±3.61）個(gè)，基因沉默組及過(guò)表達(dá)組分別為（45± 5.80）、（14±3.26）個(gè)，基因沉默組及過(guò)表達(dá)組與對(duì)照組的差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）。

2.4 LAMA4基因表達(dá)變化對(duì)喉癌細(xì)胞株生長(zhǎng)的影響見(jiàn)表2。

表2 第1～3天喉癌細(xì)胞株生長(zhǎng)情況的比較（吸光值）

由表2可見(jiàn)，第1～3天各組喉癌細(xì)胞生長(zhǎng)情況并無(wú)明顯區(qū)別，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05）。

2.5Hep-2細(xì)胞中MMP-2及MT1-MMP基因及蛋白表達(dá)變化的比較 見(jiàn)表3。

表3 Hep-2細(xì)胞中MMP-2及MT1-MMP基因表達(dá)變化的比較

由表3可見(jiàn)，與對(duì)照組比較，基因沉默組及過(guò)表達(dá)組MMP-2及MT1-MMP基因與蛋白表達(dá)均發(fā)生明顯變化，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）。

3 討論

在腫瘤組織中，基底膜和細(xì)胞外基質(zhì)是腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移過(guò)程中的第一道屏障，在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中起著重要的生物學(xué)作用。研究表明，基底膜斷續(xù)或消失的實(shí)驗(yàn)組，頸淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率遠(yuǎn)高于基底膜完整組。而腫瘤轉(zhuǎn)移則需先突破基底膜的限制，而后侵襲周?chē)M織，進(jìn)而向遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。而完整的基底膜則具有限制腫瘤轉(zhuǎn)移的作用。Laminin-8是基底膜中主要的非膠原成分，參與細(xì)胞的生長(zhǎng)、運(yùn)動(dòng)、分化等生物過(guò)程，介導(dǎo)腫瘤細(xì)胞和基底膜的黏附；其表達(dá)缺失程度提示著基底膜的破壞程度，預(yù)示腫瘤的穩(wěn)定性同時(shí)也受到了破壞[6]。而LAMA4是Laminin-8中重要的功能型亞基，其主要參與了腫瘤轉(zhuǎn)移過(guò)程中細(xì)胞間質(zhì)的降解、細(xì)胞微環(huán)境改變等步驟[3]。有研究表明，LAMA4可能具有抑制腫瘤轉(zhuǎn)移的作用[5,7]。

本研究成功構(gòu)建了攜帶LAMA4基因片段和小干擾片段的重組慢病毒，包裝慢病毒后濃縮病毒懸液滴度達(dá)到5×105TU/μ1。Transwe11侵襲小室實(shí)驗(yàn)證明，在LAMA4基因過(guò)表達(dá)時(shí)，穿過(guò)小室的細(xì)胞數(shù)相比對(duì)照組減少，提示喉癌細(xì)胞株Hep-2的侵襲能力減弱。而將LAMA4基因沉默后，Hep-2細(xì)胞的侵襲能力顯著增強(qiáng)。由此可推斷，LAMA4在喉癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移的過(guò)程中可能發(fā)揮著重要的作用。LAMA4的表達(dá)量與喉癌細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移能力呈負(fù)相關(guān)。細(xì)胞侵襲能力增強(qiáng)會(huì)直接導(dǎo)致喉癌的局部浸潤(rùn)、頸淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，因此LAMA4在喉癌組織中的表達(dá)量可以作為預(yù)測(cè)喉癌侵襲和轉(zhuǎn)移的重要因素之一。LAMA4影響喉癌侵襲和轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制目前還不明確，而增加LAMA4基因的表達(dá)很可能對(duì)喉癌的侵襲和轉(zhuǎn)移產(chǎn)生抑制作用。因此，LAMA4基因可以作為喉癌藥物治療的潛在靶點(diǎn)。

在腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移的諸多研究中MMPs具有重要的意義。MMPs是一組鋅離子依賴性蛋白，其中MMP-2和MT1-MMP作為腫瘤細(xì)胞的侵襲標(biāo)志物,與基底膜的降解有著重要的關(guān)系[7-8]，在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮著重要的作用[9]。為了進(jìn)一步探尋LAMA4的作用機(jī)制，采用Western B1ot檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，LAMA4表達(dá)量變化時(shí)MMPs家族蛋白表達(dá)隨之發(fā)生變化；當(dāng)LAMA4基因被沉默后，MMP-2和MT1-MMP的表達(dá)升高，這進(jìn)一步證實(shí)了當(dāng)LAMA4表達(dá)量減少時(shí)，喉癌細(xì)胞的侵襲相關(guān)分子的表達(dá)量升高，侵襲能力增強(qiáng)；而LAMA4過(guò)表達(dá)時(shí)，MMP-2和MT1-MMP的表達(dá)量隨之下降，喉癌細(xì)胞的侵襲能力進(jìn)而降低。因此可以推斷，作為基底膜中的重要組成部分，LAMA4表達(dá)量的變化則與喉癌細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移的能力有著密切的聯(lián)系，LAMA4可能是通過(guò)MMPs蛋白家族發(fā)揮作用。

[1]Ji X,Jingli J V,Liu Q,et al．Construction of the superantigen SEAtransfected laryngocarcinoma cells[J]．Lin chuang er bi yan hou tou jing wai ke za zhi=Journal of clinical otorhinolaryngology, head,and neck surgery,2013,27(7):376-378．

[2]陳英武,張靖華,平金良,等．E-cadherin,FAK在聲門(mén)上型喉癌組織中的表達(dá)及其與頸淋巴結(jié)隱性轉(zhuǎn)移的相關(guān)性[J]．浙江醫(yī)學(xué),2011,33(10): 1439-1440．

[3]Aumailley M．The laminin family[J]．Cell adhesion&migration,2013, 7(1):48-55．

[4] 夏曉麗,齊恒,劉清明,表皮鈣黏蛋白和層粘連蛋白在喉癌及下咽鱗狀細(xì)胞癌中表達(dá)及意義[J]．中華實(shí)用診斷與治療雜志，2012，26(7):680-681．

[5]Yang X,Li W,Guo L．The study on the anti-tumor function of lysozyme in the regional lymph nodes of laryngocarcinoma patients[J]．Lin chuang er bi yan hou ke za zhi=Journal of clinical otorhinolaryngology,1998,12(2):51-53．

[6]Badran E F,Battah H A,Akl K F,et al．Detection of novel LAMA3 mutation in Herlitz junctional epidermolysis bullosa in a Jordanian family[J]．The Australasian Journal of Dermatology,2013,54(3): 218-221．

[7]Secco M,Bueno C Jr,Vieira N M,et al．Systemic delivery of human mesenchymal stromal cells combined with IGF-1 enhances muscle functional recovery in LAMA2 dy/2j dystrophic mice[J]．Stem cell reviews,2013,9(1):93-109．

[8]Rah B,Amin H,Yousuf K,et al．A novel MMP-2 inhibitor 3-azidowithaferin A (3-azidoWA)abrogates cancer cell invasion and angiogenesis by modulating extracellular Par-4[J]．PloS one,2012, 7(9):e44039．

[9]Cui J,Chen S,Zhang C,et al．Inhibition of MMP-9 by a selective gelatinase inhibitor protects neurovasculature from embolic focal cerebral ischemia[J]．Molecular neurodegeneration,2012,7:21．

[10]Oyanagi J,Ogawa T,Sato H,et al．Epithelial-mesenchymal transition stimulates human cancer cells to extend microtubule-based invasive protrusions and suppresses cell growth in collagen gel[J]．PloS one,2012,7(12):e53209．

Laminin α4(LAMA4)regulates proliferation and invasion of laryngeal carcinoma Hep-2 cells

ObjectiveTo investigate the effects of laminin α4(LAMA4)on proliferation and invasion of laryngeal carcinoma Hep-2 cells．Methods Recombinant lentiviral vector with completed LAMA4 gene and LAMA4 siRNA sequences combined with GFP were constructed,respectively．Both of them were transfected into Hep-2 cells．The over-expression and knock-down rates were verified by western blot．MTT and Transwell assays were performed to determine the proliferation and invasion ability of transfected Hep-2 cells．The expressions of MMP-2,MT1-MMP proteins and mRNA were evaluated by Western blot and real-time PCR．Results Recombinant lentiviruses with LAMA4 gene and LAMA4 siRNA were successfully constructed．The virus titer was 5×105TU/μl．Lentivirus-mediated LAMA4 and LAMA4 siRNA were transfected into Hep-2 cells．Lower LAMA4 expression was detected in LAMA4 siRNA group,while over-expression was detected in LAMA4 group as compared to the control group(P＜0．05)．No effect on cell proliferation was detected in both LAMA or LAMA4 siRNA-transfected Hep-2 cells．Compared to control group the invasive ability of Hep-2 cells was increased in LAMA4 over-expression group and reduced in LAMA4 knock-down group(P＜0．05);meanwhile the expression of MMP-2,MT1-MMP proteins and mRNA levels were increased in LAMA4 over-expression group and decreased in LAMA4 knockdown group(P＜0．05)．Conclusion LAMA4 may be involved in the invasion of laryngeal carcinoma Hep-2 cells by regulating MMP-2 and MT1-MMP expression,suggesting that LAMA4 would be a potential therapeutic target for laryngocarcinoma．

Gene Laryngocarcinoma Lentivirus Invasion Proliferation

2013-11-06）

（本文編輯：歐陽(yáng)卿）

寧波市科技創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)項(xiàng)目（2012B82019）

315040 寧波大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬李惠利醫(yī)院耳鼻喉科（鄔振華、沈志森）；寧波大學(xué)醫(yī)學(xué)院生物化學(xué)與分子生物學(xué)研究所（李群、龔朝暉）