郭 昱，袁小悅，李斯嶼，王振中,2，段長(zhǎng)青，何 非*

（1.中國農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與營(yíng)養(yǎng)工程學(xué)院，葡萄與葡萄酒研究中心，北京 100083；2.中糧華夏長(zhǎng)城葡萄酒有限公司，河北昌黎 066600）

適量飲用葡萄酒對(duì)人體健康有一定的有益作用，而酚類物質(zhì)則是葡萄酒活性物質(zhì)中較為重要的一類[1-7]。近年來的眾多研究表明，酚類化合物具有抗氧化，抑制低密度脂蛋白氧化變性，預(yù)防冠心病、高血脂病、動(dòng)脈粥樣硬化及抗各種炎癥等諸多功能[8-10]。

在紅葡萄酒的釀造中，通過皮渣接觸（浸漬）工藝，葡萄果實(shí)中的一部分酚類物質(zhì)在釀造過程中逐漸轉(zhuǎn)移到葡萄酒中，極大程度的影響了葡萄酒的感官特性，是構(gòu)成葡萄酒“骨架”的重要成分[11]。黃酮醇是葡萄及葡萄酒中重要的酚類物質(zhì)，屬于類黃酮化合物，主要包括槲皮素（quercetin）、山奈酚（kaempefrol）、楊梅酮（myriectin）及其相應(yīng)的衍生物，多以糖苷態(tài)的形式存在，賦予葡萄酒由白到黃的色調(diào)，直接或間接的與葡萄酒中的花色苷反應(yīng)，使葡萄酒的顏色更穩(wěn)定[12-13]。此外，葡萄酒中的黃酮醇類化合物與唾液中引起收斂感的糖蛋白結(jié)合反應(yīng)，從而影響葡萄酒的口感[14]。

近年來，在葡萄酒釀造過程中浸漬工藝的使用越來越廣泛，特別是冷浸漬工藝的研究和使用對(duì)葡萄酒質(zhì)量的提高起到了積極的推動(dòng)作用[15]。有研究表明，冷浸漬工藝可以促進(jìn)果皮中的芳香物質(zhì)的萃取，提高葡萄酒的香氣；冷浸漬工藝結(jié)合常溫發(fā)酵可以增加紅葡萄酒顏色及黑醋栗風(fēng)味，增加酚類物質(zhì)并減少葡萄酒的生青味[16-18]。我國西部產(chǎn)區(qū)葡萄酒口感淡薄，顏色容易褪去，而黃酮醇類物質(zhì)在一定程度上對(duì)葡萄酒的這些品質(zhì)有所影響。因而，研究冷浸漬工藝對(duì)干紅葡萄酒黃酮醇類物質(zhì)含量的影響有著重要的意義。本研究從冷浸漬工藝入手，對(duì)冷浸漬階段干紅葡萄酒中黃酮醇進(jìn)行測(cè)定和分析，以期為冷浸漬工藝提供一定的參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

甲醇（色譜純）：美國Fisher公司；乙酸乙酯（分析純）：北京化學(xué)試劑公司；去離子水采用Milli-Q（Milipore，Bedford，MA）系統(tǒng)制備的超純水。標(biāo)樣槲皮素：美國Sigma公司。

1.2 儀器與設(shè)備

Agilent 1200系列LC-UV-MS儀（配有可變波長(zhǎng)檢測(cè)器VWD）：美國Agilent公司。

1.3 葡萄酒釀造及取樣

釀酒所用赤霞珠葡萄果實(shí)產(chǎn)自新疆天山北麓，采于2011年10月，葡萄果實(shí)完全成熟，所有指標(biāo)均達(dá)到葡萄酒釀造標(biāo)準(zhǔn)（可溶性物質(zhì)24～25°Bx，總酸度（以酒石酸計(jì)）5～6 g/L）。在除梗破碎之前，每串葡萄都經(jīng)過人工挑選，去除生長(zhǎng)狀況不好和受傷的葡萄果粒；葡萄破碎入罐后，向150 hL的發(fā)酵罐中加入適量的二氧化硫（60 mg/L）。發(fā)酵罐均安裝有控溫和皮渣分離系統(tǒng)：兩個(gè)發(fā)酵罐用作冷浸漬實(shí)驗(yàn)，另兩個(gè)采用傳統(tǒng)非控溫釀造作為對(duì)照組。

1.3.1 傳統(tǒng)釀造

加入20 g/hL的商業(yè)釀酒酵母L2323（Lallemand Fermented Beverages，Blagnac，F(xiàn)rance）啟動(dòng)發(fā)酵，發(fā)酵過程控制在24～26 ℃。酒精發(fā)酵至殘?zhí)恰? g/L后終止，隨后加入商業(yè)乳酸菌LALVIN31（Lallemand Fermented Beverages），啟動(dòng)蘋果酸-乳酸發(fā)酵。為了提升酚類物質(zhì)含量，在蘋果酸-乳酸發(fā)酵階段進(jìn)行了21 d的發(fā)酵后浸漬。

1.3.2 冷浸漬工藝

酒精發(fā)酵前，樣品在8～10 ℃的低溫環(huán)境下浸漬7 d。冷浸漬過程結(jié)束后，將發(fā)酵罐的溫度升高至15 ℃，向葡萄汁中加入與對(duì)照組相同的商業(yè)酵母啟動(dòng)發(fā)酵，其他工藝與傳統(tǒng)工藝相同。

1.3.3 樣品采集

共采集葡萄酒樣品12次：酒精發(fā)酵啟動(dòng)當(dāng)天（實(shí)驗(yàn)組即冷浸漬結(jié)束時(shí)）開始采樣，酒精發(fā)酵階段每天采樣一次，持續(xù)4次；發(fā)酵后浸漬階段每3 d采樣一次，持續(xù)3次；蘋果酸-乳酸發(fā)酵階段每3 d采樣一次，持續(xù)4次；皮渣分離當(dāng)天再取樣一次。每個(gè)發(fā)酵罐在取樣品前都經(jīng)過了30 min的泵循環(huán)，每個(gè)樣品取樣500 mL，所有樣品取出后都放置于-20 ℃的環(huán)境中保存。

1.3.4 黃酮醇類物質(zhì)的分析

采用Agilent 1200系列LC-UV-MS儀分析標(biāo)準(zhǔn)樣品和酒樣中的黃酮醇類物質(zhì)。色譜條件：色譜柱，Zorbax SB-C18（3 mm×50 mm，1.8 μm）；柱溫：25 ℃；進(jìn)樣量：10 μL；檢測(cè)波長(zhǎng)：280 nm。流動(dòng)相A：1.0%醋酸水溶液；流動(dòng)相B：1.0%醋酸甲醇溶液；流速：1.0 mL/min；梯度洗脫程序：0～15 min，10%～26% B；15～30 min，26%～40% B；30～50 min，40%～65%B；50～60 min，65%～95%B；60～63 min，95%～10%B；63～66 min，10%B。離子源為電噴霧電離源（electrospray ionization，ESI），負(fù)離子模式；霧化器壓力：206.85 kPa；干燥氣流速為10 mL/min；干燥氣溫度：325 ℃；離子掃描范圍為100～1 500 m/z；CID的MS/MS誘導(dǎo)碰撞電壓：1.0 V。

1.3.5 數(shù)據(jù)分析

黃酮醇類物質(zhì)以槲皮素為標(biāo)準(zhǔn)物進(jìn)行定性定量分析，每個(gè)樣品做了兩次平行處理。應(yīng)用SPSS for Windows（v.11.5.）軟件One-Way ANOVA鄧肯多組極差檢驗(yàn)進(jìn)行數(shù)據(jù)差異性分析；數(shù)據(jù)以均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差表示；最低顯著水平P＜0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 葡萄酒釀造各階段樣品理化指標(biāo)

由表1可知，采收葡萄成熟度基本一致，對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組在整個(gè)釀造過程中，在總糖（以葡萄糖質(zhì)量濃度表示）、總酸（以酒石酸質(zhì)量濃度表示）、酒精度上并無明顯差別。

表1 葡萄酒釀造各階段原料和酒的基本理化指標(biāo)Table 1 Basic physicochemical index of crude material and wine in each stage of wine making

2.2 酒精發(fā)酵前樣品中黃酮醇類物質(zhì)的含量

本研究共檢測(cè)到了13種黃酮醇類物質(zhì)，分別是槲皮素（quercetin）、槲皮素-3-O-葡萄糖醛酸（quercetin-3-Oglucuronide）、槲皮素-3-O-葡萄糖苷（quercetin-3-O-glucoside）、槲皮素-3-O-半乳糖苷（quercetin-3-O-galactoside）、槲皮素-3-O-鼠李糖苷（quercetin-3-O-rhamnoside）、山奈酚（Kaempferol）、山奈酚-3-O-葡萄糖苷（kaempferol-3-O-glucoside）、山奈酚-3-O-半乳糖苷（kaempferol-3-O-galactoside）、楊梅酮（myricetin）、楊梅酮-3-O-葡萄糖苷（myricetin-3-O-glucoside）、楊梅酮-3-O-半乳糖苷（myricetin-3-O-galactoside）、異鼠李素（isorhamnetin）、異鼠李素-3-O-葡萄糖苷（isorhamnetin-3-O-glucoside）。由于這些物質(zhì)在葡萄酒中含量較低，故將其分為四大類加以分析，分別為槲皮素類、山奈酚類、楊梅酮類以及異鼠李糖類。

圖1～圖4中時(shí)間為0時(shí)即是酒精發(fā)酵啟動(dòng)前樣品中黃酮醇類物質(zhì)含量情況，從結(jié)果來看，實(shí)驗(yàn)組的各類黃酮醇類物質(zhì)含量普遍高于對(duì)照組，其中以槲皮素-3-O-葡萄糖醛酸、槲皮素-3-O-葡萄糖苷和楊梅酮-3-O-葡萄糖苷、楊梅酮-3-O-半乳糖苷最為明顯，實(shí)驗(yàn)組的這些物質(zhì)含量分別高出了對(duì)照組21.7 mg/L、10.2 mg/L、66.3 mg/L、12.3 mg/L左右。對(duì)于槲皮素、山奈酚、楊梅酮、異鼠李糖四大類物質(zhì)總量來說，實(shí)驗(yàn)組分別高出了對(duì)照組31.3 mg/L、3.17 mg/L、82.3 mg/L、3.5mg/L左右，說明發(fā)酵前的冷浸漬處理明顯有利于原料中黃酮醇類物質(zhì)的浸出。

2.3 釀造過程中黃酮醇類物質(zhì)的含量變化趨勢(shì)

2.3.1 槲皮素類物質(zhì)含量變化趨勢(shì)

由圖1可知，在整個(gè)發(fā)酵過程中，5種槲皮素物質(zhì)在發(fā)酵過程結(jié)束后的含量均有不同程度上升。后浸漬及蘋果酸-乳酸發(fā)酵時(shí)期，實(shí)驗(yàn)組中槲皮素、槲皮素-3-O-鼠李糖苷含量明顯上升，槲皮素-3-O-葡萄糖醛酸苷含量變化不明顯，而槲皮素-3-O-葡萄糖苷、槲皮素-3-O-半乳糖苷含量略微下降。但在對(duì)照組中，除了槲皮素含量上升外，其余4種物質(zhì)含量均出現(xiàn)了不同程度的下降。蘋果酸-乳酸發(fā)酵結(jié)束后，除了槲皮素-3-O-鼠李糖苷外，實(shí)驗(yàn)組的其余四種物質(zhì)的含量與對(duì)照組相比均有顯著性差異，相比于酒精發(fā)酵前實(shí)驗(yàn)組槲皮素類物質(zhì)總量高出對(duì)照組約31.3 mg/L，這一差距在發(fā)酵結(jié)束后更加明顯，達(dá)到49.1 mg/L左右。

圖1 2種不同處理的赤霞珠干紅葡萄酒中槲皮素類各物質(zhì)含量變化Fig.1 The content of quercetins in Cabernet Sauvignon dry red wines with two different treatments

2.3.2 山奈酚類物質(zhì)含量變化趨勢(shì)

由圖2可知，在整個(gè)發(fā)酵過程中，除了山奈酚含量持續(xù)上升外，其他兩種物質(zhì)含量均表現(xiàn)出先升后降的特點(diǎn)。山奈酚物質(zhì)在葡萄酒中含量并不高，但是從發(fā)酵結(jié)束后來看，實(shí)驗(yàn)組的各類物質(zhì)含量顯著高于對(duì)照組。與發(fā)酵前相比，兩組處理所引起的山奈酚類物質(zhì)含量上相差并不大，發(fā)酵前實(shí)驗(yàn)組山奈酚類物質(zhì)總量高于對(duì)照組大約3.1 mg/L，發(fā)酵后則高于對(duì)照組大約1.5 mg/L。

2.3.3 楊梅酮類物質(zhì)含量變化趨勢(shì)

圖2 2種不同處理的赤霞珠干紅葡萄酒中山奈酚類各物質(zhì)含量變化Fig.2 The content of kaempferols in Cabernet Sauvignon dry red wines with two different treatments

圖3 2種不同處理的赤霞珠干紅葡萄酒中楊梅酮類各物質(zhì)含量變化Fig.3 The content of myricetins in Cabernet Sauvignon dry red wines with two different treatments

楊梅酮類物質(zhì)在葡萄酒中含量較高，由圖3可知，在發(fā)酵的整個(gè)過程中，實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組的各類物質(zhì)含量總的來說表現(xiàn)出上升趨勢(shì)。在酒精發(fā)酵時(shí)期，實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組的各個(gè)物質(zhì)均有明顯的上升，而在后浸漬時(shí)期，除了實(shí)驗(yàn)組的楊梅酮仍在上升，剩下的各個(gè)物質(zhì)含量變化趨于平緩。蘋果酸-乳酸發(fā)酵結(jié)束后，實(shí)驗(yàn)組楊梅酮和楊梅酮-葡萄糖苷的含量比對(duì)照組高，且具有顯著性差異，而楊梅酮-半乳糖苷含量比對(duì)照組略微低一些。相比于酒精發(fā)酵前，實(shí)驗(yàn)組楊梅酮類物質(zhì)總量高出對(duì)照組約82.3 mg/L，這一差距在發(fā)酵結(jié)束后有所減弱，但兩種處理對(duì)于楊梅酮類物質(zhì)含量上的影響在數(shù)量上依然明顯，實(shí)驗(yàn)組高出對(duì)照組約50.5 mg/L。

2.3.4 異鼠李素類物質(zhì)含量變化趨勢(shì)

圖4 2種不同處理的赤霞珠干紅葡萄酒中異鼠李糖類各物質(zhì)含量變化Fig.4 The content of isorhamnetin in Cabernet Sauvignon dry red wines with two different treatments

由圖4可以看出，在整個(gè)發(fā)酵過程中，實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組各類物質(zhì)含量均上升，在后浸漬階段，實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組的異鼠李素含量還在上升，而異鼠李素-3-O-葡萄糖苷含量則趨于平緩。蘋果酸-乳酸發(fā)酵結(jié)束后，實(shí)驗(yàn)組中兩種物質(zhì)的含量均高于對(duì)照組且具有顯著性差異。此外，兩種不同處理在發(fā)酵前后對(duì)于異鼠李糖類物質(zhì)總量的影響與山奈酚類物質(zhì)相似，總的來說是實(shí)驗(yàn)組含量高于對(duì)照組，但發(fā)酵前后兩組含量上的差距變化不大，發(fā)酵前實(shí)驗(yàn)組異鼠李素物質(zhì)總含量高出對(duì)照組約4.5 mg/L，發(fā)酵結(jié)束后實(shí)驗(yàn)組較對(duì)照組高出了約5.5 mg/L。

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果顯示，在整個(gè)赤霞珠干紅葡萄酒釀造過程中，冷浸漬處理的實(shí)驗(yàn)組樣品黃酮醇類物質(zhì)在發(fā)酵前和結(jié)束后含量都要高于沒有進(jìn)行冷浸漬處理的空白組，其中發(fā)酵前對(duì)照組樣品各大類物質(zhì)含量為槲皮素類15.0 mg/L，山奈酚類0.83 mg/L，楊梅酮類5.7 mg/L，異鼠李素類3.8 mg/L，總含量為25.3 mg/L，實(shí)驗(yàn)組樣品各大類物質(zhì)含量為槲皮素類46.3 mg/L，山奈酚類4.0 mg/L，楊梅酮類88.0 mg/L，異鼠李素類7.3 mg/L，總含量為145.6 mg/L，發(fā)酵前兩組樣品總量相差為120.3 mg/L。發(fā)酵結(jié)束后對(duì)照組樣品各大類物質(zhì)含量為槲皮素類74.4 mg/L，山奈酚類3.6mg/L，楊梅酮類154.4 mg/L，異鼠李素類15.6 mg/L，總含量為248.0 mg/L，實(shí)驗(yàn)組樣品各大類物質(zhì)含量為槲皮素類123.5 mg/L，山奈酚類5.1 mg/L，楊梅酮類205.1 mg/L，異鼠李素類21.1 mg/L，總含量為345.8 mg/L，發(fā)酵后兩組樣品總量相差為97.8 mg/L，因而總的來說發(fā)酵前冷浸漬對(duì)于葡萄酒中黃酮醇類物質(zhì)的浸出有著正面作用，這有利于穩(wěn)定并改善赤霞珠干紅葡萄酒的顏色，并且對(duì)于提升葡萄酒的保健作用也有一定的幫助。

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