范曉松 汪朔 顧利鋒

KLF8蛋白膀胱癌組織中的表達(dá)及與預(yù)后的關(guān)系

范曉松 汪朔 顧利鋒

目的 探討KLF8蛋白在膀胱癌中的表達(dá)，并分析其與臨床病理特征及預(yù)后的關(guān)系。方法選擇膀胱癌標(biāo)本137例，正常膀胱組織標(biāo)本19例，采用免疫組織化學(xué)方法，檢測膀胱癌和正常組織中KLF8蛋白的表達(dá)，并結(jié)合臨床資料進(jìn)行分析。結(jié)果正常組織中KLF8蛋白的表達(dá)水平明顯低于腫瘤組織（P＜0.001）。低級(jí)別和高級(jí)別膀胱癌中KLF8蛋白表達(dá)的陽性率分別為37.2%、58.5%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。非肌層浸潤性膀胱癌和肌層浸潤性膀胱癌中KLF8蛋白表達(dá)的陽性率44%和67.4%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。本組隨訪7～112個(gè)月，在肌層浸潤性膀胱癌中，Kaplan-Meier生存顯示：KLF8蛋白的陽性表達(dá)與膀胱癌患者的總生存率有關(guān)（P＜0.05）。結(jié)論KLF8蛋白的表達(dá)在膀胱癌組織中明顯高于正常組織，KLF8蛋白的表達(dá)與膀胱癌的分級(jí)、分期、預(yù)后有關(guān)；與患者的年齡、性別、腫瘤的數(shù)目無相關(guān)性（P＞0.05）。KLF8蛋白的檢測有助于膀胱癌的診斷及預(yù)后的評估。

膀胱癌 KLF8 免疫組化 預(yù)后

Krüppel編碼一個(gè)包含一個(gè)DNA結(jié)合基序的蛋白質(zhì)，該基序由幾個(gè)Cys2/His2型的鋅指構(gòu)成；在哺乳動(dòng)物中，一群與Krüppel的鋅指結(jié)構(gòu)高度同源的蛋白質(zhì)被發(fā)現(xiàn)，并命名為Krüppel樣因子（Krüppel-like factor，KLFs），它們是轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)蛋白，參與廣泛的細(xì)胞進(jìn)程[1-3]。KLF8最初是作為Krüppel樣C2H2鋅指轉(zhuǎn)錄因子蛋白質(zhì)家族的一個(gè)轉(zhuǎn)錄抑制蛋白而被識(shí)別的，通過與輔抑制蛋白羧基末端結(jié)合蛋白（CtBP）相聯(lián)系抑制基因表達(dá)[4]。KLF8包含一個(gè)特征性的羧基末端DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域，其由3個(gè)Krüppel樣鋅指結(jié)構(gòu)組成，KLF8的Pro-Val-Asp-Leu-Ser基序與CtBP作用。KLF8的鋅指結(jié)構(gòu)識(shí)別DNA序列里的CACCC元件，全長的KLF8蛋白能夠抑制CACCC依賴性啟動(dòng)子。最近有研究發(fā)現(xiàn)，在某些上皮癌如乳腺癌、卵巢癌、腎癌及肝癌都有KLF8的高表達(dá)，且在增強(qiáng)癌細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移中起到重要作用[5-8]。但目前其在膀胱癌中的表達(dá)情況無相關(guān)報(bào)道。本研究檢測KLF8在膀胱癌患者中表達(dá),分析其表達(dá)程度與膀胱癌臨床病理之間的關(guān)系,及對預(yù)后的影響。

1 資料和方法

1.1 一般資料 選取2010-03—2011-03我院泌尿外科住院手術(shù)治療患者中的膀胱尿路上皮癌組織137例和同期手術(shù)病例的正常組織19例，均經(jīng)病理證實(shí)。所有患者術(shù)前均未接受放、化療（包括膀胱灌注），且排除原位癌。其中男98例，女39例。年齡45～84歲，中位年齡71歲。收集資料包括腫瘤大小、數(shù)目、病理分級(jí)、分期（依據(jù)AJCC2002標(biāo)準(zhǔn)）等。

1.2 主要試劑及方法 一抗為多克隆兔抗KLF8抗體（Abnova公司），二抗為生物素標(biāo)記抗兔二抗（美國DAKO公司）、三抗為辣根過氧化物酶標(biāo)記的抗生物素抗體（美國DAKO公司）。

1.3 免疫組化 采用LSAB方法，組織經(jīng)4%甲醛固定，石蠟包埋，厚5m，石蠟切片經(jīng)常規(guī)脫蠟水化，EDTA高溫修復(fù)抗原，PBS漂洗3次后以0.3%過氧化氫-甲醇孵育10min，清除內(nèi)源性的過氧化物酶活性，PBS漂洗3次后滴加正常山羊血清封閉，室溫孵育30min，傾去，滴加1∶100兔抗多克隆抗體，4℃冰箱孵育過夜，PBS漂洗后，再滴加二抗，室溫孵育30min，PBS漂洗3次，再滴加三抗，室溫孵育30min，PBS漂洗3次，DAB顯色，蘇木精復(fù)染，脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片，PBS代替一抗作陰性對照。

1.4 結(jié)果判斷 KLF8以胞核出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性表達(dá)，以細(xì)胞染色強(qiáng)度和細(xì)胞陽性百分率得分之積進(jìn)行判定，隨機(jī)選擇5個(gè)高倍鏡視野（×200）進(jìn)行判斷：著色強(qiáng)度無染色記0分，淺黃色計(jì)1分,棕黃色計(jì)2分，黃褐色計(jì)3分，同時(shí)對陽性細(xì)胞百分比進(jìn)行評分（0～100%）。上述2項(xiàng)相乘，弱陽性（±）＜50%，中等陽性（++），50%～100%，強(qiáng)陽性（+++），100%～300%。將弱陽性定義為低表達(dá)，中等陽性和強(qiáng)陽性為高表達(dá)。結(jié)果觀察在不了解患者臨床資料的情況下進(jìn)行。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS11.0軟件分析。組間比較采用χ2檢驗(yàn)。生存分析采用Kaplan-Meier法及Logrank檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 KLF8在膀胱癌組織和正常組織中的表達(dá) KLF8表達(dá)陽性主要表現(xiàn)為細(xì)胞核中著色（圖1），在膀胱癌中KLF8蛋白的陽性表達(dá)率為51.8%（71/137），而正常組織為17.6%（3/17），兩者比較差異意義有統(tǒng)計(jì)學(xué)（P＜0.0001）。

2.2 KLF8蛋白的表達(dá)與膀胱癌患者臨床病理特征及預(yù)后的關(guān)系 KLF8蛋白的表達(dá)與膀胱癌患者年齡、性別、腫瘤大小、腫瘤數(shù)目等無明顯相關(guān)性（P＞0.05）；但與膀胱癌的分級(jí)、分期及預(yù)后有關(guān)（P＜0.05）。低級(jí)別和高級(jí)別膀胱癌中KLF8蛋白表達(dá)的陽性率分別為37.2%、58.5%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.021）。非肌層浸潤性膀胱癌和肌層浸潤性膀胱癌中KLF8蛋白表達(dá)的陽性率44%和67.4%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.01）。在肌層浸潤性膀胱癌中，隨訪4～103個(gè)月，平均48.5個(gè)月，Log-rank檢驗(yàn)顯示，兩組間總生存率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.0022），KLF8蛋白的陽性表達(dá)是影響患者預(yù)后的重要因素（圖2）。KLF8蛋白的表達(dá)與膀胱癌患者臨床病理特征的關(guān)系見表1。

圖1 KLF8蛋白在正常膀胱組織（A）及膀胱癌組織（B）的表達(dá)

圖2 肌層浸潤性膀胱癌中KLF8蛋白低表達(dá)和高表達(dá)患者的總生存曲線

3 討論

膀胱癌是最常見的泌尿系統(tǒng)惡性腫瘤，在美國男性惡性腫瘤發(fā)病率中占第4位，女性占第7位，在美國2011年新發(fā)膀胱癌病例70 530例，其中14 680例死亡[9]。中國臨床統(tǒng)計(jì)資料顯示，膀胱癌發(fā)病率在泌尿系統(tǒng)腫瘤中仍處于首位，其中男性發(fā)病率為14.72/10萬，女性發(fā)病率為5.34/10萬[10]。在所有初次診斷的患者中，大約75%的患者是非肌層浸潤性膀胱癌（non-muscle-invasive bladder cancer，NMIBC），25%的患者是肌層浸潤性膀胱癌（muscle-invasive bladder cancer，MIBC）[11]。NMIBC 5年生存率＞90%，但復(fù)發(fā)率高達(dá)60%～85%，其中20%可進(jìn)展為肌層浸潤性腫瘤[12]。MIBC遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移發(fā)生率較高，預(yù)后較差。即使及時(shí)給予全膀胱切除術(shù)治療和各種輔助治療，術(shù)后5年存活率僅為50%左右[13-14]，并且近30年來MIBC的預(yù)后沒有明顯改善[15]。

表1 KLF8蛋白表達(dá)與膀胱癌患者臨床病理特征的關(guān)系（例）

本研究結(jié)果表明，KLF8蛋白在腫瘤組織中的表達(dá)水平明顯高于正常組織，提示KLF8蛋白可能與膀胱癌的發(fā)生有關(guān)。KLF8蛋白的表達(dá)水平隨腫瘤分化水平的降低而升高。NMIBC和MIBC的臨床生物學(xué)行為有很大的差別，在臨床治療及預(yù)后都有明顯差別。MIBC中KLF8表達(dá)明顯高于NMIBC，提示KLF8在膀胱癌的進(jìn)展中起到一定的作用。因此，臨床上通過檢測KLF8蛋白的表達(dá)，有助于NMIBC和MIBC的鑒別診斷。本研究還發(fā)現(xiàn)，KLF8蛋白高表達(dá)還與患者的預(yù)后有關(guān)，為臨床患者術(shù)后預(yù)后提供了生物學(xué)指標(biāo)。已有研究表明，KLF8調(diào)控上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化在腫瘤的侵襲及轉(zhuǎn)移中起到重要的作用[7]。上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）是指上皮細(xì)胞在形態(tài)學(xué)上發(fā)生成纖維細(xì)胞或間充質(zhì)細(xì)胞表型的轉(zhuǎn)變，并獲得遷移的能力，它是一種基本的病理生理現(xiàn)象，上皮細(xì)胞表型的缺失及間質(zhì)細(xì)胞的特性獲得是其主要特征。EMT是胚胎發(fā)育、組織重建和傷口修復(fù)中的基礎(chǔ)過程，同時(shí)也是腫瘤浸潤、轉(zhuǎn)移的一個(gè)非常重要的機(jī)制[16-17]。因此，我們認(rèn)為進(jìn)一步探討KLF8導(dǎo)致膀胱癌形成的分子機(jī)制，有望為判斷膀胱癌預(yù)后提供一種新的分子生物學(xué)指標(biāo)，同時(shí)還可為膀胱癌的靶向治療提供特異性的靶點(diǎn)。

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Expression of KLF8 protein in bladder cancer and its relation to prognosis

Objective To investigate the expression of KLF8 in bladder cancer and its relation to the prognosis of patients.MethodsThe expression of KLF8 in 137 urothelial bladder cancer and 19 normal bladder tissue samples was detected by immunohistochemistry,and its relation to clinicopathological features was analyzed.ResultsThe positive rate of KLF8 protein was significantly higher in bladder cancer than that in normal bladder tissue(P＜0.001).The positive rate of KLF8 protein was 37.2%in low grade bladder cancer and 58.5%in high grade bladder cancer(P＜0.05).It was significantly lower in non-muscle-invasive bladder cancer than that in muscle invasive bladder cancer(44%,67.4%,P＜0.05).The patient was followed up for 7～112 months,Kaplan-Meier analysis showed that positive expression of KLF8 was significantly associated with overall survival of patients with muscle-invasive-bladder cancer(P＜0.05).ConclusionThe expression of KLF8 protein is high in bladder cancer, which is correlated with classification,TMN stage and prognosis of the disease.

Bladder cancer KLF8 Immunohistochemistry Prognosis

2013-11-18）

（本文編輯：田云鵬）

310003 杭州，浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院泌尿外科

汪朔，E-mail:fxs_zaizhi@sina.com