黃 銳, 蒲清榮, 陳玉蘭, 趙 劍, 孟金程, 明俊男

（瀘州醫(yī)學(xué)院附屬中醫(yī)醫(yī)院, 四川 瀘州 646000）

正交設(shè)計(jì)法優(yōu)選三黃油的制備工藝

黃 銳, 蒲清榮*, 陳玉蘭, 趙 劍, 孟金程, 明俊男

（瀘州醫(yī)學(xué)院附屬中醫(yī)醫(yī)院, 四川 瀘州 646000）

目的 優(yōu)選三黃油的制備工藝。方法 在確定加油量的基礎(chǔ)上，以鹽酸小檗堿為指標(biāo)，對(duì)浸泡時(shí)間、藥材粗細(xì)、提取時(shí)間3個(gè)影響因素進(jìn)行考察，采用正交試驗(yàn)法優(yōu)選三黃油的制備工藝。結(jié)果 最佳制備工藝是:藥材為細(xì)粉， 加入 6 倍量的油， 浸泡 12 h， 提取 60 min。 結(jié)論 優(yōu)選的制備工藝簡(jiǎn)單可行， 穩(wěn)定可靠， 具可操作性和重復(fù)性。

三黃油;正交設(shè)計(jì);制備工藝;鹽酸小檗堿;高效液相色譜法

三黃油是瀘州醫(yī)學(xué)院附屬中醫(yī)醫(yī)院自制中藥醫(yī)療器械三黃油紗條的重要組成部分，含有黃連、黃柏、黃芩、梔子、麻油等成分。三黃油紗條可以對(duì)鼻腔黏膜損傷起保護(hù)作用，有利于所有需要鼻腔填塞的患者康復(fù)，臨床上主要應(yīng)用于鼻腔、 鼻竇治療行填塞和置放［1-3］。 有相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道通過(guò) GC法測(cè)定冰片的量或 HPCE法測(cè)定大黃素、 大黃酚的量作為指標(biāo)來(lái)控制三黃油的質(zhì)量［4-5］。 而黃連、 黃柏作為方中君藥，尚未見(jiàn)用鹽酸小檗堿的量作為指標(biāo)來(lái)控制三黃油的質(zhì)量。 課題組參考文獻(xiàn) ［6-9］， 以及多次預(yù)試驗(yàn)， 建立 HPLC法測(cè)定三黃油中黃連、 黃柏的主要成分鹽酸小檗堿的量，優(yōu)化了三黃油的制備工藝。

1 材料

LC-20AT高效液相色譜儀 （日本島津）;AUW120D電子天平 （日本島津）;JP全數(shù)字超聲波發(fā)生器 （武漢嘉鵬電子有限公司）;HH數(shù)顯電熱恒溫水浴箱 （江蘇國(guó)勝實(shí)驗(yàn)儀器廠）;101-2AB電熱鼓風(fēng)干燥箱 （杭州匯爾儀器服務(wù)有限公司）; 鹽酸小檗堿 （中國(guó)藥品生物制品檢定所， 批號(hào)為 110713-201212， 供定 量測(cè)定用）; 黃連、 黃柏、 黃 芩、梔子藥材 （購(gòu)自四川瀘州天植中藥飲片有限公司， 經(jīng)瀘州醫(yī)學(xué)院 藥 學(xué) 院 唐 燦 教 授 鑒 定 為 毛 茛 科 植 物 黃 連 Coptis chinensis Franch.的 干 燥 根 莖， 蕓 香 科 植 物 黃 皮 樹(shù) Phellodendron chinense Schneid 的 干 燥 樹(shù) 皮， 唇 形 科 植 物 黃 芩Scutellaria baicalensis Georgia的 干 燥 根， 茜 草 科 植 物 梔 子Cardenia jasminoides Ellis的干燥 成 熟 果 實(shí) 均 符 合 《 中 國(guó) 藥典》 2010 年版一部該藥材項(xiàng)下規(guī)定）， 麻油; 甲醇、 乙腈為色譜純，水為純化水，其他試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 鹽酸小檗堿的測(cè)定

2.1.1 色 譜 條 件 Inertsil ODS-SP C18柱 （ 250 mm ×4.6 mm， 5 μm）; 以 乙 腈-0.05 mol/L 磷 酸 二 氫 鉀 溶 液（50 ∶50） （每 100mL中加十二烷基硫酸鈉 0.4 g， 再以磷酸調(diào)節(jié) pH為 4.0） 流動(dòng)相， 二元高壓梯度， 體積流量 1 mL/min， 柱溫 40 ℃， 檢測(cè)波長(zhǎng) 345 nm， 進(jìn)樣量 10 μL， 理論板數(shù)按鹽酸小檗堿峰計(jì)算應(yīng)不低于 5 000［9-11］。

2.1.2 對(duì)照品溶液的制備 精密稱(chēng)取對(duì)照品 0.002 30 g，置 25 mL棕色量瓶中， 加 甲 醇溶 解 并 定容， 得 0.092 mg/mL的對(duì)照品貯備液。 精密吸取對(duì)照品貯備液 1 mL置于10 mL量瓶中， 甲醇定容至刻度， 搖勻即得對(duì)照品溶液。

2.1.3 供試品溶液的制備 取三黃油 20 mL， 加石油醚（60 ～90 ℃） 50 mL和 1%鹽酸溶液 50 mL振搖提取過(guò)夜，分取酸水液， 石油醚層再加 1%鹽酸溶液 50mL振搖提取 1次， 合并酸水液， 加入石油醚 20 mL萃取， 酸水層用濃氨試液調(diào)節(jié) pH至 9 ～10， 用三氯甲烷振搖提取 2 次 （40 mL、30mL） 合并三氯甲烷液， 揮干， 用 1%鹽酸甲醇溶液溶解并轉(zhuǎn)移至5 mL量瓶中， 加至刻度， 搖勻， 用0.45 μm微孔濾膜濾過(guò)，即得。

2.1.4 陰性對(duì)照溶液的制備 精密稱(chēng)取黃芩 6 g， 梔子 6 g， 加入 6 倍量麻油， 浸泡 12 h， 提取 60 min， 冷卻， 過(guò)濾， 得到不含黃連和黃柏的陰性對(duì)照， 按 “2.1.3” 項(xiàng)下方法， 制得陰性對(duì)照溶液， 并按 “2.1.1” 項(xiàng)下的色譜條件測(cè)定， 結(jié)果陰性對(duì)照無(wú)干擾。結(jié)果見(jiàn)圖1。

2.1.5 線性關(guān)系考察 取 “2.1.2” 項(xiàng)下對(duì)照品貯備液0.4、 0.8、 1.0、 2.0、 4.0 mL分別于 10 mL棕色量瓶中，加甲醇定容， 取10 μL注入液相色譜儀， 按照 “2.1.1” 項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行試驗(yàn)，記錄峰面積。以峰面積積分值Y為縱坐標(biāo)， 對(duì)照品的進(jìn)樣質(zhì)量濃度 X（mg/mL） 為橫坐標(biāo)，結(jié)果鹽酸小檗堿的回歸方程為 Y=4.251 ×107X-8.210 × 103， r2=0.999 7 （n=5）， 線性范圍為 0.003 68 ～0.036 8 mg/mL， 表明對(duì)照品的進(jìn)樣質(zhì)量濃度與峰面積積分值呈良好的線性關(guān)系。

2.1.6 精密度試驗(yàn) 取 “2.1.2” 項(xiàng)下對(duì)照品溶液 10 μL，按 “2.1.1” 項(xiàng)下色譜條件測(cè)定， 連續(xù)進(jìn)樣 6 次， 測(cè)得鹽酸小檗堿面積 RSD為 1.3%。 表明儀器精密度良好。

2.1.7 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一供試品溶液， 分別于0、 2、 4、6、 8、 12、 24 h 進(jìn)樣 10 μL注入液相色譜儀， 測(cè)定鹽酸小檗堿峰面積， 結(jié)果 RSD為 2.1%， 表明供試品溶液在 24 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.1.8 重 復(fù) 性試驗(yàn) 取 6 份同 一 批 號(hào) 的 三 黃 油， 按“2.1.3” 項(xiàng)下制備供試品溶液， 按 “2.1.1” 項(xiàng)下色譜條件測(cè)定鹽酸小檗堿峰面積， 結(jié)果 RSD為 1.7%， 表明試驗(yàn)重復(fù)性良好。

2.1.9 回收率試驗(yàn) 取 “2.3” 項(xiàng)下已知量的正交試驗(yàn) 4號(hào)的供試品溶液， 加入 “2.1.2” 項(xiàng)下鹽酸小檗堿對(duì)照品溶液 3 mL， 按 “2.1.1” 項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定， 計(jì)算加樣回收率。 結(jié)果平均回收率為 99.2%， RSD為 1.7%， 說(shuō)明該方法確實(shí)可行。 結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果

2.1.10 樣品測(cè) 定 精密量取各樣品溶 液 30 mL， 按“2.1.3” 項(xiàng)下方法制備供試品溶液， 按 “2.1.1” 項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定， 結(jié)果見(jiàn)圖1。

圖1 鹽酸小檗堿高效液相色譜圖

2.2 單因素考察三黃油的加油量 通過(guò)預(yù)試驗(yàn)， 以 1 ∶6、1 ∶8、 1 ∶10 3 種加油比例來(lái)對(duì)三黃油的加油量進(jìn)行優(yōu)化選擇。 稱(chēng)取單處方 （黃連 6 g、 黃柏 6 g、 黃芩 6 g、 梔子 6 g）藥材量加入 6、 8、 10 倍量麻油， 均浸泡 12 h， 加熱提取30min， 冷卻， 過(guò)濾， 取三黃油測(cè)定鹽酸小檗堿， 含有量分別為 0.009 24， 0.005 48， 0.003 63 mg/mL， 故選擇加油量1∶6作為三黃油的加油量。

2.3 三黃油制備工藝優(yōu)化

2.3.1 正交試驗(yàn) 根據(jù)上述試驗(yàn)結(jié)果， 加油量為 1 ∶6， 采用正交試驗(yàn)對(duì)三黃油制備工藝的各影響因素進(jìn)行考察。通過(guò)預(yù)試驗(yàn)，浸泡時(shí)間，藥材粗細(xì)，提取時(shí)間是影響其質(zhì)量的主要因素，在此基礎(chǔ)上，進(jìn)行正交試驗(yàn)，因素水平表見(jiàn)表 2， 試驗(yàn)安排見(jiàn)表 3， 方差分析見(jiàn)表 4。

表2 正交試驗(yàn)因素水平

由方差分析結(jié)果可知，B因素藥材粗細(xì)程度對(duì)于指標(biāo)具有顯著影響，經(jīng)直觀分析，其影響大小的順序?yàn)樗幉拇旨?xì)＞提取時(shí)間 ＞浸泡時(shí)間， 綜合考慮， 得優(yōu)化處方條件為A1B3C3， 即三黃油原藥材粉碎為細(xì)粉， 加入 6 倍量的麻油，浸泡 12 h， 提取 60 min。

表 3 L9（34） 正交試驗(yàn)

表4 綜合評(píng)分方差分析

2.3.2 工藝驗(yàn)證 精密稱(chēng)取 3 份三黃油處方中所含的藥材（黃連 6 g， 黃芩 6 g， 黃柏 6 g， 梔子 6 g）， 照上述確定的最佳工藝條件制成三黃油， 再按 “2.1.3” 項(xiàng)下方法制備供試品溶液， 按 “2.1.1” 項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定。 3 次試驗(yàn)的三黃油所含鹽酸小檗堿的含有量為 0.023 39、 0.023 42、0.022 89mg/mL， RSD為 1.3%， 表明該工藝穩(wěn)定可行。

3 討論

建立了三黃油中鹽酸小檗堿的定量測(cè)定方法，排除了麻油對(duì)有效成分檢測(cè)的影響，方法簡(jiǎn)便，操作可行，可作為工藝質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。有文獻(xiàn)報(bào)道無(wú)法用鹽酸小檗堿的量作為指標(biāo)來(lái)控制三黃油的質(zhì)量［4-5］， 而課題組的前期工作中， 也未能檢測(cè)出鹽酸小檗堿相應(yīng)的吸收峰，或者是重復(fù)性較差。經(jīng)過(guò)多次預(yù)試驗(yàn)，測(cè)定三黃油中鹽酸小檗堿的量，關(guān)鍵在于對(duì)其供試品溶液的處理，因而對(duì)相關(guān)工藝進(jìn)行改進(jìn)，如比較石油醚與正己烷的 “去油” 效果， “去油” 即在 HPLC檢測(cè)中為了檢測(cè)準(zhǔn)確，避免油脂類(lèi)物質(zhì)堵塞色譜柱，從三黃油中提取出有效成分，而不帶入麻油的過(guò)程;優(yōu)選調(diào)節(jié)pH之前和之后 “去油”; 氨水易揮發(fā)， 調(diào)節(jié) pH值后應(yīng)立即加入三氯甲烷進(jìn)行振搖提取。

油提取溫度微沸的溫度在 180 ℃以上， 因而黃芩中黃芩苷、梔子中梔子苷之類(lèi)的有效成分，采用薄層色譜以及HPLC法測(cè)定［12-13］， 樣品 沒(méi) 有 出 現(xiàn) 與 之 相 應(yīng) 的對(duì)照品的斑點(diǎn)以及吸收峰。 薄層鑒別［14］可以鑒別出黃芩素， 但 HPLC樣品前處理無(wú)法完全實(shí)現(xiàn)油與黃芩素分離，未能準(zhǔn)確測(cè)定其含有量。因而采用可以準(zhǔn)確定量的鹽酸小檗堿作為三黃油制備工藝的評(píng)價(jià)指標(biāo)。

綜上所述，通過(guò)對(duì)三黃油進(jìn)行了相關(guān)前處理，可以以鹽酸小檗堿相對(duì)含有量為指標(biāo)控制三黃油的制備工藝，方法準(zhǔn)確，重復(fù)性好，可用于準(zhǔn)確評(píng)價(jià)三黃油的質(zhì)量。

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10.3969/j.issn.1001-1528.2014.12.045

2013-10-25

黃 銳 （1986—）， 男， 碩士， 從事中藥新制劑研究。 Tel: （0830） 3162253， E-mail:365369747@qq.com

*通信作者: 蒲清榮 （1972 —） ， 男， 副主任中藥師， 從事中藥新制劑研究。 E-mail:huangrui6136@sina.cn